Summary
Detta protokoll beskriver en procedur för att studera andning i mitokondrier isolerade från skelettmuskulaturen. Denna metod anpassades från Scorrano
Abstract
Mitokondrierna är organeller som styr liv och död i cellen. De deltar i viktiga metaboliska reaktioner, syntetisera de flesta av ATP, och reglerar en rad signalering kaskader 2,3. Tidigare och nuvarande forskare har isolerat mitokondrier från råttor och möss vävnader som lever, hjärna och hjärta 4,5. Under senare år har många forskare fokuserat på att studera mitokondriernas funktion från skelettmuskulaturen.
Här beskriver vi en metod som vi har med framgång använts för isolering av mitokondrier från skelettmuskulatur 6. Vårt förfarande kräver att alla buffertar och reagens görs fräscha och behöver ungefär 250-500 mg skelettmuskulaturen. Vi studerade mitokondrierna isolerade från råtta och mus gastrocnemius och mellangärde, och råtta muskler extraocular. Mitokondriell Proteinhalten mäts med Bradford analysen. Det är viktigt att mitokondrie-prover förvaras iskall under beredning och att funktionella studier utförs inom en relativt kort tid (~ 1 tim). Mitokondriell andning mäts med polarography med en Clark-typ elektrod (Oxygraph systemet) vid 37 ° C 7. Kalibrering av syre elektrod är ett viktigt steg i detta protokoll och det måste utföras dagligen. Isolerade mitokondrier (150 mikrogram) tillsätts 0,5 ml av experimentella buffert (EB). Statligt 2 andning börjar med tillägg av glutamat (5mm) och malat (2,5 mm). Då är adenosindifosfat (ADP) (150 M) läggas att starta tillstånd 3. Oligomycinkänslig (1 M), ett ATPas syntas blockerare, används för att uppskatta status 4. Slutligen karbonyl cyanid p-[trifluoromethoxy]-fenyl-hydrazon (FCCP, 0,2 M) läggs till measurestate 5, eller icke-kopplade andning 6. Den respiratoriska kontrollen (RCR), förhållandet mellan staten 3 till status 4, beräknas efter varje försök. En RCR ≥ 4 anses som bevis på en fungerande mitokondrier beredning.
Sammanfattningsvis presenterar vi en metod för isolering av livskraftiga mitokondrier från muskler som kan användas i biokemiska (t.ex. enzymaktivitet, immunodetection, proteomik) och funktionella studier (mitokondriell andning).
Protocol
1. Beredning av buffertar
- Slå på centrifugen 5804R och inställd på 4 ° C. Sätt på Isotemp 3006D vattenbad och satt till 37 ° C.
- Förbered följande lösningar innan muskel isolering:
- PBS: Lös fosfatbuffrad saltlösning (PBS) tabletter i destillerat vatten (5 tabletter / liter). Blanda väl.
- PBS plus 10 mM EDTA: För att bereda en 100 ml, tillsätt 2 ml 500 mM EDTA till 98 ml PBS.
- 8X Mitokondrier buffert: 10,28 g sackaros till en slutlig koncentration av 0,6 M, 400 mg fri-fettsyror bovint serumalbumin (BSA) för en slutlig koncentration av 0,8%, 2,08 g HEPES för en slutlig koncentration av 160 mm, pH till 7,4 och QS till 50 ml med destillerat vatten.
- Isolering Buffer 1 (IB1): Tillsätt 200 ìl av 500 mM EDTA för en slutlig koncentration av 10 mm, 0,392 g D-mannitol för en slutlig koncentration av 215 mm, 1,25 ml 8X mitokondrier buffert, pH till 7,4 och QS till 10 ml med destillerat vatten.
- Isolering Buffer 2 (IB2): Lägg 60 ìl av 500 mm EGTA för en slutlig koncentration av 3 mm, 0,392 g D-mannitol för en slutlig koncentration av 215 mm, 1,25 ml 8X mitokondrier buffert, pH till 7,4 och QS till 10 ml med destillerat vatten.
- Experimentell Buffer (EB): Tillsätt 100 l 500 mm MgCl 2 för en slutlig koncentration om 5 mm, 0,392 g D-mannitol för en slutlig koncentration av 215 mm, 25 l på 2,5 mm KH 2 PO 4 för en slutlig koncentration av 6,25 mikroM, 2 l på 100 mm EGTA för en slutlig koncentration av 20 mikroM, 1,25 ml av mitokondrie-buffert, pH till 7,4 och QS till 10 ml med destillerat vatten.
2. Muscle Isolering
- I en ishink, sätta tre 10 ml bägare, Potter-Elvehjem slipmaskiner vävnad och alla andra nödvändiga instrument / tillbehör på is. Allt måste stanna iskall under hela försöksperioden.
- Placera IB1 och IB2 i ishink och EB i varmt vattenbad när du är klar.
- I de tre 10 ml bägare, bör följande lösningar läggas till:
- Bägare 1: 10 ml PBS
- Bägare 2: 10 ml PBS / EDTA
- Bägare 3: 3 ml IB1
- Döda en råtta humant som godkänts av din lokala Institutional Animal Care och användning kommittén.
- Snabbt isolera 250-500 mg skelettmuskulaturen, skölj i Bägare 1, sedan överföra till Beaker 2.
3. Homogenisering / Mitokondriell Isolation
- Överföring muskler till Bägare 3 och fint finhacka muskeln med en sax.
- Överför lösningen till Potter-Elvehjem homogeniseringsblandare. Homogenisera muskeln med hjälp av en motordriven stöt (en borr tryck kommer att göra jobbet) 10 gånger håller röret i isen hela tiden.
- Överföring homogenatet i förväg kylt 2 ml mikrocentrifugrör och centrifugera vid 700 g under 10 minuter vid 4 ° C.
- Överför supernatanten till ett nytt pre-kylda mikrocentrifugrör. Släng pellets.
- Centrifugera supernatanten vid 10.500 g under 10 minuter vid 4 ° C.
- Överför supernatanten till ett nytt pre-kylda mikrocentrifugrör och etikett SN1 (supernatanten nummer 1) och muskler typ.
- Återsuspendera pelleten i 500 ìl IB2.
- Centrifugera vid 10.500 g under 10 minuter vid 4 ° C.
- Överför supernatanten till ett nytt pre-kylda mikrocentrifugrör och etikett SN2 (supernatanten nummer 2) och muskler typ.
- Häng sista mitokondriella pelleten i 100 ìl IB2.
- Re-spin sista mitokondriella suspension i minifuge under några sekunder. Om det finns en pellets, överför supernatanten till ett nytt pre-kylda mikrocentrifugrör och kasta pelleten.
- Bestäm proteinkoncentration med Bradford analys 8.
4. Elektrod Kalibrering
OBS: Komplett elektrod kalibrering under mitokondriella isolering.
- Tillsätt 100 ml destillerat vatten till 250 ml kolv. Rör kraftigt i 20 minuter för att balansera vattnet med atmosfäriska gas.
- Tillsätt några droppar av 50% KCl till Oxygraph elektroden.
- Placera en liten bit blå Rizla rullande papper ovanpå elektroden.
- Lägg en bit PTFE membran ovanpå den rullande papper.
- Applicera den inre ringen med ringen applikatorn och sedan placera den yttre ringen i elektroden spåret.
- Anslut elektroderna och montera resten av utrustningen: större plastring bas, mitokondriella kammare och vattenslangar.
- Slå på Oxygraph lådor och börja Oxygraph programvara.
- Tillsätt jämvikt vatten mitokondriella kammare.
- Lägg omrörare och slå på en hastighet av 60.
- Börja ett nytt experiment.
- Klicka på kalibrera och sedan flytande kalibrering för ruta 1. Ändra temperaturen till 37 ° C och klicka "OK" två gånger.
- När "Override" ändras till "OK" på den och öppna tanken kvävgas.
- Placera spetsen ansluten till kväve tanken in i kammare och etablera noll syre. Cslicka "OK" när den växlar från "Override".
- Aspirera vatten och tillsätt 500 ìl av EB buffert till mitokondrie kammare.
- Tätningskammaren med kolven.
- Om du använder flera lådor, upprepa steg 11-15 för kalibrering av ruta 2.
5. Mitokondriell respiration
- Starta ett nytt experiment, låt den gå i ungefär 1 minut för att stabilisera signalen.
- Lägg nödvändiga volymen av den mitokondriella suspension (steg 3,11) för 150 mikrogram i varje kammare, markera händelsen och låt den gå i 1 minut.
- Tillsätt 10 l varmt 250 mM/125 mM glutamat / malat för en slutlig koncentration av 5 mM/2.5 mM. Mark och låt gå under 1 minut. Detta definieras som staten 2.
- Tillsätt 7,5 l på 10 mm ADP för en slutlig koncentration av 150 mikroM, Markus, och låt köra i 30 sekunder. Detta definieras som staten 3.
- Lägg till ytterligare 7,5 l med 10 mm ADP, Markus och låt pågå under 1,5 minuter.
- Tillsätt 0,5 l kallt 10 mM oligomycinkänslig för en slutlig koncentration av 1 mikrometer, Markus, och låt köra i 3 minuter. Detta definieras som stat 4.
- Tillsätt 1 l kallt 0,1 mM FCCP för en slutlig koncentration av 0,2 mikroM, Markus, och låt köra i 3 minuter. Detta definieras som statligt 5.
- När du är klar, avsluta experiment och spara.
- Förvärva andningsfrekvens med Oxygraph programvara.
- Skriv normalisering faktor: Om du lägger 150 mikrogram av mitokondrie-protein, kommer normalisering faktor 0,15.
- Beräkna normaliserade andningsfrekvens för de olika andning stater.
- Beräkna Respiratory Kontroll (RCR) genom att dividera staten 3 av statliga 4.
6. Representativa resultat:
Figur 1. Visar en representant spåra syreförbrukning i skelettmuskler mitokondrier. När elektroden signalen har stabiliserats, är mitokondrierna prov läggs till i Oxygraph kammaren. Statligt 2 andning börjar med tillägg av glutamat och malat. Tillsats av ADP ökar syreupptagning, definiera tillstånd 3 andning. ATP-syntas är blockerad genom tillsats av oligomycinkänslig att få statliga 4 andning. Slutligen är FCCP läggas att koppla loss mitokondrie andning (State 5). Tabell 1 visar representativa kurser syreförbrukning för stater 2, 3, 4 och 5. Den respiratoriska kontrollen (RCR) beräknas för varje experiment. RCR ≥ 4 anses som bevis på en fungerande mitokondrier beredning.
| Staterna | Normaliserad priser |
| Staten 2 | 34,74 |
| State 3 | 153,40 |
| Statligt 4 | 16,49 |
| State 5 | 143,70 |
| RCR | 9,30 |
Tabell 1. Mitokondriell andningsfrekvens. Representativeoxygen konsumtion Priser från skelettmuskulatur mitokondrier. Värdena är normaliserade till mängden mitokondrier läggs till kammaren. Den respiratoriska kontrollen (RCR) bestäms genom att dividera tillstånd 3 av statliga 4. En RCR ≥ 4 representerar en fungerande mitokondrier beredning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterar ett protokoll för att isolera livskraftiga mitokondrier från skelettmuskulaturen. Om avkastningen är ett problem, kan protokollet ändras genom inkubering av isolerade muskler i 5 ml PBS/10mM EDTA/0.01% trypsin i 30 minuter i is. För att garantera komplett muskel uppslutning med trypsin, måste muskeln vara helt malet. Efter 30-minuters inkubation, måste PBS/10mM EDTA/0.01% trypsin lösningen vara helt ersättas med 3 ml av isolering buffert 1 (IB1). Dessutom kan användning av trypsin störa vissa mitokondrie-substrat under andning protokollet. Alla de substrat som används i detta protokoll resultera i bra mitokondriella förberedelser vid användning av trypsin.
För musen muskler, är det bäst att kombinera gastrocnemius musklerna från båda benen, eller använda hela membranet. För råtta skelettmuskulatur, är en liten del av gastrocnemius eller mellangärde tillräckligt. Överdriven muskelmassa kan komplicera den isolering förfarande och ger lägre avkastning. För isolering av mycket små muskler som extraocular muskler, är det nödvändigt att poolen muskler från fler än 1 djur att få de nödvändiga muskelmassa.
Detta protokoll avser två olika supernatanterna: SN1 och SN2. Dessa supernatanterna är resultatet av differentierade centrifugering och innehåller icke-mitokondriella proteiner. Proteiner från dessa supernatanterna och från sista mitokondrie pellets kan användas i Western blotting för att kontrollera renhet mitokondriella beredning. Western blotting med hjälp av mitokondrie-och cytoplasmiska antikroppar bekräfta renheten i din mitokondrie-förberedelser i finalen pellets.
Rengöring av mitokondriella andning utrustning är avgörande för ett lyckat experiment. Efter varje experiment måste kamrarna rengöras grundligt så här: Skölj kammare fem gånger med destillerat vatten, skölj en gång med 70% etanol för att ta bort etanol-lösligt substrat, skölj med en mättad lösning av PBS / BSA i ca 5 minuter, slutligen, Skölj kammare 5 gånger med destillerat vatten. Clark-typ elektroder skall rengöras ordentligt efter varje användning genom att skölja flera gånger med destillerat vatten och mjukt skrubbas med en tandborste. Sedan måste de vara helt torr med lånade utan våtservetter och lagras i en exsickator. En gång i veckan bör elektroderna ska poleras med hjälp av satsen Oxygraph polering.
Mitokondriell substrat förberedda som stamlösningar, alikvoteras och förvaras vid -20 ° C. Vi rekommenderar inte återanvändning av substrat. Vår erfarenhet är att de flesta av substrat är stabila vid -20 ° C i flera månader, med undantag för oligomycinkänslig som måste bytas var 2 månader eller så. Läs alltid tillverkarens specifikationer för mer information.
Slutligen kan detta protokoll också användas för att isolera mitokondrierna från hjärtat. Liksom för andra muskler, kommer storleken på djur (råtta vs mus) avgöra vilken del av orgeln är nödvändig för att få tillräckligt mitokondrier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Eye Institute (R01 EY12998) till FH Andrade.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 95% CO2 / 5% O2 mix | Local Gas Supplier | ||
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Blue Rizla Paper | Hansatech | 890101 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | ||
| Compressed nitrogen | Local Gas Supplier | ||
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | M9647 | |
| Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio-Rad | 161-0728 | |
| Free fatty acid bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G5889 | |
| HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Isotemp 3006D | Fisher Scientific | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Male Sprague Dawley Rats | Harlan Laboratories | 300-500g | |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M9138 | |
| Minifuge | ISC Bioexpress | C1301P | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxygen electrode disc | Hansatech | S1 | |
| Oxygraph | Hansatech | ||
| Oxygraph Plus V1.01 Software | Hansatech | ||
| pH-meter | Mettler Toledo | 1225506149 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P8416 | |
| Potter-Elvehjem homogenizers | Fisher Scientific | 08-414-14A | |
| PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane | Hansatech | S4 | |
| SKIL 3320 drill press | Hardware store | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 |
References
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Duchen, M. R. Roles of mitochondria in health and disease. Diabetes. 53, Suppl 1. S96-S102 (2004).
- Johannsen, D. L., Ravussin, E. The role of mitochondria in health and disease. Curr Opin Pharmacol. , (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
- Gamboa, J. L., Andrade, F. H. Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).
- Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
