Summary
פרוטוקול זה מתאר הליך ללמוד את הנשמה של המיטוכונדריה מבודד שרירי השלד. שיטה זו הותאמה מ Scorrano
Abstract
המיטוכונדריה הם אברונים שליטה על החיים והמוות של התא. הם משתתפים תגובות מטבוליות מפתח, לסנתז ביותר של ה-ATP, ולהסדיר מספר איתות מפלי 2,3. חוקרים בעבר ובהווה יש לבודד מרקמות המיטוכונדריה חולדות ועכברים כגון מוח, כבד, לב 4,5. בשנים האחרונות, חוקרים רבים התמקדו לומד לתפקד המיטוכונדריה של שרירי השלד.
כאן אנו מתארים שיטה השתמשנו בהצלחה הבידוד של המיטוכונדריה מן שרירי השלד 6. ההליך שלנו דורש שכל מאגרים ו ריאגנטים עשויים טריים צורך כ 250-500 מ"ג של שרירי השלד. למדנו המיטוכונדריה מבודד הגסטרוקנמיוס חולדה ועכבר הסרעפת, ואת שרירי extraocular חולדה. ריכוז חלבון מיטוכונדריאלי נמדדת עם assay ברדפורד. חשוב דגימות המיטוכונדריה להישמר קרים כקרח במהלך ההכנה כי מחקרים פונקציונלי להתבצע בתוך זמן קצר יחסית (~ 1 שעות). הנשימה מיטוכונדריאלי נמדד polarography עם אלקטרודה מסוג קלארק (מערכת Oxygraph) בשעה 37 ° C 7. כיול אלקטרודת חמצן הוא צעד מפתח פרוטוקול זה והיא חייבת להתבצע מדי יום. המיטוכונדריה מבודד (150 מיקרוגרם) מתווספים 0.5 מ"ל של חיץ ניסיוני (EB). מדינת 2 הנשימה מתחיל עם תוספת של גלוטמט (5mm) ו Malate (2.5 מ"מ). ואז, diphosphate אדנוזין (ADP) (150 מיקרומטר) מתווסף להתחיל המדינה 3. Oligomycin (1 מיקרומטר), חוסם synthase ATPase, משמש אומדן המדינה 4. לבסוף, קרבוניל ציאניד p-[trifluoromethoxy]-פניל-hydrazone (FCCP, 0.2 מיקרומטר) מתווסף measurestate 5, או זוגיים הנשימה 6. יחס השליטה בדרכי הנשימה (RCR), היחס של המדינה 3 למצב 4, מחושב לאחר כל ניסוי. RCR ≥ 4 נחשב כהוכחה הכנה המיטוכונדריה קיימא.
לסיכום, אנו מציגים שיטה הבידוד של המיטוכונדריה קיימא של שרירי השלד כי ניתן להשתמש ביוכימית (למשל, פעילות האנזים, immunodetection, proteomics) מחקרים תפקודית (נשימה המיטוכונדריה).
Protocol
1. הכנת Buffers
- הפעל 5804R צנטריפוגות ולהגדיר עד 4 ° C. הפעל אמבט מים Isotemp להגדיר 3006D ו 37 ° C.
- הכן את הפתרונות הבאים לפני בידוד שרירים:
- PBS: ממיסים שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) טבליות במים מזוקקים (5 טבליות / ליטר). מערבבים היטב.
- PBS פלוס 10 mM EDTA: כדי להכין פתרון 100 מ"ל, להוסיף 2 מ"ל של 500 mM EDTA עד 98 מ"ל של PBS.
- חיץ המיטוכונדריה 8X: 10.28 גרם של סוכרוז לריכוז סופי של 0.6 מ ', 400 מ"ג של חומצת שומן חופשית שור בסרום אלבומין (BSA) ריכוז סופי של 0.8%, 2.08 גרם של HEPES ריכוז סופי של 160 mM, pH עד 7.4 ו QS ל 50 מ"ל עם מים מזוקקים.
- מאגר בידוד 1 (IB1): הוסף 200 μl של 500 mM EDTA בריכוז סופי של 10 מ"מ, 0.392 גרם של D-mannitol ריכוז סופי של 215 מ"מ, 1.25 מ"ל של 8X pH המיטוכונדריה חיץ, כדי 7.4 ו QS עד 10 מ"ל עם מים מזוקקים.
- מאגר בידוד 2 (IB2): הוסף 60 μl של EGTA 500 מ"מ ריכוז סופי של 3 מ"מ, 0.392 גרם של D-mannitol ריכוז סופי של 215 מ"מ, 1.25 מ"ל של 8X pH המיטוכונדריה חיץ, כדי 7.4 ו QS עד 10 מ"ל עם מים מזוקקים.
- מאגר ניסיוני (EB): הוסף 100 μl של 500 mM MgCl 2 בריכוז סופי של 5 מ"מ, 0.392 גרם של D-mannitol ריכוז סופי של 215 מ"מ, 25 מ"מ μl 2.5 KH 2 PO 4 בריכוז סופי של 6.25 מיקרומטר, 2 μl של 100 מ"מ EGTA ריכוז סופי של 20 מיקרומטר, 1.25 מ"ל של חיץ המיטוכונדריה, pH 7.4 ל ו QS ל 10 מ"ל עם מים מזוקקים.
2. בידוד שריר
- בתוך דלי קרח, להכניס שלוש כוסות 10 מ"ל, פוטר, Elvehjem ומטחנות רקמות כל צורך במכשירים אחרים / אספקה על הקרח. כל דבר חייב להישאר קר כקרח במשך הניסוי.
- המקום IB1 ו IB2 בדלי קרח EB באמבט מים חמים בסיום.
- בשלוש כוסות 10 מ"ל, פתרונות הבא יש להוסיף:
- Beaker 1: 10 מ"ל של PBS
- Beaker 2: 10 מ"ל PBS / EDTA
- Beaker 3: 3 מ"ל של IB1
- תהרגו עכברוש אנושי כפי שאושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים המקומי ועדת שימוש.
- לבודד במהירות 250-500 מ"ג של שרירי השלד, לשטוף בכוס 1, ולאחר מכן להעביר Beaker 2.
3. Homogenization / בידוד מיטוכונדריאלי
- העברת שריר Beaker 3 דק לקצץ את השריר עם מספריים.
- העברת הפתרון homogenizer פוטר-Elvehjem. Homogenize השריר באמצעות העלי ממונע (מקדחה יעשה את העבודה) 10 פעמים לשמור את הצינורית קרח בכל עת.
- העברת homogenate מראש צונן צינורות microcentrifuge 2 מ"ל ו - 700 גרם ב צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 4 ° C.
- העברת supernatant לצינור מראש צונן חדש microcentrifuge. בטל גלולה.
- צנטריפוגה supernatant ב g 10,500 במשך 10 דקות ב 4 ° C.
- העברת supernatant לצינור מראש צונן חדש microcentrifuge ו SN1 תווית (מספר supernatant 1) וסוג השריר.
- Re-להשעות גלולה ב 500 μl של IB2.
- צנטריפוגה ב g 10,500 במשך 10 דקות ב 4 ° C.
- העברת supernatant לצינור מראש צונן חדש microcentrifuge ו SN2 תווית (מספר supernatant 2) וסוג השריר.
- להשעות הסופי המיטוכונדריה גלולה ב 100 μl של IB2.
- Re-ספין ההשעיה המיטוכונדריה הסופי minifuge במשך כמה שניות. אם יש גלולה, העברת supernatant לצינור מראש צונן חדש microcentrifuge וזורקים את הכדור.
- קביעת ריכוז חלבון באמצעות assay ברדפורד 8.
4. אלקטרודה כיול
הערה: כיול האלקטרודה השלם במהלך בידוד המיטוכונדריה.
- מוסיפים 100 מ"ל מים מזוקקים כדי בקבוק 250 מ"ל. מערבבים נמרצות במשך 20 דקות כדי לאזן את המים עם הגז האטמוספרי.
- הוסף כמה טיפות של 50% KCl אל האלקטרודה Oxygraph.
- מניחים פיסת נייר קטנה ה"ריזלה כחול מתגלגל על גבי האלקטרודה.
- מניחים פיסת PTFE קרום על גבי הנייר מתגלגל.
- החל את הטבעת הפנימית באמצעות המוליך הטבעת ולאחר מכן למקם את הטבעת החיצונית של החריץ אלקטרודה.
- חיבור אלקטרודות ולהרכיב את שאר הציוד: בסיס טבעת פלסטיק גדולה, חדר המיטוכונדריה, וצינורות מים.
- הפעל את תיבות Oxygraph ולהתחיל תוכנה Oxygraph.
- מוסיפים את המים equilibrated לתא המיטוכונדריה.
- הוסף ומערבבים בר להדליק למהירות של 60.
- בגין ניסוי חדש.
- לחץ על כיול ולאחר מכן כיול שלב נוזלי תיבה 1. שינוי הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס ולחץ על "אישור" פעמיים.
- כאשר "עקיפת" שינויים "אישור" לחץ עליו לפתוח את מיכל הדלק חנקן.
- המקום קצה מחוברלמיכל חנקן לתוך תא ולהקים חמצן אפס. לחץ על "אישור" כאשר הוא עובר מן "עקיפת".
- לשאוב מים ולהוסיף 500 μl של חיץ EB לתאי המיטוכונדריה.
- חותם קאמרית עם הבוכנה.
- אם אתה משתמש תיבות מרובים, חזור על שלבים 11-15 עבור כיול של תיבה 2.
5. מיטוכונדריאלי נשימה
- התחל ניסוי חדש, לתת לו לרוץ במשך דקה 1 על מנת לייצב האות.
- הוסף הנפח של ההשעיה המיטוכונדריה (שלב 3.11) עבור 150 מיקרוגרם בתא אחד, אירוע לציון, ולתת לו לרוץ במשך דקה 1.
- הוסף 10 μl של חם 250 mM/125 mM גלוטמט / Malate ריכוז סופי של mM mM/2.5 5. מארק בוא לרוץ במשך דקה 1. זו מוגדרת כמדינה 2.
- הוספת 7.5 μl של 10 mM ADP ריכוז סופי של 150 מיקרומטר, לסמן, ולתת לרוץ במשך 30 שניות. זו מוגדרת כמדינה 3.
- הוסף μl 7.5 מ"מ 10 ADP, לסמן, ולתת לרוץ 1.5 דקות.
- הוספת 0.5 μl של oligomycin 10 קר mM ריכוז סופי של 1 מיקרומטר, לסמן, ולתת לרוץ במשך 3 דקות. זו מוגדרת כמדינה 4.
- הוסף 1 μl של קור 0.1 מ"מ FCCP ריכוז סופי של 0.2 מיקרומטר, לסמן, ולתת לרוץ במשך 3 דקות. זו מוגדרת כמדינה 5.
- בסיום, בסוף הניסוי ולשמור.
- רוכשת את שיעורי הנשימה באמצעות תוכנת Oxygraph.
- הזן גורם נורמליזציה: אם הוספת 150 מיקרוגרם של חלבון המיטוכונדריה, הגורם נורמליזציה יהיה 0.15.
- חישוב שיעור הנשימה מנורמל עבור מדינות נשימה שונות.
- חישוב יחס בקרת הנשימה (RCR) על ידי חלוקת המדינה 3 על ידי המדינה 4.
6. נציג תוצאות:
באיור 1. מציגה נציג מעקב אחר צריכת החמצן של שריר השלד המיטוכונדריה. לאחר האות אלקטרודה הוא התייצב, המדגם המיטוכונדריה מתווסף חדר Oxygraph. מדינת 2 הנשימה מתחיל עם תוספת של גלוטמט Malate. תוספת של ADP עולה צריכת החמצן, הגדרת 3 הנשימה המדינה. ה-ATP synthase חסומה על ידי תוספת של oligomycin להשיג 4 הנשימה המדינה. לבסוף, FCCP מתווסף לנתק הנשימה במיטוכונדריה (מצב 5). טבלה 1 מראה חמצן נציג שיעורי הצריכה של 2 מדינות, 3, 4 ו - 5. יחס השליטה בדרכי הנשימה (RCR) מחושב עבור כל ניסוי. RCR ≥ 4 נחשב כהוכחה הכנה המיטוכונדריה קיימא.
ארצות | מנורמל חליפין |
המדינה 2 | 34.74 |
מדינת 3 | 153.40 |
המדינה 4 | 16.49 |
המדינה 5 | 143.70 |
RCR | 9.30 |
טבלה 1. הנשימה שיעורי מיטוכונדריאלי. Representativeoxygen שיעורי הצריכה של שרירי השלד המיטוכונדריה. ערכים הם מנורמל לכמות של המיטוכונדריה הוסיף לחדר. יחס השליטה בדרכי הנשימה (RCR) נקבעת על ידי חלוקת המדינה 3 על ידי המדינה 4. RCR ≥ 4 מהווה הכנה המיטוכונדריה קיימא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מציגים פרוטוקול לבודד המיטוכונדריה קיימא של שרירי השלד. אם התשואה היא בעיה, פרוטוקול ניתן לשנות על ידי דוגרים על שריר בודד 5 מ"ל של טריפסין EDTA/0.01% PBS/10mM במשך 30 דקות בקרח. כדי להבטיח עיכול שרירים להשלים עם טריפסין, השריר צריך להיות טחון לגמרי. לאחר דגירה של 30 דקות, הפתרון PBS/10mM טריפסין EDTA/0.01% חייב להיות מוחלף לחלוטין עם 3 מ"ל של חיץ בידוד 1 (IB1). בנוסף, השימוש טריפסין מסוימים עלולים להפריע מצעים המיטוכונדריה במהלך הפרוטוקול הנשימה. כל מצעים בשימוש תוצאה זו פרוטוקול בהכנות המיטוכונדריה טוב בעת שימוש טריפסין.
עבור שרירי שלד העכבר, עדיף לשלב את השרירים הגסטרוקנמיוס של שתי הרגליים, או להשתמש הסרעפת כולו. עבור שרירי השלד חולדה, קטע קטן של הגסטרוקנמיוס או הסרעפת מספיק. מסת שריר מופרזת עלולה לסבך את ההליך בידוד תוצאה של התשואות נמוך יותר. במשך הבידוד של השרירים קטן מאוד כגון שרירי extraocular, יש צורך בשרירים בריכה מבעל חיים יותר מ 1 כדי לקבל את מסת השריר הצורך.
פרוטוקול זה מתייחס לשני supernatants שונים: SN1 ו SN2. Supernatants אלה הם תוצאה של צנטריפוגה ההפרש ומכילים ללא המיטוכונדריה חלבונים. חלבונים מן supernatants אלה מן הסופי המיטוכונדריה גלולה ניתן להשתמש כתמים המערבי כדי לוודא את טוהר הכנת המיטוכונדריה. כתמים המערבי באמצעות נוגדנים המיטוכונדריה ו cytoplasmic לאשר את טוהר הכנה המיטוכונדריה שלך את הכדור האחרון.
ניקוי ציוד הנשימה המיטוכונדריאלי הוא קריטי עבור ניסוי מוצלח. לאחר כל ניסוי, חדרי יש לנקות ביסודיות כדלקמן: לשטוף חדרי חמש פעמים עם מים מזוקקים, יש לשטוף מיד עם אתנול 70% אתנול להסיר מסיסים מצעים, לשטוף עם תמיסה רוויה של PBS / BSA כ -5 דקות, סוף סוף, לשטוף לתאי 5 פעמים עם מים מזוקקים. קלארק מסוג אלקטרודות יש לנקות היטב לאחר כל שימוש על ידי שטיפה מספר פעמים עם מים מזוקקים ושפשף בעדינות עם מברשת שיניים. לאחר מכן, הם חייבים להיות יבשים לחלוטין עם הלווה ללא מגבונים ומאוחסנים ייבוש. פעם בשבוע, האלקטרודות צריך להיות מלוטש באמצעות ערכת ליטוש Oxygraph.
מיטוכונדריאלי מצעים מוכנים כמו פתרונות המניות, aliquoted ומאוחסנים ב -20 o C. אנחנו לא ממליצים על שימוש חוזר של מצעים. מניסיוננו, רוב מצעים יציבים ב -20 מעלות צלסיוס למשך מספר חודשים, למעט oligomycin כי חייב להיות מוחלף כל 2 חודשים בערך. תמיד מתייחסים למפרטי היצרן לקבלת פרטים נוספים.
לבסוף, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לבודד המיטוכונדריה מהלב. באשר שרירים אחרים, גודל של החיה (עכברוש מול העכבר) יקבע איזה חלק של האיבר הוא הכרחי כדי להשיג המיטוכונדריה מספקת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מן העין לאומי (R01 EY12998) כדי FH אנדרדה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 95% CO2 / 5% O2 mix | Local Gas Supplier | ||
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Blue Rizla Paper | Hansatech | 890101 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | ||
| Compressed nitrogen | Local Gas Supplier | ||
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | M9647 | |
| Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio-Rad | 161-0728 | |
| Free fatty acid bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G5889 | |
| HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Isotemp 3006D | Fisher Scientific | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Male Sprague Dawley Rats | Harlan Laboratories | 300-500g | |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M9138 | |
| Minifuge | ISC Bioexpress | C1301P | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxygen electrode disc | Hansatech | S1 | |
| Oxygraph | Hansatech | ||
| Oxygraph Plus V1.01 Software | Hansatech | ||
| pH-meter | Mettler Toledo | 1225506149 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P8416 | |
| Potter-Elvehjem homogenizers | Fisher Scientific | 08-414-14A | |
| PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane | Hansatech | S4 | |
| SKIL 3320 drill press | Hardware store | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 |
References
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Duchen, M. R. Roles of mitochondria in health and disease. Diabetes. 53, Suppl 1. S96-S102 (2004).
- Johannsen, D. L., Ravussin, E. The role of mitochondria in health and disease. Curr Opin Pharmacol. , (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
- Gamboa, J. L., Andrade, F. H. Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).
- Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
