सेल प्रकार के विशेष प्रोटीन स्थानीयकरण और nucleocytoplasmic चक्कर के लक्षण वर्णन के लिए एक लचीला और कुशल पद्धति में वर्णित है. यह heterokaryon दृष्टिकोण सेल संलयन के बाद छवि प्रोटीन localizations fluorescently लेबल संलयन प्रोटीन का उपयोग करता है. प्रोटोकॉल स्थिर राज्य localizations या अधिक गतिशील रहते सेल इमेजिंग के आधार पर निर्धारण के लिए उत्तरदायी है.
प्रोटीन का एक महत्वपूर्ण संख्या subcellular तस्करी या चक्कर nucleocytolasmic द्वारा विनियमित रहे हैं. ये प्रोटीन आरएनए और प्रोटीन के परमाणु आयात / निर्यात, transcriptional विनियमन, और apoptosis सहित सेलुलर कार्यों की एक विविध सरणी प्रदर्शित करते हैं. दिलचस्प है, कोशिका विभाजन, भेदभाव और परिवर्तन सहित प्रमुख सेलुलर reorganizations, अक्सर ऐसी गतिविधियों 3,4,8,10 शामिल है . इन प्रोटीन और उनके संबंधित नियामक तंत्र के विस्तृत अध्ययन इन स्थानीयकरण मायावी जा सकता है परिवर्तन के लिए, उत्तेजना, और खुद को काफी गतिशील और मुश्किल ट्रैक किया जा सकता है आंदोलनों के रूप में चुनौतीपूर्ण हो सकता है. सेलुलर अध्ययन शामिल oncogenesis, उदाहरण के लिए, समझ रास्ते और प्रोटीन गतिविधियों है कि सामान्य प्राथमिक कोशिकाओं और बदल 6,7,11,12 कोशिकाओं के बीच अलग से लाभ के लिए जारी है. कई प्रोटीन के रूप में परिवर्तन के दौरान या परिवर्तन का एक परिणाम के के रूप में बदल स्थानीयकरण, कुशलता इन प्रोटीनों विशेषताएँ तरीके और रास्ते में जो वे oncogenesis और दवा लक्ष्यीकरण के लिए खुले नए क्षेत्रों की समझ में सुधार करने के लिए खड़े भाग लेने दिखा.
यहाँ हम प्रोटीन की तस्करी के विश्लेषण के लिए एक तरीका मौजूद है और प्राथमिक और बदल स्तनधारी कोशिकाओं के बीच चक्कर गतिविधि. इस विधि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ heterokaryon fusions की पीढ़ी के लिए एक लचीला प्रोटोकॉल है कि स्थिर राज्य या गतिशील प्रोटीन localizations का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदान करने को जोड़ती है. जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, दो अलग सेल प्रकार transiently प्लाज्मिड constructs एक fluoroprotein हित के जीन से जुड़ी जीन के असर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं. अभिव्यक्ति के बाद, कोशिकाओं polyethylene glycol का उपयोग में जुड़े हुए हैं, और प्रोटीन localizations तो तरीकों की एक किस्म का उपयोग imaged किया जा सकता है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक मौलिक दृष्टिकोण है जो विशेष तकनीक जोड़ा जा सकता है.
heterokaryon प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत सेल स्थानीयकरण प्रकार विशिष्ट रूप में अच्छी तरह के रूप में nucleocytoplasmic चक्कर गतिविधि व्यवहार के लक्षण वर्णन के लिए एक कुशल और आसानी से व्याख्या तरीका प्रदान करता है. इस विधि प्रतिदीप्ति विश्लेषण की संवेदनशीलता के रूप में अच्छी तरह के रूप में की क्षमता छवि जीवित कोशिकाओं के लिए और प्रोटीन की गतिशीलता का अध्ययन करते हैं का लाभ लेता है. तकनीक को आसानी से कई अलग अलग सेल प्रकार के लिए अनुकूल है और दोनों रहते हैं और निश्चित सेल इमेजिंग के लिए उत्तरदायी है. उदाहरण के लिए, औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी रहते इमेजिंग और समय व्यतीत हो वीडियो पर कब्जा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके विपरीत करके, घुड़सवार कोशिकाओं स्थिर राज्य localizations या अधिक विस्तृत असतत localizations के confocal इमेजिंग के निर्धारण के लिए या तो epifluorescence माइक्रोस्कोपी में इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली (FRAP), या photobleaching में प्रतिदीप्ति हानि (फ्लिप) के रूप में इस तरह की तकनीक स्थानीयकरण 1 कैनेटीक्स के निर्धारण में इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रोटोकॉल में वैकल्पिक fluorophores का समावेश प्रोटीन बातचीत प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा (झल्लाहट) हस्तांतरण के लिए 2 संगीत कार्यक्रम में आयोजित किया जा के रूप में ऐसे प्रयोगों के लिए अनुमति होगी. जैसे leptomycin बी या नकारात्मक प्रमुख सेलुलर तस्करी के विभिन्न inhibitors दौड़ा GTPase constructs के लिए विशेष आयात या निर्यात रास्ते 5,6,9 पर निर्भरता की स्थापना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
The authors have nothing to disclose.
हम Worcester पॉलिटेक्निक संस्थान रसायन विज्ञान और जैव रसायन के विभाग के लिए धन के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Effectene reagent | Qiagen | 301425 | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | ||
Trypsin | Fisher | SH3023602 | ||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher | SH30243FS | High glucose | |
paraformaldehyde | FisherChemical | O4042-500 | ||
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | ||
Hyclone Serum (fetal bovine) | Thermo Scientific | SH3008803HI | ||
Falcon 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | ||
Polyethylene glycol 1000 | Fisher | 528875-25GM | ||
Cover slips | Fisher | 12-545-85 | ||
DABCO | Sigma-Aldrich | D2522-25G | ||
Nucleofector HDF kit | Lonza | VPD-1001 |