Summary
여기 방법 C. 엘레간스 연관 학습과 단기 및 장기 연관 메모리를 테스트하기 위해 설명합니다. 이러한 인구 assays은 휘발성 odorants 향해 chemotax에 웜 기능을 채용하고 chemoattractant butanone과 함께 음식을 페어링에 긍정적인 연관 관계를 형성하고 있습니다. 에어컨 기간의 수를 늘리면 장기 기억을 유도.
Abstract
경험과 배운 정보의 기억은 그들의 생존을 지원 결정을 내려야하는 생물에 대해 중요합니다. C.가 엘레간스 음식과 화학 냄새 1, 2의 신경 세포 특정 감지를 통해 환경을 이동하고, 화학 냄새 3, 온도 4 및 음식 소스 5 pathogenicity과 영양 상태를 연결할 수 있습니다.
여기, 우리는 C. 엘레간스 연관 학습과 단기 및 장기 연관 메모리 assays을 설명합니다. 우리는 대신에 긍정적인 반응을 생산하는 aversive 후각 학습 패러다임 6 수정, 분석은 다음 AWC 신경 세포 - 감지 (낮은 chemotactic 인덱스를 elicits 농도에서 휘발성 chemoattractant의 butanone을 유사한 존재에있는 벌레를 먹이 ~ 400 벌레를 굶주리고 포함 Toroyama 외. 7). 표준 인구 assay1 테스트 즉시 odorant 또는 조절 후 시간 분 웜 '매력 chemotaxis.
butanone 증가 에어컨, 야생 형 동물 'chemotaxis 후 ~ 0.6 Chemotaxis 지수 단위는 "학습 색인". 연관 학습은 훈련 기간 동안 음식과 butanone 모두의 존재에 따라 좌우됩니다. 단일 에어컨 기간 ( "massed 교육")에 대한 페어링 음식과 butanone는 ~ 2 시간 정도 단기 연관 메모리를 생산하고 있습니다. ( "간격 훈련") 사이의 휴식 기간으로 여러 컨디셔닝 기간이 장기적인 연관 메모리 (<40 시간) 수율, 그리고 캠프 반응 요소 바인딩 단백질 (CREB), 6에 걸쳐 장기 기억에 필요한 전사 인자에 따라 좌우됩니다 종 8.
우리 프로토콜은 또한 chemotaxis 인덱스의 신속하고 정확한 결정을위한 영상 분석 방법을 포함하고 있습니다. chemotaxis 분석 플레이트에 동물의 하이 콘트라스트 이미지는 MatLab에서 벌레 계산 소프트웨어로 캡처하고 분석합니다. 소프트웨어는 형태학의 tophat 변환을 사용하여 고르지 배경 수정 9. 오오 츠의 방법은 다음 배경에서 별도로 벌레로 임계값을 결정하는 데 사용됩니다. 10 아주 작은 입자가 아닌 웜 영역을 (플레이트 가장자리 또는 한천 펀치) 자동으로 제거하고 큰 있습니다 수동 선택에 의해 삭제되었습니다. 소프트웨어는 다음 지정된 최대 크기 이상의 아르 영역을 무시하고 나머지 지역의 평균 크기를 복용하여 단일 벌레의 크기를 추정하고있다. 벌레의 수는 다음 하나의 벌레의 예상 크기에 의해 벌레에 의해 점유로 식별 전체 지역을 나누어 추정된다.
우리는 학습과 단기 및 장기 기억을 구분할 수 것으로 나타났습니다, 이러한 프로세스가 높은 생물과 유사한 핵심 분자를 공유. 6,8 우리 assays 신속하게 새로운 후보 유전자 또는 학습 및 단기 또는 장기에 영향을 분자를 테스트할 수 있습니다 C.에서 장기 기억 수종에 걸쳐 관련성이 엘레간스.
Protocol
이러한 C. 엘레간스 연관 학습과 기억 assays 사전 준비가 필요합니다. 준비 제안 일정을 보려면 그림 1A에 표시되는 타임 라인을 참조하십시오. 또한 웜 '추억은 물리적인 교반 (거친 pipetting, 원심 분리, vortexing)에 의해 방해 받고 수 있습니다, 그리고 순진한 chemotaxis은 환경에 과도한 냄새 (향수 등)에 의해 불안정하게된다 는걸 알수 있습니다.
1. 어세를위한 동물의 준비
- (제조법 섹션 7.1을 참조) 1 ML OP50 E.와 씨앗 100mm 성장 미디어 (HGM) 접시에 벌레를 기르다 표준 방법을 사용하여 대장균 11.
- 계란의 큰 동기 인구를 얻을 gravid 성인 웜 중 적어도 두 개의 인구 밀도가 높은 HGM 번호판을 염소산 - 취급.
참고 : 최고 수율의 경우 표백제 1 세대는 이후 단계에 달걀을 얻기 위해 다음 표백, 일 성인 2 인과 같은 2 세대를 고도로 동기화 인구를 얻을 수 있습니다. - 고르게 한 ML OP50 E.와 씨앗 3-4 HGM 접시에 달걀을 나누어 각 차아 염소 산염에 대한 대장균은 접시를 치료.
참고 : 기아는 후각 assays의 결과에 영향을 미칠 수있는 벌레가 신선한 음식을 많이 재배하는 것이 중요합니다. - 약 72 시간 동안 20oC에서 동물들이 젊은 성인 단계에 도달하기에 걸리는 시간을 벌레를 품어.
2. 사전 컨디셔닝 스타브
- 벌레가 여전히 음식을 많이했는지 확인하기 위해 청소년으로 HGM 접시를 확인하고, 분석 (분석 플레이트 당 ≥ 200 웜)에 대한 충분한 벌레가있다는 것을 두 번.
- 15 ML 원뿔 관에 M9 버퍼 11 HGM 접시의 벌레를 씻으십시오. 세척하는 동안 적어도 동요 들어, 부드럽게 HGM 판에 몇 밀리리터를 따르고하여 M9 버퍼를 적용하고, 부드럽게 소용돌이 쓰는 OP50 박테리아에서 무료로 벌레로 접시. 다음, 접시를 기울 P1000 pipetman를 사용하여 판의 모퉁이에서 M9 버퍼 / 벌레 혼합을 끌어하고, 15 ML 원뿔 튜브로 벌레를 전송합니다. 벌레가 아직 플레이트에 남아있다면,이 단계는 1 - 2X를 반복합니다.
참고 : 러프 벌레와 튜브로 만들 수있는 접시의 dislodges 세균을 세척. 이 박테리아는 제거하고 assays를 방해할 수 있습니다 불가능합니다. 이것은 벌레를 손상 assays를 방해할 수 있듯이, 튜브의 측면에 대한 벌레를 피펫하지 마십시오. - 웜은 (원심 분리기하지 않음) 중력에 정착하자. 진공에 의해 뜨는 제거하고 M9 최소한 3-4 ML로 씻으십시오. 3 세척 총 2X 반복합니다.
참고 : 세척하는 동안 Centrifuging하면 assays를 방해할 수 웜 인구로 남아있는 박테리아를 풀다운 것입니다. 대신 부드럽게 15 ML 원뿔 관에 직접 물을 붓는하여 이후의 세척을 위해 M9 버퍼를 추가합니다. 튜브의 하단에있는 해결 벌레는 또한시 M9 버퍼의 혼합이 될 것입니다. 벌레가 정착 남아 있으면 가볍게 섞어 튜브를 반전. - 세 번째 세척 후, 순진한 chemotaxis의 assays (5 항)에 대한 웜 인구 중 일부를 사용합니다.
참고 : 벌레들이 butanone 향해 순진한 chemotaxis을 높일 수 있습니다 M9 버퍼에 너무 오래 앉아 있으면 굶어 시작되므로 그것은 모든 세척 단계에서 매우 빠르게 작동 중요합니다. - 15 ML 원뿔 관에 M9 버퍼의 3-4 ML 추가, 웜 1 시간 (그림 1B, C)의 상온에서 M9 버퍼에서 굶어 보자.
3. 단기 연관 메모리 (massed) 교육
단기 연관 메모리 분석 워크플로우에 대한 그림 1B를 참조하십시오.
- M9 버퍼 (제 2), 60mm 선충류 성장 미디어 (NGM)에 씨앗을 품고있다 11 접시의 뚜껑의 안쪽에 10 % butanone의 연속 2 μL (95% EtOH)에 굶어 기간의 끝에서 500 μL OP50 E. 대장균.
참고 : - 단기 및 장기 기억 assays를위한 좋은 시작 인구가 벌레의 ≥ 500 μL입니다. 여러 컨디셔닝 플레이트는 훈련 기간 동안 전체 인구를 지원하기 위해 유전자형마다 필요합니다. 휘발성 화학 물질 작업을하는 경우에만 그들이 다른 모든 시간 폐쇄 떠나, 접시 필요할 경우의 뚜껑을 엽니다. - 진공에 의해 굶주린 벌레의 15 ML 원뿔 관에서 M9 버퍼 뜨는을 제거하고 조절 플레이트에 누더기 100-200 μL을 적용 P1000 pipetman을 사용합니다.
참고 : 조절 플레이트로 전송되면 웜은 빠르게 OP50 음식 소스를 잡을 수 있도록, 가능한 한 많은 M9 액체를 제거하십시오. 웜는 피펫 팁의 내부에 집중하고 작은 볼륨을 pipetting하여 보존하실 수 있습니다. - 1 시간 (그림 1B)를 실온에서 조절 번호판을 품어.
- 15 ML 원뿔 관에 ~ 1 ML M9 버퍼와 접시의 벌레를 씻으십시오. 벌레는 중력에 의해 정착합시다. 튜브의 M9 버퍼 분명히 때까지 1 - 2X 다시 씻으십시오.
참고 : 섹션에 설명되어있는 부드러운 세탁 방법을 사용하여2. 같은 15 ML 원뿔 관이 제 2에서 사용할 수 있습니다. - 최종 세척 후 진공으로 M9 버퍼 뜨는을 제거하고 (0 분 시점 즉시 에어컨 이후 (massed) 1X에 대한 테스트 (5 항) chemotaxis의 assays를위한 음식 butanone 협회 연관 학습을 웜 인구의 일부를 사용하여 ).
학습 지수 (LI) = CI 0 시간 - CI 나이브. - OP50 500 μL (번호판을 개최)와 씨앗 60mm의 NGM 플레이트로 웜의 나머지 인구를 전송합니다. 다시 인구를 지원하기 위해 충분한 박테리아가되도록 플레이트 웜의 당 100-200 μL를 적용합니다.
참고 : 유전자형 당 사용 잡고 접시의 숫자는 적어도 테스트에 단기 연관 메모리 시간이 지점의 번호입니다. - 실온 (그림 1B)에서 0.5, 1, 또는 2 시간 (단기 연관 메모리 시간 점)에 대한 사후 조절 번호판을 품어.
참고 : 야생 형 동물의 단기 연관 메모리 훈련 후 2 시간으로 끝납니다. 시간 지점은 다른 genotypes이나 조건에 맞게 변경해야 할 수 있습니다. - 식품 butanone 협회 단기 연관 메모리에 대한 테스트하려면 각 시점 이후 부드럽게 M9 버퍼 1 - 2X 다시 15 ML 원뿔 관에 접시에서 벌레를 씻어합니다. chemotaxis의 assays (5 항)에 대한 웜을 사용합니다. 학습 지수 (LI)는 = CI의 시점 - CI 나이브.
참고 : 제 2에 설명되어있는 부드러운 세척 방법을 사용하십시오. 각 시점 들어, chemotaxis의 assays에 사용되지 않은 여분의 벌레를 폐기하십시오.
4. 장기 연관 메모리 (간격) 트레이닝
장기 연관 메모리 분석 워크플로우에 대한 그림 1C를 참조하십시오.
- 제 3 단계 3.1-3.2를 따르십시오.
- 30 분 (그림 1C)에 실온에서 조절 번호판을 품어.
- 제 3 단계 3.4를 따릅니다.
참고 : 30 분 기간 안에 남아, 하나 ~ 25 분 훈련 동안 모든 세척을 시작할 수 있습니다. - 최종 세척 후, 60mm의 NGM 번호판을 unseeded에 진공 및 전송 웜으로 M9 뜨는을 제거하십시오.
참고 : 웜 배고파되고 있기 때문에 유전자형 당 여러 개의 접시의 사용이 단계에서 필요하지 않습니다. - 30 분 (그림 1C)에 실온에서 60mm의 NGM 플레이트에 굶어.
- 15 ML 원뿔 관에 M9 버퍼와 벌레를 씻으십시오. 웜은 (원심 분리기하지 않음) 중력에 정착하자.
참고 :이 시점에서 버퍼에 박테리아가 없어야하지만, centrifuging는 벌레의 위험성이 치료 될 수 있으며, 장기 기억 형성을 방해 수 있습니다. - 반복 7 컨디셔닝 블록과 6 총 (그림 1C) 완료되었습니다 블록을 굶기까지 4.1-4.6 여러 번 단계를 반복합니다. (대표 타임 시트에 대한 표 1을 참조하십시오.)
- 부드럽게 M9 버퍼 1 - 2X 다시 15 ML 원뿔 관에 접시에서 벌레를 씻어합니다.
- 최종 세척 후, 7x 즉시 조절 후 음식 butanone 협회 (0 시간 시점)의 (간격) 연관 학습을 테스트하기 위해 chemotaxis의 assays (5 항)에 대한 웜 인구 중 일부를 사용합니다. 학습 지수 (LI) = CI 0 시간 - CI 나이브.
- OP50 1 ML (번호판을 개최)와 씨앗 100mm의 HGM 플레이트로 웜의 나머지 인구를 전송합니다. 다시 인구를 지원하기 위해 충분한 박테리아가되도록 플레이트 웜의 당 100-200 μL를 적용합니다.
참고 : 유전자형 당 사용 잡고 접시의 숫자는 적어도 테스트에 장기 연관 메모리 시간이 지점의 번호입니다. 100mm NGM 플레이트는 사후 컨디셔닝 접시로도 사용할 수 있지만, 하나는 적어도 16 시간 동안 벌레의 인구를 지원하기 위해 충분한 OP50있다는 것을 아주 조심해야합니다. - 20oC (그림 1C)에 게시 - 컨디셔너 16 접시, 24, 40 시간 (장기 연관 메모리 시간 점) 알을 품다.
참고 : 야생 형 동물의 장기 연관 메모리 훈련 후 40 시간으로 끝납니다. 시간 지점은 다른 genotypes이나 조건에 맞게 변경해야 할 수 있습니다. - 식품 butanone 협회 장기 연관 메모리에 대한 테스트하려면, 부드럽게 각 시점 이후 M9 버퍼 1 - 2X 다시 15 ML 원뿔 관에 접시에서 벌레를 씻어합니다. chemotaxis의 assays (5 항)에 대한 웜을 사용합니다. 학습 지수 (LI)는 = CI의 시점 - CI 나이브.
참고 : 제 2에 설명되어있는 부드러운 세척 방법을 사용하십시오. 각각의 시점은 chemotaxis의 assays에 사용되지 않은 여분의 벌레를 폐기하십시오.
5. Chemotaxis 어세이
- chemotaxis 검정 접시를 준비합니다. 접시의 바닥과 양쪽 (그림 2A)에 점이 unseeded 100mm의 NGM 플레이트의 하단을 표시합니다.
주 : 3 적어도 통계적으로 의미있는 결과를 얻기 위해 실행해야합니다 유전자형마다 복제합니다. - 스팟 1 odorant 1 M 난 3 μL와제어 지점 (그림 2B).
참고 : 15 분 이상 분석을 시작하기 전에이 마비 요원으로 접시 지점, 또는 할머니 3 반점에서 멀리 확산되며, 동물 odorant 또는 제어 장소에 도달하기 전에 마비가 될 것입하지 마십시오. 안 찔린 한천을 벌레가 구멍 분야에 버로우 때문에 난 3 적용을주의하십시오. - 벌레가에 표시된 검정 접시에 적절한 곳 (그림 2C)에서 (제 7.2 참조) 여러 M9 버퍼 세척 (제 2), 지점 1 μL 95 % EtOH의 각각 10 % butanone 후 원뿔 관에 정착하는 동안 이전에 발견 할머니 3 위로.
참고 : 화학 물질이 웜 (제 5.4)를 추가하기 전에 발견해야합니다. 자리가 EtOH 또는 butanone을 가지고있는 메모를 확인하십시오. 이러한 휘발성 화학 물질과 함께 작업할 경우에만 접시 필요한 경우의 뚜껑을 열주의하고, 그들이 다른 모든 시간에 감아. - 해결 웜의 튜브에서 가능한 M9 버퍼의 많은를 제거합니다. 표시된 검정 접시 (그림 2D)의 기원에 배 5 μL 웜 (200-400 동물)을 제공하는 미리 절단 팁 (제 7.3 참조) P20 pipetman을 사용합니다.
참고 : 사전 에어컨에 사용 (제 2-4) 스타브와 메모리 assays를위한 15 ML 원뿔 관에 남아있는 벌레를 유지. 웜는 웜 인구를 보존하고 분석 접시에 벌레와 살포되면 액체의 양을 줄일 수 있도록 작은 양이 접시에 벌레를 추가, 피펫 팁 내부 스틱 것입니다. - 작은 지점 KimWipe의 모서리를 트위스트와 초과 M9 버퍼를 얼룩에 사용합니다. 이것은 분석 플레이트 (그림 2E)에 벌레를 발표할 예정이다.
참고 : 펑크 KimWipe과 한천를주의, 그렇지 않으면 웜은 기원에서 버로우합니다. 모래 바닥 때이 M9 버퍼와 KimWipe에 행진 같은 일부 웜은이 단계에서 손실될 수 있습니다. 웜 (제 6) 계산을 이미징 및 분석을 사용하는 경우, 출발지에서 벌레를 공개하기 전에 영상 경찰서에 번호판을 가져가라. 바로이 출시된 이후에 원점에서 벌레의 이미지는 분석 접시 동물의 총수를 제공합니다. - 실온에서 1 시간 chemotaxis 분석 플레이트를 품어.
- 원산지, EtOH에서 벌레의 수를 계산하고, butanone 명소 (그림 2)뿐만 아니라 분석 접시에 벌레의 총 수입니다.
참고 : 일반적으로, 난 3 마비 웜은 명소 ~ 1cm 반경되며, 서로에 대한 스택 많은 동물 스틱 바로 나타납니다. 웜 (제 6) 계산을 이미징 및 분석 소프트웨어를 사용하면, 기원, EtOH, 그리고 butanone 명소의 이미지를 가져가라. 벌레의 총 금액의 이미지 섹션 5.5에서 촬영되어 있어야합니다. 웜는 또한 "손으로 계산."될 수 있습니다 - "Chemotaxis 색인"을 (CI)을 계산. CI = ([(N Butanone) - (N EtOH )]/[( 총 - N 오리진)].
6. 이미지 분석에 의해 계산 웜
- chemotaxis 분석 플레이트 (그림 3A, 카메라 설정에 대한 설명 섹션 7.4 참조)에 벌레의 고대비 흑백 이미지를 가져가라. chemotaxis 지수를 계산하기 위해 이미지는 butanone, EtOH에 필요한, 그리고 원산지 분석의 끝에 chemotaxis 분석 판의 명소뿐만 아니라 웜의 총 개수 (그들의 출시 직후 원산지에서 벌레의 사진 분석의 시작 부분에서 M9 버퍼, 섹션 5.5).
참고 : 각 지점 주위에 2cm 반경에 대한 덮고있는 chemotaxis 분석 플레이트의 이미지는 일반적으로 각 지점에 대한 동물의 모든 캡처. - 한 번 지점 (예 : 나이브 0 HR 등)의 모든 실험에 대한 파일을 적절하게 이름이 하나의 폴더에 들어 있는지 확인합니다.
- 각 chemotaxis 플레이트에 대한 파일이 같은 이름을 지정해야합니다 :하지만 # PNG (butanone 장소, 재판 #), 오라 # PNG (기원, 평가 #), ETH # PNG (에탄올 장소, 재판 #), 토크 #은 PNG가.... (총 재판 #). 이 시련이 시점에 대해 실행하면 (예를 들어, 같은 폴더에 다음 파일이 존재합니다 : but1.png, ori2.png, tot1을 but2.png eth1.png, eth2.png, ori1.png . PNG, tot2.png)
- 열기 Matlab (제 7.5 참조).
- Matlab 윈도우의 상단에있는 "현재 디렉토리"라인에서 폴더를 검색하고 "count_worms_v0.5.3"폴더를 (부가 정보와 같은 M - 파일 가능)을 선택합니다.
- "명령 창에서"를 입력 "count_worms_directory ()." Enter를 누르십시오.
참고 : 기본 웜 크기 때이 명령은 분 10 최대 80 픽셀에있다. 특정 유전자형이나 발달 단계, 유형 "count_worms_directory ( 'minsize', 10 ', maxsize', 80)"과 그에 따라 픽셀의 숫자를 변경을 기반으로 이것을 조정합니다. - 메시지가 나타나면 이미지의 폴더를 분석하도록 선택할 수 있습니다.
참고 : 이미지의 하나의 폴더가 한 번에 분석할 수 있습니다. - 분석중인 폴더에 각각의 이미지는 이미 설정된 임계값과 함께 나타납니다, 그리고 입자 (그림 3A)을 선택. 일을 삭제 벌레 없습니다 선택된 입자 위에 사각형 도구를 드래그그들. 이미지 작업이 완료되면 Esc 키를 누르십시오.
- 폴더에있는 모든 이미지가 선택되어 있는지 확인 후, 4 열은 명령 창에 나타납니다 : (1) 이미지 이름 (예 : but1), (2) 항상 "[1];"(3)에 의해 계산 한 벌레의 평균 픽셀 크기를 특정 이미지를 프로그램하며, 이미지의 수 계산 웜 (4) 번호입니다.
- 이 프로그램은 실행되면, 그것은 두 입금됩니다. csv 파일 (엑셀 스프레드 시트로 열 수 있습니다) 그냥 분석이 이미지의 폴더로가. "worm_counts_stats"파일은 명령 창 (제 6.9)에있는 출력 컬럼을 제공합니다. (1) 시험 번호, 웜 숫자 (2)하지만, (3) ETH, 그리고 (4) 오라 명소 및 웜 (5) 총 개수 : "worm_counts_summary"파일은 5 컬럼을 제공합니다.
7. 자료 정보
- 100mm 성장 미디어 (HGM) 접시 (제 1) 준비 : 3g NaCl, 20g Bactopeptone, 그리고 30g 700 ML 증류수에 Bacto - 한천을 디졸브. 증류수 1 L에 볼륨을 가져와. 65oC로 멋진 한천을 autoclaving과 에탄올 5 MG / ML 콜레스테롤 4 ML을 추가하면, 1 ML 1 M CaCl 2, 1 M MgSO 4, 1 M KPO 4 (산도 = 6.0)의 25 ML 각.
- 높은 비율 EtOH 결과에 영향을 미칠 수있는 정제 과정에서 불순물을 포함하는 경향으로 95 % EtOH가 사용됩니다. 그것은 분석이 실행 신선한마다 몇 번 10 % butanone (95% EtOH에서) 주식을하는 것이 좋습니다.
- P20 팁 몇 mm가 손상되지 않고 통과에 맞게 벌레에 대한 구멍 큰만큼을 만드는 잘라해야합니다. P1000 도움말 이미 벌레에 대한 통해 들어갈 정도로 큰 구멍이 있습니다.
- 머피 실험실에 chemotaxis 분석 접시 영상 역 (그림 3B)은 붐 스탠드에 연결된 가변 배율 렌즈가 FireWire 카메라를 포함하고 있습니다. 백라이트는 chemotaxis 분석 플레이트가 바닥에서 조명 할 수있는 유리 상단 (그림 3C)와 사용자 지정 이미지 플랫폼 아래 서의 하단에 배치됩니다. "측정 및 자동화"소프트웨어 (내쇼날 인 스트 루먼트)는 이미지를 캡처하는 데 사용됩니다. 이 영상 역에 대한 자료가 설정 이전에 출판 사람, 12와 유사하고 특정 시약 및 장비의 테이블에서 찾을 수 있습니다.
8. 대표 결과 :
10 % butanone을위한 야생 형 벌레에 대한 전형적인 순진 chemotaxis 지수 (CI)는 0.2 (그림 4A) 주변이다. 6 Massed (1X) 또는 간격은 (7x) 교육은 일반적으로 (시간 0 0.7-0.8로 그림을 chemotaxis 인덱스를 증가 4A, CD)는 학습 인덱스 (LI = 훈련 CI주고 -. ~ 0.6의를 나이브 CI) 6들에게 매우 강력합니다 massed 또는 간격 훈련 발생 학습합니다. 미만 0.5의 LI 일반적으로 순진 chemotaxis 분석에 문제가있을 경우 발생하며, 동물 0.3 이상의 순진한 CI 있습니다. 환경 냄새도 순진 CI를 높일 수 있습니다, 벌레 배고파거나 너무 표백 및 분석의 시작, 또는 웜 사이에 재배 접시에 붐비는 앉아서 너무 오래 세척 사이 M9 버퍼와 굶기 시작되기 때문에 일반적으로 이러한 오류가 발생합니다. 굶주린 벌레는 10 % butanone에 대해 훨씬 높은 순진한 CI (그림 4B) 6. 우리는 순진 chemotaxis 문제는 일반적으로 향상 웜 관심과 culturing로 해결 것을 알게 있습니다.
이러한 assays 메모리의 기간은 훈련 순진 수준으로 돌아갑니다 후에 그것이 바로 chemotaxis 지수에 대한 때 학습 색인 = 0 걸리는 시간입니다. 야생 형 동물에서 단기 연관 메모리는 일반적으로, massed 훈련 후 1 시간 단위로 감소하기 시작 약 2 시간 정도하고, 전사 인자 CREB (그림 4C)의 독립적 6. 장기 연관 메모리는 일반적으로 시작되지 않습니다 간격 훈련 후 16시간는 40 시간까지 지속하고, (그림 4D) CREB에 의존 때까지 크게 감소 6 장기 연관 메모리는 여러 경우에 그것의 잠재력에 도달하지 않을 수 있습니다. (1) 벌레가 충분하지 OP50 E. 30 분 컨디셔닝 기간 동안 대장균은 (2) 박테리아는 굶어 기간 동안 M9 버퍼에 남아있는, 또는 (3) 벌레가 분석 (예 : 웜은 튜브의 측면에 대한 pipetted됩니다) 동안 손상되었습니다.
결과는 일반적으로 4 개 이상 chemotaxis 분석 실험이 시점마다 유전자형마다 실행할 때 통계적으로 의미가있다. 여섯 실행하면 유전자형 당 복제 일반적으로 처리하기 위해 너무 많이가되기없이 매우 의미있는 결과를 산출하지만, 초보자는 세 복제로 시작 할 수 있습니다. 일반적으로 한 번에 2-3 genotypes 또는 조건과 협력하는 것은 이러한 학습과 기억 assays과 경험이있는 사람들을 위해 편안합니다.
chemotaxis의 검정 접시에 손으로 계산 웜은 매우 시간이 소요됩니다, 실험이나 실험실 친구 사이의 변화를 추가할 수 있으며, 분석하고 난 때도 편견을 소개합니다데이터를 nterpreting. 이미지 분석 (제 6 항)에 의해 계산 웜은 연구소를 통해 데이터 수집 및 분석을 standardizes, 평균에 손 계산을 위해 필요한 것을 1 / 5 경험 실험실 구성원에 대한 데이터 분석 시간을 삭감. Count_worms 소프트웨어에 의해 결정들에게 수동 웜 카운트를 사용하여 계산 chemotaxis 지수를 비교하면, 우리는 3.07의 평균 오류 (± 1.19) %을 찾으십시오.
| 1 일 | |
| 시간 | 단계 |
| 9시 | 1 시간은 M9 버퍼에 굶어 나이브 chemotaxis 분석을 시작합니다 |
| 10시 | 조건 # 1 (음식과 butanone와 60mm의 NGM 플레이트), 30 분 최종 나이브 chemotaxis 분석 |
| 10시 반 | # 1 (60mm NGM 접시), 30 분 굶어 |
| 11시 | 조건 # 2, 30 분 |
| 11시 반 | 30 분 # 2 굶어 |
| 12시 | 조건 # 3, 30 분 |
| 12시 반 | 30 분 # 3 굶어 |
| 1시 | 조건 # 4, 30 분 |
| 1시 반 | 30 분 # 4 굶어 |
| 2시 | 조건 # 5, 30 분 |
| 2시 반 | # 5, 30 분 굶어 |
| 3시 | 조건 # 6, 30 분 |
| 3시 반 | 30 분 # 6 굶어 |
| 4시 | 조건 # 7, 30 분 |
| 4시 반 | 0 - HR chemotaxis 분석을 시작합니다 16-40 시간을위한 접시를 잡아 남은 웜을 전송 |
| 5시 반 | 엔드 0 - HR chemotaxis 분석 |
| 날 2 | |
| 시간 | 단계 |
| 8시 반 | 16 시간 chemotaxis 분석을 시작합니다 |
| 9시 반 | 최종 16 시간 chemotaxis 분석 |
표 1. 장기적인 연관 메모리 분석을위한 대표 일정. 이 예제에서는 분석들은 굶기는 1 시간과 오전 9시 1 일에 시작됩니다. 벌레가 일곱 번 에어컨 때까지 30 분 상태와 기간을 굶어도 가끔 해있다. Chemotaxis의 assays은 시작 (순진) 및 훈련의 끝 (0 HR)에서 실행됩니다. 처음부터 끝까지 런타임 총 8.5 시간입니다. 대기 접시에 벌레가 16~40시간 훈련 후 2 일 시작 butanone에 chemotaxis에 대해 테스트합니다.
그림 1. 단기 및 장기 연관 메모리 분석 워크플로우. (A) 하루 assays에 이르기까지의 준비 추천 일정이 수행됩니다. (B) 단기 연관 메모리 분석 : 스타브드 웜이 1 시간 동안 에어컨 및 chemotaxis의 assays를 통해 1X 학습 (0 분). 즉시 테스트하거나, 컨디션 후 0.5, 1, 또는 2 시간 동안 음식을 들고 접시에 전송됩니다. (C) 장기 연관 메모리 분석 : 스타브드 동물 컨디셔닝 7 교육 블록을 수신 / 16~40시간 교육 이후 학습 LTAM에 대한 검사를 받기 전에 배고파.
그림 2. Chemotaxis 분석 설정. chemotaxis 분석 판의 (A) 도식. 작은 반점은 원점 (아래)와 접시 butanone와 EtOH (왼쪽 및 오른쪽) 장소를 표시하는 통치자 또는 기타 유도 장치의 도움으로 접시에 추가됩니다. (B) 1 μL 난 3 butanone와 EtOH 명소에 추가됩니다. (C) 1 μL의 10 % butanone와 95 % EtOH의 각 접시의 왼쪽이나 오른쪽에있는 반점이 추가됩니다. (D) M9 버퍼에 일시 중지 200-400 벌레는 접시의 기원에 추가됩니다. (E) 포인트로 변해 KimWipe는 분석 플레이트에 M9 버퍼와 릴리스 벌레를 흡수하는 데 사용됩니다.
그림 3. 영상 분석 카운트 웜. "count_worms_v0.5.3"이미지 입자 선택 창 (A) 예. 이 프로그램은 원래의 고대비 흑백 이미지 (왼쪽) 자동 thresholded 이미지 (가운데)와 윈도우를 팝업으로 열립니다. 사각형 도구는 이러한 분석 플레이트 마크 (1), 플레이트 가장자리 (2), 또는 한천 자국 (3)과 같은 바람직하지 않은 웜 "입자"을 강조 표시하고 제거하는 데 사용할 수 있습니다. 머피 실험실 chemotaxis 분석 이미징 역 (B) 이미지. Chemotaxis 분석 플레이트는 분석을 위해 필요한 높은 콘트라스트 이미지를 만들기 위해 바닥에서 조명하고 있습니다. 사용자 정의 만든의 (C) 도식영상 플랫폼 chemotaxis 이미징 역에 사용.
그림 4. 전형적인 연관 학습과 기억 결과입니다. massed시 10 % butanone 증가 (1X) 교육에 야생 타입의 웜 (A) 나이브 chemotaxis 지수. 배운 협회는 음식 (OP50 E. 대장균)와 butanone의 페어 링이 필요합니다. 막대 위의 번호는 "학습 색인"(- CI 그렇다고 LI가 = CITrained) 나타냅니다. 벌레는 16 시간 동안 굶주려 경우 (B) 10 % butanone에 와일드 타입 순진한의 chemotaxis은 크게 증가됩니다. 패널 광고는 카우프먼 외에서 조정됩니다. 2010 년이. 6 (C) 와일드 타입 단기 연관 메모리가 약 2 시간 정도하고, 전사 인자 CREB의 독립적입니다. (D) 와일드 타입 장기 연관 메모리는 약 40 시간 정도하고, CREB - 따라 달라집니다.
부가 정보
Discussion
C. 엘레간스 후각 연관 학습과 기억 assays 여기 massed 학습, 간격 학습, 단기 기억과 장기 기억의 과정을 구별을 제시. 이러한 assays들이 환경 1,2 음식과 화학 냄새를 감지하고 둘 사이에 긍정적인 연관 관계를 형성하는 웜 '능력에 의존하고 있습니다. 6 따라서 assays 동물의 시작 인구 기아에 민감하고, 큰 관심이 있어야합니다 벌레가 잘 훈련 전후에 공급되는 것을 보장하기 위해 이동합니다. 싱글 massed 훈련은 단기 연관 메모리를 산출. 컨디셔닝 기간과 간격 훈련 패러다임의 증가 숫자는 C로 장기적인 연관 메모리 달성을위한 중요 엘레간스는 다른 유기체에 있기 때문입니다. 6,8 아마도이 분석은 다양한 시설과 무조건 자극 사이 협회의 장기 기억을 생산하기 위해 수정이 될 수 있습니다.
우리 연관 학습과 기억 assays은 노화 또는 유전 돌연변이 동물로 야생 유형의 학습과 기억 능력을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 연관 학습과 야생 타입 벌레를 노화의 장기 연관 기억 능력의 저하 모두, 학습이 감소 인슐린 신호 전달, 그리고 학습 및 기억과 동물의 나이가 오래 유지되는 동안은 calorically 제한 동물의 나이가 오래 유지됩니다. 6 이러한 assays는 RNAi 치료 또는 C의 약리 조작 의무 아르 엘레간스. 예를 들어, DAF - 2 RNAi와 웜의 치료 향상 단기 및 장기 연관 메모리, 반대로 간격 훈련 동안 유전자 전사와 마약으로 단백질 합성 (actinomycin D와 cycloheximide, 각각)의 막힘은 장기 기억 형성을 방해. 6
짧은 연관 학습을 구분하고 테스트하는 능력 장기 기억은 모든 동물의 생존에 중요 프로세스이며, 그것은 파블로프의 조건 반사 협회의 메모리에 관련된 분자 기계의 많은 나타나는 포유류로 웜에서 보존됩니다. 6 이러한 후각 assays를 사용하여 장기와 장기 기억은 C.하게 메모리의 진학 훌륭한 시스템을 엘레간스, 그리고 학습과 인간의 메모리의 손실로 이어질 neurodegenerative 프로세스에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 벌레를 계산하기 위해 ImageJ 13 사용하는 제안에 대한 Z. Gitai, 및 Google SketchUp에 도움을 위해 J. Ashraf, 설정의 초기 영상에 대한 조언 W. 류 감사합니다. CTM은 의생명 과학의 퓨 학술, 맥나이트 학술 및 켁 학자이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | S227 | Prepare 1 M concentration in distilled water |
| Ethyl Alcohol 190 Proof | Pharmco-AAPER | DSP-CT-18 | >95% Ethanol may have impurities that interfere with chemotaxis assays |
| 2-Butanone 99+% | Acros Organics | 14967-0010 | |
| Basler IEEE-1394/FireWire Area Scan CMOS Camera | Edmund Scientific | NT56-683 | |
| InfiniMite Video Lens – Alpha Industrial | Edmund Scientific | NT56-202 | |
| Dolan-Jenner MI-150 Fiber Optic Illuminator | Edmund Scientific | NT55-718 | |
| 8” x 8” Backlight | Schott AG | A08927 | |
| Standard Boom Stand | Edmund Scientific | NT54-120 | |
| 3/4” Post Adaptor for Boom Stands | Edmund Scientific | NT54-124 | |
| Standard Fixed 1/4-20 Mounting Plate | Edmund Scientific | NT54-122 |
References
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74, 515-515 (1993).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 817-817 (1973).
- Bono, M. de, Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu Rev Neurosci. 28, 451-451 (2005).
- Mori, I. Genetics of chemotaxis and thermotaxis in the nematode Caenorhabditis elegans. Annu Rev Genet. 33, 399-399 (1999).
- Zhang, Y., Lu, H., Bargmann, C. I. Pathogenic bacteria induce aversive olfactory learning in Caenorhabditis elegans. Nature. 438, 179-179 (2005).
- Kauffman, A. L. Insulin signaling and dietary restriction differentially influence the decline of learning and memory with age. PLoS Biol. 8, e1000372-e1000372 (2010).
- Torayama, I., Ishihara, T., Katsura, I. Caenorhabditis elegans integrates the signals of butanone and food to enhance chemotaxis to butanone. J Neurosci. 27, 741-741 (2007).
- Silva, A. J., Kogan, J. H., Frankland, P. W., Kida, S.
- Meyer, F. Iterative image transformations for an automatic screening of cervical smears. J Histochem Cytochem. 27, 128-128 (1979).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, 62-62 (1979).
- Brenner, S.
- Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. Dimensionality and dynamics in the behavior of C. elegans. PLoS Comput Biol. 4, e1000028-e1000028 (2008).
- Abramoff, M. agelhaes, Ram, P. J., J, S.
