Summary
A continuación se describen los métodos de ensayo C. elegans aprendizaje asociativo y la memoria a corto y largo plazo asociativo. Estos ensayos se emplean las habilidades de la población de gusanos chemotax hacia olores volátiles, y la forma de asociaciones positivas en maridaje con el butanona chemoattractant. Aumentar el número de períodos acondicionado induce memoria a largo plazo.
Abstract
La memoria de experiencias y la información obtenida es fundamental para los organismos a tomar decisiones que contribuyan a su supervivencia. C. elegans navega por el medio ambiente a través de las neuronas específicas de detección de olores de los alimentos y productos químicos 1, 2, y se puede asociar estados nutritivos con 3 olores químicos, la temperatura de 4, y la patogenicidad de una fuente de alimento 5.
Aquí se describen los ensayos de C. elegans aprendizaje asociativo y la memoria a corto y largo plazo asociativo. Se modificó un paradigma de aprendizaje aversivo olfativo 6 para producir vez una respuesta positiva, el análisis implica hambre ~ 400 gusanos, dar de comer a los gusanos en la presencia de la neurona AWC sintió butanona quimioatrayente volátiles en una concentración que provoca un índice quimiotáctico baja (similar a Toroyama et al. 7). Un estándar de la población quimiotaxis assay1 pruebas de atracción de los gusanos para el olor inmediatamente o minutos u horas después del acondicionamiento.
Después de la quimiotaxis de aire, de tipo salvaje de los animales a los aumentos de butanona ~ 0,6 unidades quimiotaxis índice, su "Índice de Aprendizaje". Aprendizaje asociativo depende de la presencia de alimentos y butanona durante el entrenamiento. Maridaje y butanona para un período de acondicionamiento individual ("capacitación masiva») produce a corto plazo la memoria asociativa que dura ~ 2 horas. Varios períodos acondicionado con periodos de descanso entre ("espacio de formación"), los rendimientos a largo plazo de la memoria asociativa (<40 horas), y depende de la proteína de cAMP respuesta elemento vinculante (CREB), 6 un factor de transcripción necesarios para la memoria a largo plazo a través de especies 8.
El protocolo también incluye los métodos de análisis de imagen para la determinación rápida y precisa de los índices de quimiotaxis. Imágenes de alto contraste de los animales en las placas de ensayo de quimiotaxis son capturadas y analizadas por el software gusano contar en MatLab. El software corrige de fondo desigual mediante una transformación tophat morfológicas. Método 9 Otsu se utiliza para determinar un umbral para los gusanos separado del fondo. 10 partículas muy pequeñas se eliminan de forma automática y más no gusano regiones (bordes de las placas o golpes agar) se eliminado por la selección manual. Entonces, el programa calcula el tamaño del gusano solo haciendo caso omiso de las regiones que están por encima de un tamaño máximo especificado y tomando la mediana del tamaño de las demás regiones. El número de gusanos entonces se calcula dividiendo el área total ocupada por identificó como gusanos por el tamaño estimado de un solo gusano.
Hemos encontrado que el aprendizaje y la memoria a corto y largo plazo se pueden distinguir, y que estos procesos comparten las mismas moléculas clave con los organismos superiores. 6,8 Nuestros ensayos pueden probar rápidamente nuevos genes candidatos o moléculas que afectan el aprendizaje y la de corto o largo plazo de memoria en C. elegans que son relevantes en todas las especies.
Protocol
Estos C. aprendizaje asociativo elegans y ensayos de la memoria requieren una preparación previa. De una propuesta de calendario de preparación, ver el calendario presentado en la figura 1A. También tenga en cuenta que los recuerdos de los gusanos 'puede ser perturbado por la agitación física (pipeteado áspero, centrifugación, agitación), y que la quimiotaxis ingenuo puede ser perturbado por los olores excesivos (perfumes, etc) en el medio ambiente.
1. Preparación de los animales de ensayo
- Cultivar gusanos en 100 medios de cultivo mm de alto (HGM) placas (ver Sección 7.1 de la receta) se siembra con una E. ml OP50 coli utilizando métodos estándar. 11
- Hipoclorito de tratar por lo menos dos placas densamente pobladas HGM de los gusanos adultos grávidas para obtener una gran población sincronizada de los huevos.
Nota: Para obtener los mejores rendimientos, blanqueador de la primera generación para obtener una población altamente sincronizado, blanquear la segunda generación como el Día 2 adultos para obtener huevos para la etapa siguiente. - Divida los huevos en platos HGM 3-4 sembradas con E. 1 mL OP50 coli por cada hipoclorito tratados plato.
Nota: Es importante que los gusanos se cultivan con gran cantidad de alimentos frescos como el hambre puede afectar el resultado de las pruebas olfativas. - Incubar a 20 º C gusanos de cerca de 72 horas, el tiempo necesario para que los animales llegan a la etapa adulta.
2. Pre-acondicionamiento de morir de hambre
- Compruebe de nuevo las placas HGM con los adultos jóvenes para asegurarse de que los gusanos todavía tienen un montón de comida, y que no son gusanos suficiente para el ensayo (≥ 200 gusanos por placa de ensayo).
- Lavar los gusanos en platos HGM con buffer M9 11 en un tubo cónico de 15 ml. Por la menor agitación durante el lavado, aplique suavemente el buffer M9 mediante el vertido de unos pocos milímetros en la placa de HGM, y agite suavemente la placa a los gusanos libre de la bacteria pegajosa OP50. A continuación, la inclinación de la placa, levantar el buffer M9 / gusano mezcla de la esquina de la placa con un P1000 Pipetman, y la transferencia de los gusanos de tubo cónico de 15 ml. Si los gusanos son aún quedan en el plato, repetir este paso 1-2X.
Nota: Áspero lavado de las bacterias desplaza fuera de la placa que se puede hacer en el tubo con los gusanos. Esta bacteria es imposible deshacerse de, y puede interferir con los ensayos. No pipetear con gusanos contra la pared del tubo, ya que esto puede dañar los gusanos e interferir con los ensayos. - Vamos a resolver por la gravedad de los gusanos (NO centrífuga). Aspirar el sobrenadante por vacío y lavar con un mínimo de 4.3 ml de M9. Repita 2 veces para un total de 3 lavados.
Nota: centrifugación durante el lavado se tire abajo de cualquier bacteria que queda en la población de lombrices, que pueden interferir con los ensayos. En su lugar, añadir con cuidado M9 buffer para lavados posteriores, vertiendo directamente en el tubo cónico de 15 ml. Los gusanos se establecieron en la parte inferior del tubo debe ser mezclado en el buffer M9 en su adición. Si los gusanos se mantuvo resuelto, invierta suavemente el tubo para mezclar. - Después del tercer lavado, utilizar parte de la población de gusano para ingenuos ensayos de quimiotaxis (Sección 5).
Nota: Es muy importante trabajar con bastante rapidez en todas las etapas de lavado, como los gusanos comienzan a morir de hambre si se sientan demasiado tiempo en M9 buffer, que puede aumentar la quimiotaxis ingenua hacia la butanona. - Agregar 3-4 ml de buffer M9 al tubo cónico de 15 ml, que los gusanos de hambre en el buffer M9 a temperatura ambiente durante 1 hora (Figura 1 B, C).
3. A corto plazo la memoria asociativa (masa) de formación
Ver Figura 1 B a corto plazo del flujo de trabajo asociativo ensayo de la memoria.
- Al final del período de hambre en el buffer M9 (Sección 2), racha de 2 l de 10% butanona (en EtOH al 95%) en el interior de las tapas de 60 mm de crecimiento media de nematodos (NGM) 11 placas que han sido sembrados con 500 l E. OP50 coli.
Nota: A la población de partida para los ensayos de la memoria a corto y largo plazo es ≥ 500 l de gusanos. Múltiples placas de acondicionamiento es necesario por genotipo para apoyar a toda la población durante el entrenamiento. Cuando se trabaja con productos químicos volátiles, sólo abre las tapas de las placas cuando sea necesario, lo que les cerró todas las otras veces. - Eliminar el sobrenadante buffer M9 del tubo cónico de 15 ml de gusanos hambrientos por el vacío y el uso de una Pipetman P1000 aplicar 100-200 L de gusanos a las placas de acondicionamiento.
Nota: Trate de eliminar el líquido M9 tanto como sea posible, de manera que los gusanos pueden rápidamente llegar a la fuente de alimento OP50 cuando se transfiere a las placas de acondicionamiento. Los gusanos se adhieren al interior de la punta de la pipeta y se puede conservar con la pipeta volúmenes más pequeños. - Incubar las placas acondicionado a temperatura ambiente durante 1 hora (fig. 1B).
- Lavar los gusanos en platos con ~ 1 ml de tampón M9 en un tubo cónico de 15 ml. Vamos a resolver los gusanos por la gravedad. Lavar a continuación 1-2X hasta buffer M9 en el tubo está claro.
Nota: Utilizar los métodos suaves de lavado descrito en la sección2. El mismo tubo de 15 ml cónicos se puede utilizar de la Sección 2. - Después del lavado final, separar el sobrenadante buffer M9 al vacío, y el uso de parte de la población de gusanos para los ensayos de quimiotaxis (Sección 5) para la prueba de 1x (masa) el aprendizaje asociativo de la asociación de los alimentos inmediatamente después de butanona acondicionado (0 puntos minutos de tiempo ).
Índice de Aprendizaje (LI) = CI 0 hr - CI Naive. - Transferir el resto de la población de lombrices a 60 mm NGM placas sembradas con 500 l de OP50 (mantener las placas). Una vez más, se aplican 100 a 200 l de gusanos por placa para asegurarse de que son las bacterias lo suficiente como para apoyar a la población.
Nota: El número de las placas de mantener utilizados por genotipo es por lo menos el número de puntos a corto plazo de la memoria asociativa tiempo para hacerse la prueba. - Incubar acondicionado después de las placas de 0,5, 1 ó 2 horas (a corto plazo de tiempo la memoria asociativa puntos) a temperatura ambiente (fig. 1B).
Nota: A corto plazo la memoria asociativa de animales de tipo salvaje termina por 2 horas después del entrenamiento. Los puntos de tiempo puede ser necesario ajustar para diferentes genotipos o las condiciones. - Para la prueba de memoria a corto plazo asociativa de la asociación de los alimentos-butanona, después de cada punto del tiempo, lave los gusanos de las placas en un tubo cónico de 15 ml y otra vez 1-2X con buffer M9. El uso de gusanos de ensayos de quimiotaxis (Sección 5). Índice de Aprendizaje (LI) = CI punto en el tiempo - CI Naive.
Nota: Utilizar los métodos de lavado suave en la Sección 2. Para cada momento, descartar cualquier gusanos adicionales que no se utilizan en los ensayos de quimiotaxis.
4. A largo plazo de la memoria asociativa (espacio) Capacitación
Ver Figura 1C a largo plazo del flujo de trabajo asociativo ensayo de la memoria.
- Siga los pasos 3.1 a 3.2 en la Sección 3.
- Incubar las placas acondicionado a temperatura ambiente durante 30 minutos (fig. 1C).
- Siga el paso 3.4 en la Sección 3.
Nota: Para permanecer dentro de un plazo de 30 minutos, se puede empezar todos los lavados durante el entrenamiento en ~ 25 minutos. - Después del último lavado, eliminar M9 sobrenadante por los gusanos de vacío y la transferencia a la cabeza de serie 60 placas NGM mm.
Nota: El uso de múltiples placas por genotipo no es necesario en este paso, ya que los gusanos se mueran de hambre. - Morir de hambre en 60 mm NGM placas a temperatura ambiente durante 30 minutos (fig. 1C).
- Lavar los gusanos con buffer M9 en el tubo cónico de 15 ml. Vamos a resolver por la gravedad de los gusanos (NO centrífuga).
Nota: Si bien no debe haber bacterias en el buffer en este punto, la centrifugación puede ser un tratamiento potencialmente dañinos de los gusanos, y puede afectar a largo plazo la formación de recuerdos. - Repita los pasos 4.1-4.6 varias veces, hasta un total de 7 cuadras acondicionado y 6 cuadras de hambre se han completado (fig. 1C). (Ver Tabla 1 para una hoja de representante).
- Lave con cuidado los gusanos de las placas en el tubo cónico de 15 ml y otra vez 1-2X con buffer M9.
- Después del último lavado, use un poco de la población de lombrices para los ensayos de quimiotaxis (Sección 5) para la prueba de 7x (espacio) el aprendizaje asociativo de la asociación de los alimentos inmediatamente después de butanona acondicionado (0 punto en el tiempo una hora). Índice de Aprendizaje (LI) = CI 0 hr - CI Naive.
- Transferir el resto de la población de gusanos de placas de 100 mm HGM cabeza de serie con 1 ml de OP50 (mantener las placas). Una vez más, se aplican 100 a 200 l de gusanos por placa para asegurarse de que son las bacterias lo suficiente como para apoyar a la población.
Nota: El número de las placas de mantener utilizados por genotipo es por lo menos el número de puntos a largo plazo de la memoria asociativa tiempo para hacerse la prueba. 100 mm NGM placas también pueden ser utilizados como placas de acondicionamiento post, pero hay que tener mucho cuidado de que hay suficiente OP50 apoyar a la población de gusanos por lo menos durante 16 horas. - Incubar acondicionado después de las placas durante 16, 24 y 40 horas (a largo plazo los puntos de tiempo asociativa de la memoria) a 20 º C (Figura 1 C).
Nota: a largo plazo de la memoria asociativa de animales de tipo salvaje termina 40 horas después del entrenamiento. Los puntos de tiempo puede ser necesario ajustar para diferentes genotipos o las condiciones. - Para poner a prueba a largo plazo de la memoria asociativa de la asociación de los alimentos-butanona, lave los gusanos de las placas en un tubo cónico de 15 ml y otra vez 1-2X con buffer M9 después de cada punto del tiempo. El uso de gusanos de ensayos de quimiotaxis (Sección 5). Índice de Aprendizaje (LI) = CI punto en el tiempo - CI Naive.
Nota: Utilizar los métodos de lavado suave en la Sección 2. Para cada momento, descartar cualquier gusanos adicional no utilizado en los ensayos de quimiotaxis.
5. Quimiotaxis de ensayo
- Preparar las placas de ensayo de quimiotaxis. Marque la parte inferior de la cabeza de serie placas de 100 mm NGM con manchas en la parte inferior y laterales de cada uno de la placa (Figura 2A).
Nota: Por lo menos 3 repeticiones por genotipo se debe ejecutar para obtener resultados estadísticamente significativos. - Spot 1 l de 1 M NaN 3 en el olor ycontrol in situ (Figura 2B).
Nota: No mancha sus platos con este agente paralizante más de 15 minutos antes de comenzar el ensayo, o la NaN 3 se difundirá lejos de los lugares, y los animales se quedan paralizados antes de llegar al olor o puntos de control. Tenga cuidado de no perforar el agar al aplicar NaN 3, ya que los gusanos se entierran en zonas perforado. - Mientras que los gusanos se están instalando en el tubo cónico, después de varios lavados de buffer M9 (Sección 2), punto 1 l cada uno de EtOH al 95% y 10% butanona (ver sección 7.2) en los lugares apropiados en la placa de ensayo marcada (Fig. 2C) en parte superior de la anteriormente visto NaN 3.
Nota: Los productos químicos deben ser vistos antes de añadir que los gusanos (sección 5.4). Tome nota de que ha lugar o EtOH butanona. Cuando se trabaja con estos productos químicos volátiles, tenga cuidado de abrir sólo la tapa de las placas cuando sea necesario, y mantenerlo cerrado en cualquier otro momento. - Eliminar la mayor cantidad de buffer M9 como sea posible del tubo de gusanos se establecieron. Use un Pipetman P20 con una punta de pre-corte (ver sección 7.3) para ofrecer 3X 5 gusanos l (200-400 animales) con el origen de la placa de ensayo marcada (Figura 2).
Nota: Mantenga los gusanos en el tubo cónico de 15 ml para su uso en pre-acondicionamiento de morir de hambre y los ensayos de la memoria (Secciones 2-4). Los gusanos se pegan dentro de puntas de pipeta, de modo que la adición de los gusanos de la placa en pequeñas cantidades conserva su población de lombrices y reduce la cantidad de líquido que se libera con los gusanos en la placa de ensayo. - Torcer la esquina de una KIMWIPE a un punto pequeño y lo utilizan para borrar el exceso de buffer M9. Esto liberará a los gusanos en la placa de ensayo (Figura 2E).
Nota: Tenga cuidado de no perforar el agar con la KIMWIPE, de lo contrario los gusanos madriguera en el origen. Algunos gusanos se pueden perder en este paso, ya que se entró en el KIMWIPE con el buffer M9 cuando secante. Si utiliza imágenes y análisis de conteo de los gusanos (Sección 6), tomar placas de la estación de imagen antes de soltar los gusanos desde el origen. Una imagen de los gusanos en el origen inmediatamente después de la liberación se obtiene el número total de animales de una placa de ensayo. - Incubar la placa de ensayo de quimiotaxis durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Cuente el número de gusanos en el origen, EtOH, y los puntos butanona (Figura 2), así como el número total de gusanos en la placa de ensayo.
Nota: Generalmente, los gusanos paralizados por NaN 3 será dentro de un radio de 1 cm ~ de los puntos, y aparecerá palo recto, con muchos animales apilados unos contra otros. Si utiliza imágenes y software de análisis para contar con los gusanos (Sección 6), tomar imágenes de su origen, EtOH, y los puntos butanona. Una imagen de la cantidad total de gusanos que se han tomado en la sección 5.5. Los gusanos pueden también ser "contadas a mano." - Calcular el "índice de quimiotaxis" (CI). IC = ([(n butanona) - (n EtOH )]/[( total-n de Origen)].
6. Gusano Contar de Análisis de Imágenes
- Tome negro de alto contraste en blanco y las imágenes de los gusanos en las placas de ensayo de quimiotaxis (Figura 3A, consulte la sección 7.4 para la descripción de la configuración de la cámara). Para calcular el índice de quimiotaxis, las imágenes son necesarias en la butanona, EtOH, y los puntos de origen de una placa de ensayo de quimiotaxis al final de un ensayo, así como el número total de lombrices (gusanos en la imagen de origen inmediatamente después de ser liberado de la M9 buffer al comienzo del ensayo, la sección 5.5).
Nota: Las imágenes de las placas de ensayo de quimiotaxis que cubre un radio de 2 cm alrededor de cada punto en general, la captura de todos los animales de cada mancha. - Asegúrese de que los archivos de todos los ensayos de un momento determinado (por ejemplo, Naive, 0 horas, etc) están contenidas en una carpeta, llamada apropiadamente.
- Archivos para cada placa de quimiotaxis debe ser mencionado como tal, pero # png (spot butanona, prueba #), # ori png (origen, prueba #), eth # png (lugar de etanol, prueba #), tot # png.... (total, prueba #). (Por ejemplo, si dos ensayos se centraron en un punto del tiempo, en la misma carpeta que los archivos siguientes se presentan: but1.png, but2.png, eth1.png, eth2.png, ori1.png, ori2.png, tot1 . png, tot2.png)
- Abra Matlab (ver sección 7.5).
- En el "Directorio actual" línea en la parte superior de la ventana de Matlab, para navegar por carpetas y elija la opción "count_worms_v0.5.3 carpeta" (M-archivos como información complementaria).
- En la "Ventana de comandos", tipo "count_worms_directory ()". Pulse la tecla Enter.
Nota: El tamaño del gusano por defecto cuando de este comando es de 10 minutos, max 80 píxeles. Para ajustar esta basado en un genotipo específico o etapa de desarrollo, de tipo "count_worms_directory ('minsize', 10 'maxsize, 80)" y cambie el número de píxeles en consecuencia. - Cuando se le pida, seleccione la carpeta de imágenes para ser analizadas.
Nota: Sólo una carpeta de imágenes pueden ser analizadas a la vez. - Cada imagen en la carpeta que se analiza se abrirá con un umbral ya establecido, y las partículas seleccionadas (Figura 3). Arrastre la herramienta rectángulo sobre partículas seleccionadas que no son gusanos eliminar ªem. Cuando haya terminado con la imagen, pulse la tecla Esc.
- Después de todas las imágenes en la carpeta se comprueban, 4 columnas aparecerán en la ventana de comandos: (1) nombre de la imagen (por ejemplo but1), (2) siempre "[1]," (3) el tamaño medio de píxel de un gusano calculado por el el programa de la imagen en particular, y (4) el número de gusanos calcula que en la imagen.
- Una vez que este programa se ha ejecutado, se depositará dos. Csv (se puede abrir como hojas de cálculo Excel) en la carpeta de imágenes que acaba de analizar. El "worm_counts_stats" archivo proporciona las columnas de salida en la ventana de comandos (sección 6.9). El "worm_counts_summary" archivo proporciona cinco columnas: (1) Número de prueba, el número de gusanos en (2), pero, ETH (3), y (4) puntos de ori, y (5) el número total de gusanos.
7. Notas de los materiales
- Para la preparación de 100 medios de comunicación mm de alto crecimiento (HGM) placas (sección 1): Disolver 3 g de NaCl, 20 g Bactopeptona, y 30 g de Bacto-agar en 700 ml de agua destilada. Alcanzar un volumen de 1 litro con agua destilada. Después del autoclave, agar fresco a 65 ° C y añadir 4 ml de 5 mg / ml de colesterol en etanol, 1 ml cada una de 1 M de CaCl 2, 1 M MgSO 4, y 25 ml de 1 M KPO 4 (pH = 6,0).
- 95% EtOH se utiliza, como una mayor EtOH porcentaje tiende a contener impurezas en el proceso de purificación que pueden afectar los resultados. Es una buena idea para hacer la butanona 10% (en el 95% de EtOH) abastecerse de nuevo cada pocas veces se realiza esta prueba.
- P20 consejos deben tener unos pocos milímetros de corte para crear un agujero lo suficientemente grande para los gusanos para pasar a través sin sufrir daños. P1000 consejos ya tienen agujeros lo suficientemente grandes como para los gusanos para pasar a través.
- La quimiotaxis de ensayo de placa de imagen estación (Figura 3B) en el laboratorio de Murphy contiene una cámara Firewire con una lente de aumento variable sujeto a una base de auge. Una luz de fondo se coloca en la parte inferior del soporte por debajo de una plataforma de imágenes personalizadas con una tapa de cristal (Figura 3C), que permite que las placas de quimiotaxis de ensayo para ser iluminados desde la parte inferior. "Medición y Automatización" de software (National Instruments) se utiliza para capturar imágenes. Los materiales para esta estación de imagen creado son similares a los publicados anteriormente, 12 y se pueden encontrar en la tabla de reactivos y equipos específicos.
8. Los resultados representativos:
Un índice de quimiotaxis típica ingenuo (CI) de tipo salvaje gusanos el 10% butanona es de alrededor de 0,2 (Figura 4). 6 Se congregaron (1x) o en el espacio (7x) formación general, aumenta el índice de quimiotaxis de 0.7-0.8 en el momento 0 (Figura 4A, CD) para obtener un índice de aprendizaje (LI = entrenados CI -. ingenuo CI) de ~ 0.6 6 El aprendizaje que ocurre con la formación de masa o en el espacio es muy robusto. A LI de menos de 0,5 por lo general se presenta cuando hay problemas con el ensayo de quimiotaxis ingenuo, y los animales tienen un CI ingenua de 0,3 o superior. Por lo general, esto ocurre porque los gusanos se mueren de hambre o demasiado lleno de gente en las placas de cultivo entre el blanqueo y el comienzo del ensayo, o gusanos pasar mucho tiempo en el buffer M9 entre los mismos y comienzan a morir de hambre, los olores del medio ambiente también pueden aumentar los ingenuos CI. Gusanos hambrientos tienen una mucho mayor CI ingenua de un 10% butanona (Figura 4). 6 encontramos que los problemas con la quimiotaxis ingenuo en general se resuelven con el cuidado y cultivo de lombriz mejora.
La duración de la memoria en estos ensayos es el tiempo que toma para el índice de quimiotaxis inmediatamente después del entrenamiento para volver a los niveles de ingenuo, cuando el índice de aprendizaje = 0. En animales salvajes, a corto plazo la memoria asociativa típicamente comienza a disminuir en 1 hora después de la capacitación masiva, dura aproximadamente 2 horas, y es independiente del factor de transcripción CREB (Figura 4C). 6 a largo plazo de la memoria asociativa normalmente no comienza a disminuir significativamente hasta 16 horas después de la capacitación espacio, dura hasta 40 horas, y es dependiente de CREB (Figura 4) 6 a largo plazo de la memoria asociativa no podrá alcanzar su pleno potencial en varios casos: (1). gusanos no tienen suficiente OP50 E. coli durante los períodos de acondicionamiento de 30 minutos, (2) las bacterias permanecen en el búfer de M9 durante los períodos de hambruna, o (3) los gusanos han sido dañados durante el ensayo (por ejemplo, los gusanos son una pipeta contra la pared del tubo).
Los resultados son en general estadísticamente significativa cuando cuatro o más ensayos ensayo de quimiotaxis se ejecutan por genotipo por cada punto del tiempo. Ejecución de seis repeticiones por genotipo normalmente da resultados muy significativos sin llegar a ser muy difícil de controlar, sin embargo, los principiantes pueden querer empezar con sólo tres repeticiones. Por lo general, trabajando con genotipos 2-3 o condiciones a la vez sea cómodo para aquellos que tienen experiencia con estos ensayos el aprendizaje y la memoria.
Contar a mano los gusanos en las placas de ensayo de quimiotaxis es mucho tiempo, puede agregar la variabilidad entre los experimentos de laboratorio o de los compañeros, y también puede introducir sesgos en el análisis y la interpreting datos. Gusano contar por análisis de imagen (Sección 6) normaliza la recolección de datos y análisis a través del laboratorio, y en promedio, reduce el tiempo de análisis de datos para los miembros del laboratorio con experiencia a 1 / 5 de la necesaria para el recuento de la mano. Al comparar los índices de quimiotaxis calcula utilizando conteos manuales gusano a los determinados por el software Count_worms, nos encontramos con un error promedio de 3,07 (± 1,19)%.
| Día 1 | |
| Tiempo | Paso |
| 09:00 | 1 hora mueren de hambre en buffer M9 Inicio ingenuo ensayo de quimiotaxis |
| 10:00 | Condición # 1 (60 mm NGM placas con los alimentos y butanona), 30 min Final ingenuo quimiotaxis ensayo |
| 10:30 | Morir de hambre # 1 (60 mm placas NGM), 30 min |
| 11:00 | Condición # 2, 30 min |
| 11:30 | Morir de hambre # 2, 30 min |
| 12:00 | Condición # 3, 30 min |
| 12:30 | Morir de hambre # 3, 30 min |
| 01:00 | Condición # 4, 30 min |
| 01:30 | Morir de hambre # 4, 30 min |
| 02:00 | Condición n º 5, 30 min |
| 02:30 | Morir de hambre # 5, 30 min |
| 03:00 | Condición # 6, 30 min |
| 03:30 | Morir de hambre # 6, 30 min |
| 04:00 | Condición n º 7, 30 min |
| 04:30 | Comience 0-hr quimiotaxis de ensayo Transferencia de gusanos restantes para mantener las placas de 16 a 40 hrs |
| 05:30 | Final 0-hr quimiotaxis ensayo |
| Día 2 | |
| Tiempo | Paso |
| 08:30 | Comenzar 16 horas quimiotaxis ensayo |
| 09:30 | Final de 16 horas la quimiotaxis de ensayo |
Tabla 1. Horario Representante a largo plazo del ensayo de la memoria asociativa. En este ejemplo, el ensayo comienza el día 1 a las 9 am con una 1 hora de morir de hambre. 30 min condición y períodos de hambre se alternan hasta que los gusanos se han acondicionado siete veces. Ensayos de quimiotaxis se ejecutan al inicio (ingenuo) y final (0 horas) de formación. El total de tiempo de ejecución de principio a fin es de 8,5 horas. Gusanos en las placas de mantener, son la prueba de la quimiotaxis de butanona a partir del día 2, 16-40 horas después del entrenamiento.
Figura 1. A corto y largo plazo del flujo de trabajo de la memoria asociativa ensayo. (A) recomendados línea de tiempo de preparación previo a los ensayos se llevan a cabo día. (B) a corto plazo ensayo de la memoria asociativa: gusanos hambrientos están condicionados por 1 hora y prueba de inmediato para el aprendizaje de 1x (0 min.) A través de ensayos de quimiotaxis, o transferidos a placas de sujeción con los alimentos por 0,5, 1 o 2 horas después del acondicionamiento. (C) a largo plazo del ensayo de la memoria asociativa: los animales hambrientos reciben siete bloques de entrenamiento de acondicionamiento / muriendo de hambre antes de ser probado para el aprendizaje o LTAM 16-40 horas después del entrenamiento.
Figura 2. Configuración Quimiotaxis ensayo. (A) Esquema de la placa de ensayo de quimiotaxis. Pequeñas manchas se agregan a la placa con la ayuda de una regla u otro dispositivo de guía para marcar el origen (abajo) y butanona y EtOH (izquierda y derecha) puntos en la placa. (B) 1 l NaN 3 se añade a los lugares de butanona y EtOH. (C) 1 l cada uno de 10% butanona y un 95% EtOH se suman los puntos en el lado izquierdo o derecho de la placa. (D) 200 a 400 gusanos suspendido en buffer M9 se agregan al origen de la placa. (E) A KIMWIPE trenzado en un punto se utiliza para absorber buffer M9 y los gusanos de liberación en la placa de ensayo.
Figura 3. Gusano de contar con análisis de imágenes. (A) Ejemplo de "count_worms_v0.5.3" ventana de selección de imágenes de partículas. El programa se abre la imagen original de negro de alto contraste en blanco y (izquierda) aparece automáticamente una ventana con una imagen de un umbral (centro). La herramienta rectángulo se puede utilizar para resaltar y eliminar el gusano no deseados "partículas", tales como marcas de placa de ensayo (1), los bordes de placa (2), o perforaciones en agar (3). (B) Imagen de la estación de Murphy de laboratorio de imagen quimiotaxis de ensayo. Placas de quimiotaxis ensayo se ilumina desde la parte inferior para crear imágenes de alto contraste para el análisis. (C) Esquema de la medidaplataforma de imagen utilizado en la estación de imágenes quimiotaxis.
Figura 4. Típica de aprendizaje asociativo y los resultados de la memoria. (A) El ingenuo quimiotaxis índice de tipo salvaje gusanos a los aumentos de 10% butanona en masa (1x) de formación. La asociación aprendida se requiere la vinculación de los alimentos (OP50 E. coli) y butanona. Números sobre las barras representan el "Índice de Aprendizaje" (LI = CITrained - CI Naive). (B) Los pies en la quimiotaxis de tipo ingenuo al 10% butanona se incrementa cuando los gusanos son muertos de hambre durante 16 horas. AD paneles son una adaptación de Kauffman et al., 2010. 6 (C) de tipo silvestre a corto plazo la memoria asociativa dura aproximadamente 2 horas, y es independiente del factor de transcripción CREB. (D) de tipo silvestre a largo plazo de la memoria asociativa dura aproximadamente 40 horas, y es dependiente de CREB.
Información Suplementaria
Discussion
El C. elegans olfativo aprendizaje asociativo y los ensayos de la memoria que aquí se presenta una distinción entre los procesos de aprendizaje masivo, el aprendizaje de espacio, memoria a corto plazo y memoria a largo plazo. Estos ensayos se basan en las capacidades de los gusanos para detectar olores de los alimentos y productos químicos en su entorno y 1,2 para formar asociaciones positivas entre los dos. 6 Por tanto, los ensayos son muy sensibles a la inanición de la población a partir de los animales, y que mucho cuidado tomarse medidas para garantizar que los gusanos están bien alimentados antes y después del entrenamiento. Formación masa única rendimientos a corto plazo la memoria asociativa. El aumento del número de períodos de acondicionamiento y el paradigma de la capacitación espacio es esencial para lograr a largo plazo de la memoria asociativa en C. elegans como lo es en otros organismos. 6,8 Tal vez este ensayo podría ser modificado para producir memoria a largo plazo de las asociaciones entre los diferentes estímulos condicionados e incondicionados.
Nuestro aprendizaje asociativo y los ensayos de memorias puede ser utilizado para comparar las capacidades de aprendizaje y la memoria de tipo salvaje de los animales mutantes envejecimiento o la genética. Por ejemplo, mientras que tanto el aprendizaje asociativo y la memoria a largo plazo asociativo disminución habilidades en el envejecimiento de los gusanos de tipo salvaje, el aprendizaje se mantiene por más tiempo con la edad en los animales con la señalización de insulina reducida, y el aprendizaje y la memoria se mantiene por más tiempo con la edad en los animales de restricción calórica. 6 Estos ensayos también son susceptibles de tratamiento RNAi o la manipulación farmacológica de la C. elegans. Por ejemplo, el tratamiento de gusanos con el daf-2 RNAi mejora a corto y largo plazo la memoria asociativa, por el contrario, el bloqueo de la transcripción de genes y la síntesis de proteínas con las drogas (actinomicina D y cicloheximida, respectivamente) durante el entrenamiento espaciados interrumpe a largo plazo la formación de recuerdos. 6
Memoria a largo plazo es un proceso que es crucial para la supervivencia de todos los animales, y parece que gran parte de la maquinaria molecular implicada en la memoria de una asociación pavloviana se conserva desde los gusanos hasta los mamíferos. 6 La capacidad de distinguir y test de aprendizaje asociativo, a corto plazo y la memoria a largo plazo con estos ensayos olfativos C. elegans un excelente sistema para el estudio adicional de la memoria, y puede dar una idea de los procesos neurodegenerativos que conducen a la pérdida de aprendizaje y la memoria en los seres humanos.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a W. Ryu para el consejo sobre nuestra imagen de la configuración inicial, Z. Gitai por la sugerencia de utilizar ImageJ 13 para contar los gusanos, y J. Ashraf ayuda con Google SketchUp. CTM es un erudito de Pew en las ciencias biomédicas, un erudito de McKnight, y un erudito de Keck.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | S227 | Prepare 1 M concentration in distilled water |
| Ethyl Alcohol 190 Proof | Pharmco-AAPER | DSP-CT-18 | >95% Ethanol may have impurities that interfere with chemotaxis assays |
| 2-Butanone 99+% | Acros Organics | 14967-0010 | |
| Basler IEEE-1394/FireWire Area Scan CMOS Camera | Edmund Scientific | NT56-683 | |
| InfiniMite Video Lens – Alpha Industrial | Edmund Scientific | NT56-202 | |
| Dolan-Jenner MI-150 Fiber Optic Illuminator | Edmund Scientific | NT55-718 | |
| 8” x 8” Backlight | Schott AG | A08927 | |
| Standard Boom Stand | Edmund Scientific | NT54-120 | |
| 3/4” Post Adaptor for Boom Stands | Edmund Scientific | NT54-124 | |
| Standard Fixed 1/4-20 Mounting Plate | Edmund Scientific | NT54-122 |
References
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74, 515-515 (1993).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 817-817 (1973).
- Bono, M. de, Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu Rev Neurosci. 28, 451-451 (2005).
- Mori, I. Genetics of chemotaxis and thermotaxis in the nematode Caenorhabditis elegans. Annu Rev Genet. 33, 399-399 (1999).
- Zhang, Y., Lu, H., Bargmann, C. I. Pathogenic bacteria induce aversive olfactory learning in Caenorhabditis elegans. Nature. 438, 179-179 (2005).
- Kauffman, A. L. Insulin signaling and dietary restriction differentially influence the decline of learning and memory with age. PLoS Biol. 8, e1000372-e1000372 (2010).
- Torayama, I., Ishihara, T., Katsura, I. Caenorhabditis elegans integrates the signals of butanone and food to enhance chemotaxis to butanone. J Neurosci. 27, 741-741 (2007).
- Silva, A. J., Kogan, J. H., Frankland, P. W., Kida, S. CREB and memory. Annu Rev Neurosci. 21, 127-127 (1998).
- Meyer, F. Iterative image transformations for an automatic screening of cervical smears. J Histochem Cytochem. 27, 128-128 (1979).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, 62-62 (1979).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-71 (1974).
- Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. Dimensionality and dynamics in the behavior of C. elegans. PLoS Comput Biol. 4, e1000028-e1000028 (2008).
- Abramoff, M. agelhaes, Ram, P. J., J, S. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-36 (2004).
