Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

C. elegans Pozitif bütanon Öğrenme, Kısa vadeli ve uzun vadeli ilişkilendirilebilir Bellek Tahliller

Published: March 11, 2011 doi: 10.3791/2490
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Biology, Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics, Princeton University, 2Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics, Princeton University

Summary

Burada yöntemleri C. elegans ilişkisel öğrenme ve kısa ve uzun vadeli çağrışımlı hafıza test etmek için açıklayın. Bu nüfus Testler uçucu koku doğru chemotax solucanlar yetenekleri istihdam ve kemoatraktan bütanon gıda eşleştirme üzerine olumlu dernek kurma. Klima dönemlerinin sayısının artırılması uzun vadeli bellek neden olur.

Abstract

Deneyimler ve öğrenilen bilgilerin bellek organizmaların hayatta kalma yardım seçimler yapmak için kritik C. elegans, gıda ve kimyasal kokular 1, 2 nöron spesifik algılama ile çevresi gider ve kimyasal kokular 3, sıcaklık 4, bir besin kaynağı 5 patojenite ile besleyici devletler ilişkilendirebilirsiniz .

Burada, C. elegans ilişkisel öğrenme ve kısa ve uzun vadeli çağrışımlı hafıza testleri açıklar. Bunun yerine olumlu bir yanıt üretmek için bir caydırıcı koku alma bir öğrenme paradigması 6 değiştirilmiş; tahlil ~ 400 solucanlar açlıktan sonra AWC nöron algılanan (düşük kemotaktik indeksi ortaya çıkarır konsantrasyonda uçucu kemoatraktan bütanon benzer varlığı, solucanlar beslenme Toroyama ve ark. 7). Standart bir nüfus assay1 testler solucanları hemen odorant veya klima sonra saat birkaç dakika için 'cazibe kemotaksis.

Bütanon artar klima, yabani tip hayvanların kemotaksis sonra ~ 0.6 Kemotaksis İndeksi üniteleri, "Öğrenme Endeksi". Ilişkilendirilebilir öğrenme, eğitim sırasında hem de yiyecek ve butanon varlığına bağlıdır. Tek bir klima döneminde ("massed eğitim") için yiyecek ve butanon Eşleştirme ~ 2 saat süren kısa vadeli çağrışımlı bellek üretir. ("Aralıklı eğitim") arasında dinlenme süreleri ile birden fazla klima süreler, uzun vadeli ilişkisel bellek (<40 saat) verim ve cAMP Tepki element bağlayıcı protein (CREB), 6 boyunca uzun süreli bellek için gerekli bir transkripsiyon faktörü bağımlı türler 8

Bizim protokolü aynı zamanda, hızlı ve doğru bir şekilde belirlenmesi için kemotaksis endeksleri görüntü analiz yöntemleri içerir. Kemotaksis assay tabaklarda hayvan Yüksek kontrastlı görüntüler MatLab solucan sayma yazılım tarafından yakalanır ve analiz edilir. Bu yazılım bir morfolojik tophat dönüşüm kullanarak düzensiz arka plan düzeltir. 9 Otsu Kullanıcı yöntemi daha sonra arka plan ayrı solucanlar bir eşik belirlemek için kullanılır.. 10 Çok küçük parçacıklar olmayan-solucan bölgelerde (plaka kenarlar veya agar yumruklar) otomatik olarak kaldırılır ve daha büyük olan. manuel seçim kaldırıldı. Yazılım sonra belirli bir maksimum boyutu üzerinde olduğu bölgelerde kalan bölgelerin ortalama boyutu göz ardı ederek ve tek bir solucan boyutunu tahmin ediyor. Solucanlar sayı daha sonra tahmini boyutu tek bir solucan solucanlar tarafından işgal edilmiş olarak tanımlanan toplam alana bölünmesi ile tahmin edilmektedir.

Biz öğrenme ve kısa ve uzun vadeli bellek ayırt edilebilir olduğunu bulduk ve bu süreçlerin yüksek organizmalar ile benzer anahtar molekülleri paylaşmaktadırlar. 6,8 testlerin hızlı roman aday genler veya öğrenme ve kısa veya uzun etkileyen moleküller test edebilirsiniz C ile vadeli bellek Türler arası ilgili elegans.

Protocol

Bu C. elegans ilişkisel öğrenme ve hafıza testleri önceden hazırlık gerektirir. Bir hazırlık programı için zaman çizelgesi Şekil 1A sunulan bakın. Ayrıca solucanları 'anılar fiziksel ajitasyon (kaba pipetleme, santrifüj, vorteks) tarafından rahatsız olabileceğine dikkat edin ve o naif kemotaksis ortamda aşırı kokular (parfüm, vs.) Tarafından rahatsız olabilir.

1. Tahlil için Hayvan hazırlanması

  1. 100 mm yüksek büyüme ortam (HGM) plakaları solucanlar Yetiştirmek (tarifi için bakınız Bölüm 7.1) 1 ml OP50 E. ile seeded standart yöntemler kullanılarak coli 11
  2. Gravid erişkin solucanlar en az iki yoğun nüfuslu HGM plakaları Hipoklorit, büyük bir yumurta senkronize nüfus elde etmek için tedavi.
    Not: en iyi verim için, çamaşır suyu, ilk nesil sonra sonraki adım için yumurta elde etmek için ağartıcı, ikinci nesil Gün 2 yetişkin olarak son derece senkronize bir nüfus elde etmek için.
  3. Eşit 1 ml OP50 E. numaralı seribaşı 3-4 HGM plakaları üzerine yumurta bölmek coli için her hipoklorit plaka davrandı.
    Not: açlık koku alma testlerinin sonuçlarını etkileyebilir solucanlar bol miktarda taze gıda ile ekili olduğu önemlidir.
  4. , Yaklaşık 72 saat süreyle 20 ° C'deki hayvanlar genç yetişkin aşamasında ulaşmak için gereken süreyi solucanlar inkübe edin.

2. Ön klima açlıktan

  1. Çift solucanlar hala bol gıda emin olmak için genç yetişkinler ile HGM plakaları kontrol ve tahlil için yeterli solucanlar (tahlil plaka başına ≥ 200 solucanlar) olduğunu.
  2. 15 ml konik bir tüp içine M9 tampon 11 HGM tabak solucanlar yıkayınız . Yıkama sırasında en ajitasyon için, yavaşça HGM plaka üzerine bir kaç mililitre dökerek M9 tampon uygulamak ve yavaşça girdap yapışkan OP50 bakterilerden solucanlar plaka. Ardından, plaka eğme P1000 Pipetman kullanarak plaka köşesinden M9 tampon / solucan karışımı yukarı çekin ve 15 ml konik tüp solucanları transfer. Solucanlar hala plaka üzerinde bırakılırsa, 1-2X bu adımı tekrarlayın.
    Not: Kaba solucanları tüp içine yapabilirsiniz plaka püskürmesi bakteri yıkama. Bu bakteri kurtulmak ve deneyleri müdahale mümkün değildir. Solucanlar hasar ve deneyleri ile müdahale gibi, tüpün kenarına solucanlar pipetle ETMEYİN.
  3. Solucanlar (santrifüj BASMAYIN) yerçekimi tarafından razı olsun. Vakum ile süpernatantı alın ve en az 3-4 ml M9 ile yıkayın. Toplam 3 yıkar için 2X tekrarlayın.
    Not: yıkama sırasında Santrifüj testleri ile karışabilir solucan nüfus, herhangi bir kalan bakteriler aşağı çeker. Bunun yerine, 15 ml konik tüp içine doğrudan dökerek hafifçe sonraki yıkar M9 tampon eklemek. Worms tüpün alt kısmında yerleşmiş olan ek üzerine M9 tampon karışık haline gelmelidir. Solucanlar yerleşti kaldı, hafifçe karıştırın tüp ters.
  4. Üçüncü bir yıkamadan sonra, naif kemotaksisi testleri (Bölüm 5) bazı solucan nüfusun kullanın.
    Not: solucanlar bütanon doğru naif kemotaksis artırabilir M9 tampon, çok uzun oturup açlıktan başlayacak, tüm yıkama adımları oldukça hızlı çalışması için kritik öneme sahiptir.
  5. 15 ml konik tüp M9 tampon 3-4 ml, solucanlar (Şekil 1B, C) 1 saat oda sıcaklığında M9 tampon açlıktan sağlar.

3. Kısa vadeli ilişkilendirilebilir Bellek (kümelendiği) Eğitim

Şekil 1B kısa vadeli çağrışımlı bellek deneyi iş akışı için Bkz.

  1. M9 tamponu (Bölüm 2), 60 mm nematod büyüme ortamı (NGM) ile seeded 11 plakaları kapaklarının iç% 10 bütanon çizgi 2 mcL (95% EtOH) açlıktan dönemi sonunda 500 mcL OP50 E. coli.
    Not: kısa ve uzun vadeli bellek testleri için iyi bir başlangıç ​​nüfus ≥ 500 mcL solucanlar. Çoklu Klima plakaları eğitim sırasında tüm nüfusu desteklemek için genotip başına ihtiyaç vardır. Uçucu kimyasallar ile çalışırken, yalnızca onları diğer zamanlarda kapalı bırakarak, gerekli plakalar zaman kapakları açmak.
  2. Vakum ile hasret solucanlar 15 ml konik tüp M9 tampon süpernatantı ve P1000 Pipetman klima plakaları 100-200 mcL solucanlar uygulamak için kullanabilirsiniz.
    Not: Klima plakaları transfer solucanlar OP50 besin kaynağına hızlı bir şekilde alabilirsiniz, böylece, mümkün olduğunca çok M9 sıvı çıkarmak için deneyin. Worms pipet içine sopa ve küçük hacimli pipetleme tarafından korunacak.
  3. 1 saat (Şekil 1B) Klima plakaları oda sıcaklığında inkübe edin.
  4. 15 ml konik bir tüp içine ~ 1 ml M9 tampon plakalar solucanlar yıkayınız. Solucanlar yerçekimi dinlendiriniz. M9 tampon tüp netleşene kadar 1-2X tekrar yıkayın.
    Not: Bölüm açıklanan hassas yıkama yöntemleri kullanın2. Aynı 15 ml konik tüp Bölüm 2 kullanılabilir.
  5. Son yıkamadan sonra, vakum M9 tampon süpernatant kaldırmak ve (0 dakika zaman noktası, hemen Klima sonra (kümelendiği) (Bölüm 5) 1x için test etmek için gıda Butanon dernek ilişkisel öğrenme kemotaksis deneyleri için bazı solucan nüfus kullanmak .)
    Öğrenme Endeksi (YE) = CI 0 saat - CI Naive.
  6. OP50 500 mcL (tabak tutun) numaralı seribaşı 60 mm NGM plakaları solucanlar, geri kalan nüfus aktarın. Yine, plaka başına solucanlar 100-200 mcL nüfusu desteklemek için yeterli bakteri vardır sağlamak için de geçerlidir.
    Not: genotip başına kullanılan tutun plakaların sayısı, en azından test edilecek kısa vadeli çağrışımlı bellek zaman noktalarında sayıdır.
  7. Oda sıcaklığında (Şekil 1B) 0.5, 1 veya 2 saat (kısa vadeli çağrışımlı bellek zaman noktalarında) post-Klima plakaları inkübe edin.
    Not: Kısa vadeli vahşi hayvanların çağrışımlı bellek, 2 saat sonra eğitim sona erer. Zaman noktaları farklı genotipleri veya koşullar için ayarlanması gerekir.
  8. Gıda Butanon dernek kısa vadeli ilişkisel bellek için test etmek için, her zaman bir noktadan sonra, yavaşça 1-2X M9 tamponu ile tekrar 15 ml konik bir tüp içine plakaları kapalı solucanlar yıkayın ve . Solucanlar kemotaksis testleri (Bölüm 5) kullanın. Öğrenme Endeksi (YE) = CI Zaman noktası - CI Naive.
    Not: Bölüm 2'de açıklanan nazik yıkama yöntemleri kullanın. Her zaman noktası için, herhangi bir ekstra solucanlar kemotaksis deneylerde kullanılan atın.

4. Uzun vadeli ilişkilendirilebilir Bellek (Aralıklı) Eğitim

Şekil 1C, uzun vadeli çağrışımlı bellek deneyi bir iş akışı için Bkz.

  1. Bölüm 3 adımları izleyin 3,1-3,2.
  2. 30 dakika (Şekil 1C) Klima plakaları oda sıcaklığında inkübe edin.
  3. Bölüm 3 3.4 adım izleyin.
    Not: 30 dakikalık bir zaman dilimi içinde kalması için, bir ~ 25 dakika eğitim boyunca tüm yıkar başlayabilir.
  4. Son yıkamadan sonra, 60 mm NGM plakalar giremeyen vakum ve transfer solucanlar M9 süpernatant kaldırmak.
    Not: genotip başına birden fazla plakalar, solucanlar hasret olduğundan, bu aşamada gerekli değildir.
  5. 30 dakika (Şekil 1C) için oda sıcaklığında, 60 mm NGM plakalar üzerinde açlıktan ölüyor.
  6. M9 tamponu ile 15 ml konik tüp içine solucanlar yıkayın. Solucanlar (santrifüj BASMAYIN) yerçekimi tarafından razı olsun.
    Not: Bu noktada tampon hiçbir bakteri olması gerekir iken, santrifüj, potansiyel olarak zararlı solucanlar tedavi edilebilir ve uzun vadeli bellek oluşumu bozabilir.
  7. Tekrar bir toplam 7 klima blok ve 6 (Şekil 1C) tamamlanmıştır blokları açlıktan kadar 4,1-4,6 birkaç kez adım. (Temsili bir zaman çizelgesi için Tablo 1'e bakınız.)
  8. 1-2X M9 tampon yavaşça tekrar 15 ml konik tüp içine plakaları kapalı solucanlar yıkayın ve.
  9. Son yıkamadan sonra kemotaksisi testleri (Bölüm 5), 7x için hemen Klima sonra gıda bütanon derneği (0 saat noktası) (aralıklı) ilişkisel öğrenmeyi test etmek için bazı solucan nüfusun kullanabilirsiniz. Öğrenme Endeksi (YE) = CI 0 saat - CI Naive.
  10. OP50 1 ml (tabak tutun) numaralı seribaşı 100 mm HGM plakaları solucanlar, geri kalan nüfus aktarın. Yine, plaka başına solucanlar 100-200 mcL nüfusu desteklemek için yeterli bakteri vardır sağlamak için de geçerlidir.
    Not: genotip başına kullanılan tutun plakaların sayısı, en az, test edilmesi için uzun vadeli çağrışımlı bellek zaman noktalarında bir sayıdır. 100 mm NGM plakalar post-Klima plakaları olarak da kullanılabilir, ama biri en az 16 saat süreyle solucanlar nüfusu desteklemek için yeterli OP50 olduğunu çok dikkatli olmalıdır.
  11. 20oC (Şekil 1C) post-klima, 16 plaka, 24, ve 40 saat (uzun vadeli çağrışımlı bellek zaman noktalarında) inkübe edin.
    Not: Uzun vadeli vahşi hayvanların çağrışımlı bellek, 40 saat sonra eğitim biter. Zaman noktaları farklı genotipleri veya koşullar için ayarlanması gerekir.
  12. Gıda Butanon dernek uzun vadeli ilişkisel bellek için test etmek için her zaman bir noktadan sonra, yavaşça M9 tamponu ile 1-2X tekrar 15 ml konik bir tüp içine plakaları kapalı solucanlar yıkayın ve . Solucanlar kemotaksis testleri (Bölüm 5) kullanın. Öğrenme Endeksi (YE) = CI Zaman noktası - CI Naive.
    Not: Bölüm 2'de açıklanan nazik yıkama yöntemleri kullanın. Her zaman noktası için, kemotaksis deneylerde kullanılan herhangi bir ekstra solucanlar atın.

5. Kemotaksis Testi

  1. Kemotaksis tahlil tabak hazırlayın. Plakanın alt ve her iki tarafın (Şekil 2A) noktalar ile giremeyen 100 mm NGM plakaların alt işaretleyin.
    Not: istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için çalıştırılması gerekir genotip için en az 3 çoğaltır.
  2. Spot 1 odorant mcL ve 1 M NaN 3kontrol spot (Şekil 2B).
    Not: 15 dakikadan fazla tahlil başlamadan önce, bu felç edici ajan ile plakalar spot ya da NaN 3 noktalar dağılırdı, ve hayvanların odorant veya kontrol noktalar ulaşmadan önce felç olacak. Ponksiyon agar solucanlar delinmiş alanlarda burrow beri NaN 3 uygularken dikkatli olun.
  3. Solucanlar üzerinde işaretli tahlil plaka uygun noktalar (Şekil 2C) (bkz. Bölüm 7.2) birkaç M9 tampon yıkar (Bölüm 2), spot 1 mcL 95% EtOH ve% 10 bütanon sonra konik tüp içinde yerleşen iken önceden tespit NaN 3 top.
    Not: Kimyasallar, solucanlar (Bölüm 5.4) eklemeden önce lekeli olmalıdır. Spot EtOH veya bütanon sahip olduğu bir not edin. Bu uçucu kimyasallar ile çalışırken, sadece gerekli plakalar zaman kapaklarını açmak için dikkatli olmak ve onları diğer tüm zamanlarda kapalı tutun.
  4. Tüpten yerleşmiş solucanlar, mümkün olduğu M9 tampon kadar çıkarın. 5 mcL solucanlar 3X (200-400 hayvanlar) işaretli tahlil plaka (Şekil 2B) kökeni sağlamak için bir ön kesme ucu (Bkz. Bölüm 7.3) ile P20 Pipetman kullanın.
    Not: Ön klima kullanımı (Bölüm 2-4) açlıktan ve bellek testleri için 15 ml konik tüp içinde kalan solucanları tutun. Solucanlar Solucan nüfus korur ve tahlil tabağa solucanlar ile serbest bırakılır sıvı miktarını azaltır, böylece küçük miktarlarda plaka solucanlar ekleyerek pipet uçları içinde sopa olacak.
  5. , Bir KimWipe köşesinde küçük bir noktaya Twist ve aşırı M9 tampon blot için kullanabilirsiniz. Bu tahlil plaka üzerine solucanlar (Şekil 2E) yayınlayacak.
    Not: KimWipe agar ponksiyon dikkatli olun, aksi solucanlar kökeni burrow. Bazı solucanlar blot M9 tampon KimWipe içine çekti olduğu gibi bu adımda kaybolmuş olabilir. Solucanlar (Bölüm 6) saymak için görüntüleme ve analiz kullanıyorsanız, görüntüleme istasyonuna kökenli solucanlar bırakmadan önce plakaları almak. Yayımlanmasından sonra hemen kökeni solucanlar bir görüntü, bir tahlil plaka için toplam hayvan sayısı verecektir.
  6. Kemotaksis assay plaka oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
  7. Köken, EtOH solucanlar sayısını ve bütanon noktalar (Şekil 2), yanı sıra tahlil plaka solucanlar toplam sayısı.
    Not: Genellikle NaN 3 felç solucanlar noktalar ~ 1 cm çapında içinde olacak ve birbirlerine karşı yığılmış birçok hayvan sopa ile düz görünecektir. Solucanlar (Bölüm 6) saymak için görüntüleme ve analiz yazılımı kullanıyorsanız, kökeni, EtOH ve bütanon lekeler görüntüleri alır. Solucanlar toplam miktarın bir görüntü Bölüm 5.5 alınmış olmalıdır. Solucanlar da "el-sayılır." Olması.
  8. "Kemotaksis Endeksi" (CI) hesaplayın. CI = ((n bütanon) - (n EtOH )]/[( Toplam n Kökeni)].

6. Sayma Worm Görüntü Analizi

  1. Solucanlar kemotaksis assay levhalar (Şekil 3A, kamera kurulum açıklaması için Bölüm 7.4 'e bakınız), yüksek kontrastlı siyah-beyaz görüntüleri çekin. Kemotaksis indeksi hesaplamak için, resimler bütanon, EtOH gerekli ve kökeni bir testin sonunda kemotaksis assay plaka lekeler, solucanlar gibi toplam sayısı (serbest hemen sonra başlangıç ​​noktasında solucanlar resmi Testin başında M9 tampon, Bölüm 5.5).
    Not: her bir nokta etrafında 2 cm çapında yaklaşık kapsayan kemotaksis test plakaları Görüntüler genellikle her nokta için tüm hayvanları yakalamak.
  2. Bir zaman noktasında (örneğin Naive, 0 saat, vb..) Tüm çalışmalar için uygun dosyaları adlı bir klasör içinde bulunan emin olun.
  3. Her kemotaksi plaka için dosyalar gibi adlandırılabilir gerekir: ama # png (bütanon nokta, deneme), ori # png (köken, deneme #), eth # png (etanol nokta, deneme), tot # png.... (toplam deneme #). Iki çalışmanın bir zaman noktası için çalıştırılması durumunda (Örneğin, aşağıdaki dosyaları aynı klasörde mevcut olacaktır: but1.png ori2.png, tot1 but2.png eth1.png, eth2.png, ori1.png . png, tot2.png)
  4. Open Matlab (bkz. Bölüm 7.5).
  5. Matlab penceresinin üst kısmında "Mevcut Directory" satırı, klasörlere göz atın ve "count_worms_v0.5.3" klasörüne (Ek Bilgiler M-dosyaları mevcuttur) seçin.
  6. "Komut Pencere", "count_worms_directory ()." Enter tuşuna basın.
    Not: varsayılan solucan boyutu bu komutu min 10, max 80 piksel. Belirli bir genotip ya da gelişimsel aşamada, türü "count_worms_directory ('minSize, 10,' maxsize ', 80)" ve buna bağlı olarak piksel numaralarını değiştirmek göre, bu ayarlamak için.
  7. Sorulduğunda, analiz edilecek görüntü klasörü seçin.
    Not: Sadece bir klasör görüntüleri bir seferde analiz edilebilir.
  8. Önceden belirlenmiş bir eşik ile analiz edilen klasör her görüntü açılır ve parçacıklar (Şekil 3A). Inci silmek için solucanlar değildir seçilen parçacıklar üzerinde dikdörtgen aracını sürükleyinem. Görüntü ile tamamladığınızda, ESC tuşuna basın.
  9. Klasördeki tüm görüntüleri kontrol edildikten sonra, 4 sütun Komut Penceresi görünecektir: (1) görüntü adını (örneğin but1), (2) her zaman "[1]" (3) tarafından hesaplanan bir solucan için ortalama piksel boyutu Özellikle görüntü programı; (4) ve görüntü olarak hesaplanmıştır solucanlar sayısı.
  10. Sonra bu programı çalıştırın, iki mevduat olacak. Csv dosyalarını (Excel tabloları olarak açılabilir) sadece analiz görüntüleri klasörünün içine. "Worm_counts_stats" dosyasını Command Window (Bölüm 6.9) bulundu çıkış sütunları sağlar. (1) deneme sayısı; solucanlar sayısı (2), (3) eth ve (4) ori noktalar ve solucanlar (5) toplam sayısı: "worm_counts_summary" dosyasını 5 sütun sağlar.

7. Malzeme Notlar

  1. 100 mm yüksek büyüme ortamı (HGM) levhalar (Bölüm 1) hazırlamak için: 3 gr NaCl, 20 g Bactopeptone, 30 g, 700 mL distile su Bacto-agar çözülür. 1 L saf su ile hacim kazandırın. 65oC için, serin agar otoklav ve 4 mL etanol içinde 5 mg / ml kolesterol sonra, 1 ml 1 M CaCl 2, 1 M MgSO 4 ve 25 mL 1 M KPO 4 (pH = 6.0).
  2. Daha yüksek oranda EtOH sonuçları etkileyebilir arınma süreci maddeler ihtiva eğilimindedir olarak% 95 EtOH kullanılır. Bu tahlil çalıştırmak taze her birkaç kata kadar% 10 bütanon (% 95 EtOH) stok yapmak iyi bir fikirdir.
  3. P20 ipuçları birkaç milimetre zarar görmeden solucanlar uymak için yeterince büyük bir delik oluşturmak için kesti sahip olması gerekir. P1000 ipuçları zaten solucanlar aracılığıyla sığacak kadar büyük delikler var.
  4. Kemotaksis Murphy laboratuarında tahlil plaka görüntüleme istasyonu (Şekil 3B) bir patlama standı bağlı bir değişken büyütme lens ile Firewire kamera içerir. Bir arka ışık kemotaksis assay plakalar alttan aydınlatmalı olanak sağlar (Şekil 3C), bir bardak üst özel bir görüntüleme platformu altında stand alt kısmında yer alır. "Ölçüm ve Otomasyon" yazılım (National Instruments), görüntü yakalamak için kullanılır. Bu görüntüleme istasyonu için malzemeler daha önce yayınlanmış olan, 12 benzer ve özel reaktifler ve ekipman Tablo bulunabilir.

8. Temsilcisi Sonuçlar:

% 10 bütanon için yabani tip solucanları tipik bir naif kemotaksis indeksi (CI) 0.2 (Şekil 4A) yaklaşık 6 kümelendiği (1x) veya aralıklı (7x) eğitim (0 zamanında 0,7-0,8 Şekil kemotaksis indeksi artırır bir öğrenme indeksi (LI = eğitimli CI vermek 4A, CD) - ~ 0.6 naif CI) 6 çok sağlam kümelendiği veya aralıklı eğitim ile oluşur öğrenme. Az 0,5 LI genellikle naif kemotaksis assay ile ilgili sorunlar olduğunda ortaya çıkar ve hayvanlar, 0.3 veya daha yüksek bir naif CI var. Genellikle, bu çevre kokuları da naif CI artırabilir; solucanlar açlıktan ya da ağartma ve testin başlangıcında veya solucan arasında ekimi plakaları kalabalık oturup çok uzun yıkar arasında M9 tampon ve açlıktan başlar, çünkü oluşur. Starved solucanlar% 10 bütanon için çok daha yüksek bir naif CI (Şekil 4B) 6 naif kemotaksis ile ilgili sorunlar genellikle geliştirilmiş solucan bakım ve kültür ile çözümlenebilir olduğunu fark var.

Bu testlerin bellek süresi, eğitim naif seviyeleri dönmek için sonra hemen kemotaksis indeksi öğrenme indeksi = 0 alır. Yabani tip hayvanlarda genellikle kısa vadeli çağrışımlı bellek kümelendiği eğitim 1 saat sonra düşmeye başlar, yaklaşık 2 saat sürer ve transkripsiyon faktörü CREB (Şekil 4C) bağımsız 6 Uzun vadeli çağrışımlı bellek tipik olarak başlamıyorsa aralıklı eğitimden sonra 16 saat, 40 saat kadar sürer ve CREB bağımlı (Şekil 4D) kadar belirgin bir düşüş olacağı 6 Uzun vadeli çağrışımlı bellek bazı durumlarda tam potansiyeline ulaşmasını olmayabilir: (1) solucanlar yeterince yok OP50 E. 30 dakika Klima dönemlerinde coli; (2) bakteri açlık dönemlerinde M9 tampon kalır; veya (3) solucanlar assay (örneğin solucanları tüp kenarına pipetlenir) sırasında hasar görmüş.

Sonuçlar genellikle 4 veya daha fazla kemotaksis assay çalışmalarda zaman noktası başına genotipi başına çalıştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı. Altı Koşu genotip başına çoğaltır genellikle işlemek için çok şey olmadan çok önemli sonuçlar doğuran, ancak yeni başlayanlar sadece üç çoğaltır ile başlamak isteyebilirsiniz. Genellikle, bir seferde 2-3 genotipler veya koşullar ile çalışan bu öğrenme ve hafıza testleri ile deneyimli olanlar için rahat.

Kemotaksis assay plakaları El-sayma solucanlar çok zaman alıcıdır, deney ya da laboratuar arkadaşları arasında değişkenlik ekleyebilirsiniz ve analiz ve ben de önyargıları tanıtmakveri nterpreting. Görüntü analizi (Bölüm 6) sayma Worm laboratuvar üzerinden veri toplama ve analiz standartlaştıran ve ortalama elle sayım için gerekli 1 / 5 'deneyimli laboratuvar üyeleri için veri analizi zaman keser. Count_worms yazılımı tarafından tespit edilenlerle manuel solucan sayımı kullanılarak hesaplanmıştır kemotaksis endeksleri karşılaştırıldığında, 3.07 ortalama hata (± 1.19)% bulabilirsiniz.

1. Gün
Zaman Adım
09:00 1 saat M9 tampon açlığa
Naive kemotaksis assay Başlat
10:00 Durum # 1 (gıda ve butanon 60 mm NGM plakalar), 30 dk.
Sona naif kemotaksis assay
10:30 # 1 (60 mm NGM plakalar), 30 dk açlıktan
11:00 Durum # 2, 30 dk.
11:30 30 dakika açlıktan # 2
12:00 Durum # 3, 30 dk.
12:30 30 dakika açlıktan # 3
01:00 Durum # 4, 30 dk.
01:30 30 dakika açlıktan # 4
02:00 Durum # 5, 30 dk.
02:30 # 5, 30 dk açlıktan
03:00 Durum # 6, 30 dk.
03:30 30 dakika açlıktan # 6
04:00 Durum # 7, 30 dk.
04:30 0-saat kemotaksis assay başlayın
16-40 saat plakaları tutun kalan solucanlar transfer
05:30 Sonu 0 saat kemotaksis assay
2. Gün
Zaman Adım
08:30 BEGIN 16 saat kemotaksis testi
09:30 Sona 16 saat kemotaksis assay

Tablo 1, uzun vadeli çağrışımlı hafıza testi için Temsilcisi program . Bu örnekte, tahlil açlıktan 1 saat ile sabah 9 Gün 1 başlar. Solucanlar yedi kez şartlanmışızdır kadar 30 dk durum ve dönemler açlıktan dönüştürülebilir. Kemotaksis Testler başında (Naive) ve eğitim (0 saat) sonunda çalıştırılır. Başlangıçtan bitişe kadar çalışma süresi toplam 8.5 saattir. Tutun plakaları Worms, eğitim 16-40 saat sonra başlayan 2. Gün bütanon kemotaksis için test edilmektedir.

Şekil 1
Şekil 1. Kısa vadeli ve uzun vadeli çağrışımlı bellek tahlil iş akışı. (A) Önerilen zaman çizelgesi gün deneyleri kadar lider hazırlık yapılmaktadır. (B) Kısa vadeli çağrışımlı bellek deneyi: 1 saat boyunca klimalı Starved solucanlar ve kemotaksis deneyleri ile 1x öğrenme (0 dak.) Hemen test ya da klima 0.5, 1 veya 2 saat sonra için gıda tutan plakalar aktarılır. (C) Uzun vadeli çağrışımlı bellek deneyi: Starved hayvanlar, klima 7 eğitim blokları / alma, öğrenme ya da eğitim 16-40 saat sonra LTAM için test edilmeden önce açlıktan.

Şekil 2
Şekil 2 Kemotaksis tahlil kurulum. (A) kemotaksis assay plaka şematik. Küçük noktalar kökeni (altta) ve plaka bütanon ve EtOH (sol ve sağ) noktalar işaretlemek için bir cetvel ya da başka bir yol gösterici cihaz yardımı ile plaka eklenir. (B) 1 mcL NaN 3 bütanon ve EtOH noktalar için eklenir. (C) 1 mcL,% 10 bütanon ve% 95 EtOH her noktalar plaka sol veya sağ tarafına eklenir. (D) M9 tampon askıya 200-400 solucanlar plaka kökeni eklenir. (E) bir nokta şeklinde bükülmüş bir KimWipe tahlil plaka üzerine M9 tampon ve serbest solucanlar emmek için kullanılır.

Şekil 3
Şekil 3 görüntü analizi ile sayma Worm. (A) "count_worms_v0.5.3" görüntü partikül seçim penceresi örneği. Programın orijinal yüksek kontrastlı siyah-beyaz görüntü (solda) bir eşiklenir görüntü (ortada) ile otomatik olarak bir pencere açılır açılır. Dikdörtgen aracı (1) tahlil plaka işaretleri, plaka kenarları (2) veya agar delikler (3) gibi istenmeyen non-solucan "parçacıklar," vurgulayın ve ortadan kaldırmak için kullanılabilir. (B) Görüntü Murphy laboratuar kemotaksis testi görüntüleme istasyonu. Kemotaksis tahlil plakalar analiz için gerekli olan yüksek kontrastlı görüntüler oluşturmak için alttan aydınlatılmıştır. (C) özel hazırlanmış şematikkemotaksis görüntüleme istasyonu kullanılan görüntüleme platformu.

Şekil 4
Şekil 4: Tipik ilişkisel öğrenme ve hafıza sonuçları . (A) kümelendiği üzerine% 10 bütanon artar (1x) eğitim yabani tip solucanlar naif kemotaksis indeksi. Öğrenilen dernek, gıda (OP50 E. coli) ve butanon eşleştirme gerektirir . Bar üstünde Sayılar "Öğrenme Index" (CI Naive LI = CITrained) temsil eder. Solucanlar, 16 saat boyunca aç (B)% 10 bütanon Wild tip naif kemotaksis büyük ölçüde artar. Paneller AD Kauffman ve ark uyarlanmıştır, 2010 6. (C) Yaban türü kısa vadeli çağrışımlı bellek, yaklaşık 2 saat sürer ve transkripsiyon faktör CREB bağımsız . (D) Yaban tipi uzun vadeli çağrışımlı bellek, yaklaşık 40 saat sürer ve CREB bağımlı.

Ek Bilgiler

Discussion

C. elegans koku alma ilişkisel öğrenme ve hafıza testleri burada yığdığı öğrenme, aralıklı öğrenme, kısa süreli hafıza, ve uzun vadeli bellek süreçleri arasında ayrım sundu. Bu testlerin çevreleri 1,2, gıda ve kimyasal kokular anlamda ve bu ikisi arasındaki olumlu dernek kurma solucanlar yeteneklerine güveniyor. 6 Bu nedenle, testleri hayvanların başlayan nüfus açlık çok hassas ve büyük bir titizlikle solucanlar eğitim öncesi ve sonrasında iyi beslenmesini garanti altına alınacak. Tek kümelendiği eğitim, kısa vadeli ilişkisel bellek verir. Klima, dönemlere ve aralıklı eğitim paradigması artan sayıda C. uzun vadeli çağrışımlı bellek ulaşmak için kritik önem taşımaktadır elegans diğer organizmalar olduğu gibi 6,8 Belki de bu testte farklı klimalı ve koşulsuz uyaran arasındaki ilişkileri uzun vadeli anılarını üretmek için değişiklik olabilir.

Ilişkisel öğrenme ve hafıza testleri yaşlanma veya genetik mutant hayvanlar vahşi tip öğrenme ve bellek yeteneklerini karşılaştırmak için kullanılabilir. Örneğin, ilişkisel öğrenmeyi ve yabani tip solucanlar yaşlanma uzun vadeli çağrışımlı hafıza yeteneklerine düşüş, öğrenme azalmış insülin sinyalizasyon, öğrenme ve bellek ile hayvanlarda yaş ile birlikte uzun süre muhafaza ederken calorically kısıtlanmış hayvanlar yaş ile birlikte uzun süre korunur . 6 Bu testlerin de RNAi tedavi veya C farmakolojik manipülasyon için uygun elegans. Örneğin, solucanlar, daf-2 RNAi ile tedavi artırır kısa ve uzun vadeli çağrışımlı bellek; tersine, aralıklı eğitim sırasında gen transkripsiyonu ve protein sentezi (aktinomisin D ve sikloheksimid, sırasıyla) ilaçlar ile tıkanması uzun vadeli bellek oluşumunu bozar . 6

Kısa, Uzun vadeli bellek, çağrışımlı öğrenme ayırt ve test etme yeteneğini bütün hayvanların hayatta kalması için önemli bir süreçtir, ve bir Pavlovyan dernek anısına yer moleküler makine o kadar görünür memelilere solucanlara karşı korunur. 6 Bu koku alma testleri kullanarak vadeli ve uzun vadeli bellek C. yapar daha fazla bellek çalışma için mükemmel bir sistem elegans ve insanlarda öğrenme ve hafıza kaybına yol nörodejeneratif süreçlerin içine fikir verebilir.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Z. Gitai, solucanlar sayısı 13 ImageJ kullanmak için öneri ve yardım için Google SketchUp ile J. Eşref, set-up bizim ilk görüntüleme W. Ryu tavsiye için teşekkür ederim. CTM Biyomedikal Bilimler Pew Scholar, McKnight Scholar ve Keck Scholar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Azide Fisher Scientific S227 Prepare 1 M concentration in distilled water
Ethyl Alcohol 190 Proof Pharmco-AAPER DSP-CT-18 >95% Ethanol may have impurities that interfere with chemotaxis assays
2-Butanone 99+% Acros Organics 14967-0010
Basler IEEE-1394/FireWire Area Scan CMOS Camera Edmund Scientific NT56-683
InfiniMite Video Lens – Alpha Industrial Edmund Scientific NT56-202
Dolan-Jenner MI-150 Fiber Optic Illuminator Edmund Scientific NT55-718
8” x 8” Backlight Schott AG A08927
Standard Boom Stand Edmund Scientific NT54-120
3/4” Post Adaptor for Boom Stands Edmund Scientific NT54-124
Standard Fixed 1/4-20 Mounting Plate Edmund Scientific NT54-122

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74, 515-515 (1993).
  2. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 817-817 (1973).
  3. Bono, M. de, Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu Rev Neurosci. 28, 451-451 (2005).
  4. Mori, I. Genetics of chemotaxis and thermotaxis in the nematode Caenorhabditis elegans. Annu Rev Genet. 33, 399-399 (1999).
  5. Zhang, Y., Lu, H., Bargmann, C. I. Pathogenic bacteria induce aversive olfactory learning in Caenorhabditis elegans. Nature. 438, 179-179 (2005).
  6. Kauffman, A. L. Insulin signaling and dietary restriction differentially influence the decline of learning and memory with age. PLoS Biol. 8, e1000372-e1000372 (2010).
  7. Torayama, I., Ishihara, T., Katsura, I. Caenorhabditis elegans integrates the signals of butanone and food to enhance chemotaxis to butanone. J Neurosci. 27, 741-741 (2007).
  8. Silva, A. J., Kogan, J. H., Frankland, P. W., Kida, S. CREB and memory. Annu Rev Neurosci. 21, 127-127 (1998).
  9. Meyer, F. Iterative image transformations for an automatic screening of cervical smears. J Histochem Cytochem. 27, 128-128 (1979).
  10. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, 62-62 (1979).
  11. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-71 (1974).
  12. Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. Dimensionality and dynamics in the behavior of C. elegans. PLoS Comput Biol. 4, e1000028-e1000028 (2008).
  13. Abramoff, M. agelhaes, Ram, P. J., J, S. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-36 (2004).

Tags

Nörobilim Sayı 49 bellek çağrışımlı öğrenme C. elegans kemotaksis aralıklı eğitim davranış
<em>C. elegans</em> Pozitif bütanon Öğrenme, Kısa vadeli ve uzun vadeli ilişkilendirilebilir Bellek Tahliller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kauffman, A., Parsons, L., Stein,… More

Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays. J. Vis. Exp. (49), e2490, doi:10.3791/2490 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter