Summary
Hier beschrijven we methoden om te testen C. elegans associatief leren en korte-en lange termijn associatief geheugen. Deze populatie testen maken gebruik van de wormen mogelijkheden om chemotax in de richting van vluchtige geur-, en vormen positieve associaties bij de paring voedsel met de chemoattractant butanon. Verhoging van het aantal van conditionering periodes leidt tot lange-termijn geheugen.
Abstract
Het geheugen van ervaringen en geleerde informatie is cruciaal voor organismen om keuzes te maken die hun overleving hulp. C. elegans navigeert zijn omgeving door middel van neuron-specifieke detectie van voedsel-en chemische geuren 1, 2, en kan nutritieve staten associëren met chemische geuren 3, de temperatuur 4, en de pathogeniteit van een bron van voedsel 5.
We beschrijven hier analyses van C. elegans associatief leren en korte-en lange termijn associatief geheugen. We pasten een aversieve olfactorisch leren paradigma zes in plaats daarvan een positief antwoord, de test gaat om uitgehongerde ~ 400 wormen, dan is het voeden van de wormen in de aanwezigheid van de AWC-neuron voelde vluchtige chemoattractant butanon in een concentratie die een lage chemotactische index lokt (vergelijkbaar naar Toroyama et al.. 7). Een standaard bevolking chemotaxis assay1 test de wormen 'attractie aan de geurstof onmiddellijk of minuten tot uren na conditionering.
Na het conditioneren, wild-type dieren 'chemotaxis naar butanon verhoogt ~ 0,6 Chemotaxis Index eenheden, de "Learning Index". Associatief leren is afhankelijk van de aanwezigheid van zowel de voedsel-en butanon tijdens de training. Koppelen voedsel en butanon voor een periode van conditionering ("massale training") produceert op korte termijn associatief geheugen dat ~ 2 uur duurt. Meerdere conditioning perioden met rustperiodes tussen ("afstand training") levert op lange termijn associatief geheugen (<40 uur), en is afhankelijk van de cAMP Response Element Binding protein (CREB), 6 een transcriptiefactor die nodig zijn voor lange-termijn geheugen over soorten. 8
Ons protocol omvat ook beeldanalyse methoden voor een snelle en nauwkeurige bepaling van chemotaxis indices. Een hoog contrast afbeeldingen van dieren op de chemotaxis assay platen worden opgevangen en geanalyseerd door worm te tellen software in MatLab. De software corrigeert voor oneffen achtergrond met behulp van een morfologische tophat transformatie. Negen Otsu De methode wordt vervolgens gebruikt om een drempel te bepalen te scheiden wormen van de achtergrond. 10 zeer kleine deeltjes worden automatisch verwijderd en grotere niet-worm regio's (plaatranden of agar stoten) zijn verwijderd door handmatige selectie. De software schat dan de grootte van een worm door het negeren van regio's die boven een bepaalde maximale omvang en het nemen van de mediane grootte van de overige regio's. Het aantal wormen is dan geschat door de totale oppervlakte die als bezet door wormen door de geschatte grootte van een enkele worm.
We hebben gevonden dat het leren en korte-en lange-termijn geheugen kan worden onderscheiden, en dat deze processen soortgelijke belangrijke moleculen te delen met hogere organismen. 6,8 Onze testen kunnen snel testen nieuwe kandidaat-genen of moleculen die leren en korte of lange invloed -termijn geheugen in C. elegans die relevant zijn voor verschillende diersoorten.
Protocol
Deze C. elegans associatief leren en het geheugen testen vereisen voorbereiding vooraf. Voor een adviesprijs schema van de voorbereiding, zie de tijdlijn weergegeven in figuur 1A. Merk ook op dat de wormen 'herinneringen kan verstoord worden door lichamelijke onrust (ruwe pipetteren, centrifugeren, vortexen), en dat naïef chemotaxis kan worden verstoord door overmatige geuren (parfum, etc.) in de omgeving.
1. Voorbereiding van de Dieren voor Assay
- Cultiveren wormen op 100 mm hoge groei media (HGM) platen (zie paragraaf 7.1 voor recept) bezaaid met 1 ml OP50 E. coli met behulp van standaard methoden. 11
- Hypochloriet-treat ten minste twee dichtbevolkte HGM platen van zwangere volwassen wormen een grote gesynchroniseerde bevolking van eieren te verkrijgen.
Opmerking: Voor de beste opbrengst, bleek de eerste generatie die een zeer gesynchroniseerde bevolking te verkrijgen, dan bleek de tweede generatie als Dag 2 volwassenen om eieren voor de volgende stap te krijgen. - Verdeel de eieren op 3-4 HGM platen bezaaid met 1 ml OP50 E. coli voor elke hypochloriet behandeld plaat.
Opmerking: Het is belangrijk dat de wormen worden gekweekt met veel vers voedsel als honger kan de uitkomst van olfactorische assays beïnvloeden. - Incubeer wormen bij 20 ° C gedurende ongeveer 72 uur, de tijd die het duurt voor de dieren bij de jonge volwassen stadium.
2. Pre-conditioning Starve
- Controleer uw HGM platen met jongeren om te controleren of de wormen nog steeds genoeg te eten hebben, en dat er voldoende wormen voor de test (≥ 200 wormen per assay plaat).
- Was wormen off van HGM platen met M9 buffer 11 in een 15 ml conische buis. Voor de minst opwinding tijdens de wasbeurten, voorzichtig toe te passen M9 buffer door het gieten van een enkele milliliters op de HGM plaat, en zachtjes draai de plaat vrij wormen uit de plakkerige OP50 bacteriën. Vervolgens tilt de plaat, trek de M9 buffer / worm mengsel uit de hoek van de plaat met behulp van een P1000 Pipetman, en breng de wormen aan de 15 ml conische buis. Als wormen nog steeds links op de plaat, herhaalt u deze stap 1-2X.
Let op: Rough wassen loskomt bacteriën af van de plaat dat het in het buisje te maken met de wormen. Deze bacterie is onmogelijk om zich te ontdoen van en kunnen interfereren met de testen. NIET wormen pipet tegen de zijkant van de buis, omdat dit kan schade aan de wormen en interfereren met de testen. - Laat wormen af te wikkelen door de zwaartekracht (NIET centrifuge). Verwijder supernatant door vacuüm en wassen met minimaal 3-4 ml M9. Herhalen 2X voor een totaal van drie wasbeurten.
Let op: Centrifugeren tijdens wasbeurten zal pull down resterende bacteriën in de worm bevolking, die kunnen interfereren met de testen. In plaats daarvan, voeg M9 buffer voor latere wasbeurten door het gieten van het direct in de 15 ml conische buis. Worms op de bodem van de buis zou moeten gemengd worden in de M9 buffer op zijn toevoeging. Als wormen bleef afgewikkeld, voorzichtig omkeren van de buis te mengen. - Na de derde wassen, gebruik een deel van de worm bevolking voor naïeve chemotaxis assays (hoofdstuk 5).
Opmerking: Het is cruciaal om vrij snel te werken bij alle wasstappen, als wormen zal beginnen te verhongeren als ze zitten te lang in M9 buffer, die de naïeve chemotaxis in de richting van butanon kan verhogen. - Voeg 3-4 ml M9 buffer om de 15 ml conische buis, laat wormen in M9 buffer verhongeren bij kamertemperatuur gedurende 1 uur (Figuur 1B, C).
3. Korte termijn Associatieve Memory (massale) Training
Zie figuur 1B voor korte-termijn geheugen associatief assay workflow.
- Aan het einde van de verhongeren periode in M9 buffer (hoofdstuk 2), streep 2 pl van 10% butanon (in 95% EtOH) aan de binnenkant van de deksels van 60 mm nematode groei media (NGM) 11 platen die zijn bezaaid met 500 pL OP50 E. coli.
Opmerking: Een goed uitgangspunt bevolking voor korte-en lange-termijn geheugen assays is ≥ 500 pi van de wormen. Meerdere conditioning platen zijn nodig per genotype om de hele bevolking te ondersteunen tijdens de training. Bij het werken met vluchtige stoffen, alleen open deksels van de platen wanneer dat nodig is, waardoor ze gesloten op alle andere tijden. - Verwijder de M9 buffer supernatant van de 15 ml conische buis van uitgehongerd wormen door vacuüm en gebruik een P1000 Pipetman met 100-200 ul van wormen van toepassing op de conditionering platen.
Opmerking: Probeer zoveel M9 vloeistof te verwijderen als mogelijk, zodat de wormen snel naar de OP50 voedselbron wanneer overgebracht naar het conditioneren platen. Worms blijft plakken aan de binnenkant van de pipetpunt en kan worden geconserveerd door pipetteren kleinere volumes. - Incubeer conditioning platen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur (Figuur 1B).
- Was wormen off van platen met ~ 1 ml M9 buffer in een 15 ml conische buis. Laat wormen af te wikkelen door de zwaartekracht. Was opnieuw 1-2X tot M9 buffer in de buis is duidelijk.
Opmerking: Gebruik de zachte wassen methoden beschreven in paragraaf2. Dezelfde 15 ml conische buis kan worden gebruikt uit deel 2. - Na de laatste wasbeurt, verwijder de M9 buffer supernatant door een vacuüm, en het gebruik van een deel van de worm bevolking voor chemotaxis assays (hoofdstuk 5) om te testen voor 1x (massale) associatief leren van de voedsel-butanon vereniging onmiddellijk na deze behandeling (0 minuten tijdstip ).
Leren Index (LI) = CI 0 uur - CI Naive. - Breng de resterende populatie van wormen tot 60 mm NGM platen gezaaid met 500 ul van OP50 (hold platen). Nogmaals, van toepassing 100-200 ul van wormen per plaat om te zorgen voor voldoende bacteriën om de bevolking te ondersteunen.
Opmerking: Het aantal te houden platen gebruikt per genotype is ten minste het aantal korte-termijn geheugen associatief tijdstippen worden getest. - Incubeer post-conditioning platen voor 0,5, 1 of 2 uur (korte-termijn geheugen associatief tijdstippen) bij kamertemperatuur (Figuur 1B).
Let op: op korte termijn associatieve geheugen van wild-type dieren eindigt met twee uur na de training. Tijdstippen moet mogelijk worden aangepast voor verschillende genotypen of voorwaarden. - Om te testen voor de korte termijn associatieve geheugen van de voedsel-butanon vereniging, na elk tijdstip, voorzichtig te wassen wormen uit platen in een 15 ml conische buis en weer 1-2X met M9 buffer. Gebruik wormen voor de chemotaxis assays (hoofdstuk 5). Leren Index (LI) = CI tijdstip - CI Naive.
Opmerking: Gebruik de zachte wassen methoden beschreven in paragraaf 2. Voor elk tijdstip, moet u alle extra wormen die niet worden gebruikt in de chemotaxis assays.
4. Lange-termijn Associatieve Memory (Spaced) Training
Zie Figuur 1C voor de lange termijn associatieve geheugen test workflow.
- Volg de stappen 3,1-3,2 in hoofdstuk 3.
- Incubeer conditioning platen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten (figuur 1C).
- Volg stap 3.4 in hoofdstuk 3.
Opmerking: Om te kunnen blijven in een 30-minuten termijn, kan men al beginnen met spoelt tijdens de training op ~ 25 minuten. - Na de laatste wasbeurt, verwijder M9 supernatant met behulp van vacuüm en overdracht wormen te unseeded 60 mm NGM platen.
Opmerking: Het gebruik van meerdere platen per genotype is niet nodig bij deze stap omdat de wormen worden uitgehongerd. - Verhongeren op 60 mm NGM platen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten (figuur 1C).
- Was de wormen met M9 buffer in de 15 mL conische buis. Laat wormen af te wikkelen door de zwaartekracht (NIET centrifuge).
Opmerking: Hoewel er geen bacteriën in de buffer op dit punt, centrifugeren kan een potentieel schadelijke behandeling van de wormen, en kunnen lange-termijn geheugen formatie te verstoren. - Herhaal de stappen 4,1-4,6 meerdere keren tot een totaal van 7 conditionering blokken en 6 verhongeren blokken zijn voltooid (figuur 1C). (Zie tabel 1 voor een representatieve periode vel.)
- Voorzichtig wassen wormen uit platen in de 15 mL conische buis en weer 1-2X met M9 buffer.
- Na de laatste wasbeurt, gebruik een deel van de worm bevolking voor chemotaxis assays (hoofdstuk 5) om te testen voor 7x (afstand) associatief leren van de voedsel-butanon vereniging onmiddellijk na deze behandeling (0 uur tijdstip). Leren Index (LI) = CI 0 uur - CI Naive.
- Breng de resterende populatie van wormen tot 100 mm HGM platen geënt met 1 ml OP50 (hold platen). Nogmaals, van toepassing 100-200 ul van wormen per plaat om te zorgen voor voldoende bacteriën om de bevolking te ondersteunen.
Opmerking: Het aantal te houden platen gebruikt per genotype is ten minste het aantal lange-termijn geheugen associatief tijdstippen worden getest. 100 mm NGM borden kunnen ook gebruikt worden als post-conditioning platen, maar men moet erg voorzichtig zijn dat er genoeg OP50 aan de bevolking van wormen ondersteuning voor ten minste 16 uur. - Incubeer post-conditioning platen 16, 24 en 40 uur (lange-termijn-geheugen associatief tijd punten) bij 20 ° C (Figuur 1C).
Let op: op lange termijn associatieve geheugen van wild-type dieren eindigt met de 40 uur na de training. Tijdstippen moet mogelijk worden aangepast voor verschillende genotypen of voorwaarden. - Om te testen voor de lange termijn associatieve geheugen van de voedsel-butanon vereniging, voorzichtig te wassen wormen uit platen in een 15 ml conische buis en weer 1-2X met M9 buffer na elk tijdstip. Gebruik wormen voor de chemotaxis assays (hoofdstuk 5). Leren Index (LI) = CI tijdstip - CI Naive.
Opmerking: Gebruik de zachte wassen methoden beschreven in paragraaf 2. Voor elk tijdstip, moet u alle extra wormen niet gebruikt in de chemotaxis assays.
5. Chemotaxis Assay
- Bereid de chemotaxis assay platen. Streep de onderkant van de ongeplaatste 100 mm NGM platen met vlekken op de bodem en elke kant van de plaat (Figuur 2A).
Let op: Minimaal 3 duplo's per genotype moeten worden uitgevoerd om statistisch significante resultaten te verkrijgen. - Spot 1 ul van 1 M NaN 3 op de odorant encontrole spot (figuur 2B).
Let op: niet ter plekke uw platen met deze verlammende stof meer dan 15 minuten vóór het begin van de test, of de NaN 3 zal uit de buurt van de plekken, diffuus en dieren verlamd raken voor het bereiken van de geurstof of controle plekken. Wees niet te doorboren de agar bij de toepassing van NaN 3, omdat wormen zullen hol in doorboord gebieden. - Terwijl de wormen zijn vestiging in de conische buis na enkele M9 buffer wast (hoofdstuk 2), spot een pi elk van de 95% EtOH en 10% butanon (zie paragraaf 7.2) op de juiste plekken op de gemarkeerde assay plaat (figuur 2C) op bovenkant van de eerder gespot NaN 3.
Let op: Chemicaliën moeten worden voordat gespot aan het toevoegen van de wormen (paragraaf 5.4). Maak een notitie van die spot heeft EtOH of butanon. Bij het werken met deze vluchtige chemische stoffen, worden voorzichtig om alleen te openen van de deksels van de platen wanneer dat nodig is, en houd ze gesloten op alle andere tijden. - Verwijder zoveel mogelijk van de M9 buffer als mogelijk van de buis van vestigden wormen. Gebruik een P20 Pipetman met een pre-cut tip (zie paragraaf 7.3) tot 3X 5 pi wormen (200-400 dieren) te leveren aan de oorsprong van de gemerkte assay plaat (figuur 2D).
Opmerking: Bewaar de resterende wormen in de 15 ml conische buis voor gebruik in de Pre-conditioning verhongeren en het geheugen testen (secties 2-4). Worms zal blijven binnen pipetpunten, dus het toevoegen wormen om de plaat in kleinere hoeveelheden bespaart je worm bevolking en vermindert de hoeveelheid vloeistof die wordt uitgebracht met de wormen op de assay plaat. - Draai de hoek van een KimWipe om een klein punt en gebruik deze om vlek op de overtollige M9 buffer. Hierdoor komt de wormen op de testplaat (figuur 2E).
Let op: Zorg ervoor dat u doorboren de agar met de KimWipe, anders wormen zullen hol in de oorsprong. Sommige wormen kunnen verloren gaan in deze stap als ze zijn getrokken in de KimWipe met de M9 buffer bij blotting. Bij gebruik van beeldvorming en analyse om wormen (hoofdstuk 6) tellen, nemen platen imaging station vóór het vrijgeven van wormen uit de oorsprong. Een beeld van de wormen die aan de oorsprong direct na de release zal het totale aantal dieren een testplaat. - Incubeer de chemotaxis testplaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Tel het aantal wormen bij de oorsprong, EtOH, en butanon vlekken (Figuur 2), evenals het totale aantal wormen op de assay plaat.
Opmerking: In het algemeen, wormen verlamd door NaN 3 zal worden binnen een ~ 1 cm straal van de vlekken, en blijft kleven-rechte verschijnen met veel dieren gestapeld tegen elkaar. Bij gebruik van beeldvorming en analyse software om wormen (hoofdstuk 6) tellen, foto's maken van de oorsprong, EtOH, en butanon plekken. Een beeld van het totale bedrag van wormen had moeten worden genomen in paragraaf 5.5. Wormen kunnen ook worden "met de hand geteld." - Bereken de "Chemotaxis Index" (CI). CI = ([(n Butanon) - (n EtOH )]/[( Total-n Origin)].
6. Worm tellen door Image Analysis
- Neem een hoog-contrast zwart-wit beelden van de wormen op chemotaxis assay platen (figuur 3A, zie paragraaf 7.4 voor een beschrijving van de camera-instellingen). Voor het berekenen van een chemotaxis index, worden de beelden nodig op de butanon, EtOH, en herkomst plekken van een chemotaxis assay plaat aan het einde van een test, evenals het totaal aantal wormen (foto van wormen bij de oorsprong direct nadat ze zijn vrijgelaten uit M9 buffer aan het begin van de test, paragraaf 5.5).
Let op: Beelden van de chemotaxis assay platen die ongeveer een 2 cm straal rond elke plek in het algemeen alle van de dieren vast te leggen voor elke plek. - Zorg ervoor dat de bestanden voor alle proeven van een tijdstip (bijvoorbeeld Naïef, 0 uur, etc.) zijn opgenomen in een map, toepasselijke naam.
- Bestanden voor elke chemotaxis plaat moet als zodanig benoemd, maar # png (butanon spot, trial #), ori # png (oorsprong, trial #), ETH # png (ethanol spot, trial #), tot # png.... (totaal, trial #). (Bijvoorbeeld, als twee studies werden uitgevoerd voor een tijdstip, in dezelfde map de volgende bestanden aanwezig zou zijn: but1.png, but2.png, eth1.png, eth2.png, ori1.png, ori2.png, tot1 . png, tot2.png)
- Open Matlab (zie paragraaf 7.5).
- In het 'Current Directory "lijn aan de bovenkant van de Matlab-venster, blader naar mappen en kies de" count_worms_v0.5.3 "map (M-bestanden beschikbaar als aanvullende informatie).
- In het 'Command Window', type "count_worms_directory ()." Druk op Enter.
Opmerking: De standaard worm grootte als voor deze opdracht is min 10, max 80 pixels. Aan te passen dit op basis van een specifieke genotype of ontwikkelingsfase, type "count_worms_directory ('minSize', 10 ', maxsize", 80) ", en verander dan de aantallen pixels. - Wanneer daarom wordt gevraagd, kiest u de map met afbeeldingen te analyseren.
Opmerking: Alleen een map met afbeeldingen kan worden geanalyseerd op een moment. - Elke afbeelding in de map wordt geanalyseerd zal verschijnen met een drempel al is ingesteld, en deeltjes geselecteerd (Figuur 3A). Sleep de rechthoek gereedschap op geselecteerde deeltjes die niet zijn wormen te verwijderen eem. Wanneer u klaar bent met de afbeelding, druk op de Esc-toets.
- Nadat alle afbeeldingen in de map worden gecontroleerd, zal 4 kolommen in het Command Window: (1) naam van de afbeelding (bijvoorbeeld but1), (2) altijd "[1]" (3) gemiddelde pixel grootte voor een worm berekend door de het programma van de bepaald beeld, en (4) het aantal wormen berekend dat in het beeld.
- Zodra dit programma is uitgevoerd, zal het depot twee. Csv-bestanden (kan worden geopend als Excel spreadsheets) in de map met afbeeldingen het net heeft geanalyseerd. De "worm_counts_stats" bestand zorgt voor de uitvoer kolommen te vinden in het Command Window (paragraaf 6.9). De "worm_counts_summary"-bestand bevat 5 kolommen: (1) trial aantal, het aantal wormen in (2), maar, (3) eth, en (4) ori plekken, en (5) totaal aantal wormen.
7. Materialen Notes
- Tot 100 mm hoge groei media (HGM) platen (deel 1) voor te bereiden: Los 3 g NaCl, 20 g Bactopeptone, en 30 g Bacto-agar in 700 ml gedestilleerd water. Breng het volume op een L met gedestilleerd water. Na de autoclaaf, koele agar tot 65oC en voeg 4 ml van 5 mg / ml cholesterol in ethanol, 1 ml van elk van 1 M CaCl 2, 1 M MgSO 4, en 25 ml van 1 M KPO 4 (pH = 6,0).
- 95% EtOH wordt gebruikt, zoals hoger percentage EtOH heeft de neiging om onzuiverheden bevatten uit het zuiveringsproces dat kan de resultaten beïnvloeden. Het is een goed idee om de 10% butanon (in 95% EtOH) voorraad make-up fris om de paar keer de test wordt uitgevoerd.
- P20 tips moet een paar millimeter afgesneden om een gat groot genoeg is voor wormen te passen door middel van te maken zonder te worden beschadigd. P1000 tips hebben al gaten groot genoeg zijn voor de wormen te passen door.
- De chemotaxis testplaat imaging station (Figuur 3B) in de Murphy lab bevat een Firewire camera met een variabele vergroting lens bevestigd aan een boom staan. Een backlight wordt geplaatst op de onderkant van de standaard onder een aangepaste imaging platform met een glazen blad (figuur 3C), die het mogelijk maakt chemotaxis testplaten te verlichten van de bodem. "Meet-en Automation" software (National Instruments) wordt gebruikt om beelden vast te leggen. Materialen voor deze beeldvorming station opgezet zijn vergelijkbaar met die eerder gepubliceerde, 12 en is te vinden in de tabel van specifieke reagentia en apparatuur.
8. Representatieve resultaten:
Een typische naïeve chemotaxis index (CI) voor de wild-type wormen voor 10% butanon is ongeveer 0,2 (Figuur 4A). Zes Massed (1x) of afstand (7x) opleiding in het algemeen verhoogt het chemotaxis index 0,7-0,8 op tijdstip 0 (Figuur 4A, CD) met een leren index (LI = opgeleid CI geven -. naïef CI) van 0,6 ~ 6 Het leren dat optreedt bij massale of verdeelde training is zeer robuust. Een LI van minder dan 0,5 ontstaat meestal wanneer er problemen zijn met de naïeve chemotaxis test, en de dieren hebben een naïeve CI van 0,3 of hoger. Meestal gebeurt dit omdat de wormen sterven van de honger of te druk op de teelt platen tussen bleken en de start van de test, of wormen zitten te lang in de M9 buffer tussen de wasbeurten en beginnen te verhongeren, milieuoverwegingen, en geuren kunnen ook de naïeve CI. Uitgehongerd wormen hebben een veel hogere naïeve CI voor 10% butanon (Figuur 4B). 6 We vinden dat de problemen met de naïeve chemotaxis over het algemeen worden opgelost met verbeterde worm zorg en kweken.
De duur van het geheugen in deze assays is de tijd die het duurt voor chemotaxis index direct na de training terug te keren naar naïeve niveau, wanneer het leren index = 0. In wild-type dieren, korte-termijn geheugen associatief begint meestal door een uur na de massale afname van training, duurt ongeveer 2 uur en is onafhankelijk van de transcriptiefactor CREB (Figuur 4C). Zes lange termijn associatief geheugen meestal niet begint aanzienlijk dalen tot 16 uur na het verdeelde training, duurt tot 40 uur, en is CREB-afhankelijk is (Figuur 4D) 6 op lange termijn associatief geheugen kan niet haar volledige potentieel in een aantal gevallen: (1). wormen hebben niet genoeg OP50 E. coli tijdens de 30-minuten conditioning perioden (2) bacteriën blijven in de M9 buffer tijdens de hongersnood periodes, of (3) wormen zijn beschadigd tijdens de test (bijvoorbeeld wormen zijn gepipetteerd tegen de zijkant van de buis).
De resultaten zijn over het algemeen statistisch significant wanneer vier of meer chemotaxis assay proeven worden uitgevoerd per genotype per tijdstip. Running zes duplo's per genotype meestal levert zeer significante resultaten zonder dat al te veel te verwerken, maar beginners kunnen willen beginnen met slechts drie herhalingen. Over het algemeen, het werken met 2-3 genotypen of voorwaarden op het moment is comfortabel voor degenen die ervaring hebben met deze leren en geheugen testen.
De hand tellen van wormen op chemotaxis testplaten is zeer tijdrovend, kunt variabiliteit tussen experimenten of lab partners, en kan introduceren ook vooroordelen bij het analyseren en interpreting gegevens. Worm tellen door beeldanalyse (hoofdstuk 6) standaardiseert gegevensverzameling en-analyse in het lab, en gemiddeld, snijdt data-analyse tijd voor ervaren lab-leden tot 1 / 5 van dat nodig is voor de hand te tellen. Bij het vergelijken van chemotaxis indices berekend met behulp van handmatige tellingen worm die wordt bepaald door de Count_worms software, vinden we een gemiddelde fout van 3,07 (± 1,19)%.
| Dag 1 | |
| Tijd | Stap |
| 09:00 | 1 uur verhongeren in M9 buffer Start naïef chemotaxis assay |
| 10:00 | Voorwaarde # 1 (60 mm NGM borden met eten en butanon), 30 min Eind naïef chemotaxis assay |
| 10:30 | Verhongeren # 1 (60 mm NGM platen), 30 min |
| 11:00 | Voorwaarde # 2, 30 min |
| 11:30 | Verhongeren # 2, 30 min |
| 12:00 | Voorwaarde # 3, 30 min |
| 12:30 | Verhongeren # 3, 30 min |
| 01:00 | Voorwaarde # 4, 30 min |
| 01:30 | Verhongeren # 4, 30 min |
| 02:00 | Voorwaarde # 5, 30 min |
| 02:30 | Verhongeren # 5, 30 min |
| 03:00 | Voorwaarde # 6, 30 min |
| 03:30 | Verhongeren # 6, 30 min |
| 04:00 | Voorwaarde # 7, 30 min |
| 04:30 | Begin 0-hr chemotaxis assay Overdracht resterende wormen om platen te houden voor 16 tot 40 uur |
| 05:30 | End 0-hr chemotaxis assay |
| Dag 2 | |
| Tijd | Stap |
| 08:30 | Begin 16-hr chemotaxis assay |
| 09:30 | End 16-hr chemotaxis assay |
Tabel 1. Vertegenwoordiger schema voor de lange termijn associatief geheugen test. In dit voorbeeld is de test begint op dag 1 om 9 uur met een 1-uur verhongeren. 30-min staat en verhongeren perioden worden afgewisseld totdat de wormen zijn geconditioneerd zeven keer. Chemotaxis testen worden uitgevoerd aan het begin (naïeve) en einde (0 uur) van de opleiding. De totale run-time van begin tot eind is 8,5 uur. Wormen in de wacht platen zijn getest op chemotaxis te butanon te beginnen op dag 2, 16 tot 40 uur na de training.
Figuur 1. Korte termijn en lange termijn associatieve geheugen test workflow. (A) Aanbevolen tijdlijn van de voorbereiding in de aanloop naar de dag testen worden uitgevoerd. (B) op korte termijn associatief geheugen test: Starved wormen zijn geconditioneerd gedurende 1 uur en getest onmiddellijk voor 1x leren (0 min.) Via chemotaxis testen, of overgebracht naar holding platen met voedsel voor 0,5, 1 of 2 uur na conditionering. (C) op lange termijn associatief geheugen test: Starved dieren krijgen zeven opleiding blokken van airconditioning / verhongeren voordat ze getest om te leren of LTAM 16-40 uur na de training.
Figuur 2. Chemotaxis test setup. (A) Schematische weergave van chemotaxis assay plaat. Kleine vlekken worden toegevoegd aan de plaat met behulp van een liniaal of een ander apparaat leiden naar de oorsprong (onder) en butanon en EtOH (links en rechts) vlekken op de plaat te markeren. (B) 1 pi NaN 3 wordt toegevoegd aan het butanon en EtOH plekken. (C) een pi elk van de 10% butanon en 95% EtOH worden samengeteld met de vlekken op de linker-of rechterkant van de plaat. (D) 200 tot 400 wormen gesuspendeerd in M9 buffer worden toegevoegd aan de oorsprong van de plaat. (E) een KimWipe gedraaid tot een punt wordt gebruikt om de M9 buffer en laat wormen te vangen op de assay plaat.
Figuur 3. Worm tellen met beeldanalyse. (A) Voorbeeld van een "count_worms_v0.5.3" beeld deeltje selectie venster. Het programma opent origineel met hoog contrast zwart-wit afbeelding (links) automatisch verschijnt een venster met een thresholded beeld (midden). De rechthoek tool kan gebruikt worden om te markeren en te elimineren ongewenste niet-worm "deeltjes", zoals testplaat merken (1), plaatranden (2), of agar puncties (3). (B) Afbeelding van de Murphy lab chemotaxis assay imaging station. Chemotaxis assay platen worden verlicht van de bodem tot hoge contrast beelden die nodig zijn voor analyse. (C) Schematische weergave van de op maat gemaakteimaging platform gebruikt in de chemotaxis imaging station.
Figuur 4. Typische associatief leren en het geheugen resultaten. (A) De naïeve chemotaxis index van wild-type wormen tot 10% butanon toeneemt bij massale (1x) training. De geleerde vereniging is vereist dat de koppeling van voedsel (OP50 E. coli) en butanon. Cijfers boven balken geven de "Learning Index" (LI = CITrained - CI Naive). (B) Wild type naïef chemotaxis tot 10% butanon sterk verhoogd wanneer wormen zijn uitgehongerd gedurende 16 uur. AD panelen zijn aangepast van Kauffman et al.., 2010. 6 (C) Wild type korte termijn associatief geheugen duurt ongeveer 2 uur en is onafhankelijk van de transcriptiefactor CREB. (D) Wild type lange termijn associatief geheugen duurt ongeveer 40 uur, en is CREB-afhankelijk.
Aanvullende informatie
Discussion
De C. elegans olfactorische associatief leren en het geheugen testen hier gepresenteerde onderscheid te maken tussen de processen van massale leren, afstand van elkaar leren, korte-termijn geheugen en lange-termijn geheugen. Deze testen vertrouwen op de wormen 'mogelijkheden om voedsel en chemische geuren zin in hun omgeving 1,2 en positieve associaties tussen de twee vormen. Daarom 6, de testen zijn zeer gevoelig voor de honger in de start populatie van de dieren, en de grote aandacht aan moet worden genomen om ervoor te zorgen dat goed wormen gevoed worden voor en na de training. Single massale opleiding levert op korte termijn associatief geheugen. Het toegenomen aantal van conditionering periodes en op een afstand training paradigma is van cruciaal belang voor het bereiken van lange-termijn-geheugen associatief in C. elegans als in andere organismen. 6,8 Misschien test kon worden gewijzigd om op lange termijn geheugen van associaties tussen verschillende geconditioneerde en ongeconditioneerde stimuli te produceren.
Onze associatief leren en geheugen testen kunnen gebruikt worden om het leren en het geheugen capaciteiten van wild-type te vergelijken met ouder worden of genetische mutant dieren. Bijvoorbeeld, is terwijl zowel associatief leren en lange-termijn-geheugen associatieve vermogens daling van de vergrijzing van wild-type wormen, leren is meer onderhouden met de leeftijd bij dieren met een verminderde insuline signalering, en leren en geheugen meer onderhouden met de leeftijd in calorisch beperkt dieren. 6 Deze testen zijn ook vatbaar voor RNAi behandeling of farmacologische manipulatie van C. elegans. Bijvoorbeeld, de behandeling van wormen met een daf-2 RNAi verbetert de korte-en lange termijn associatieve geheugen, omgekeerd, het blokkeren van gentranscriptie en eiwitsynthese met drugs (actinomycine D en cycloheximide, respectievelijk) tijdens de training uit elkaar verstoort lange-termijn geheugen formatie. 6
Lange-termijn geheugen is een proces dat cruciaal is om te overleven in alle dieren, en het blijkt dat veel van de moleculaire machinerie die betrokken zijn bij het geheugen van een Pavlov-vereniging is bewaard gebleven van wormen tot zoogdieren. 6 Het vermogen om onderscheid te maken en te testen associatief leren, korte en lange-termijn geheugen met behulp van deze geur testen maakt C. elegans een uitstekend systeem voor de verdere studie van het geheugen, en kan inzicht geven in neurodegeneratieve processen die leiden tot het verlies van leren en geheugen bij de mens.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken W. Ryu voor advies over onze eerste beeldvorming set-up, Z. Gitai voor de suggestie om ImageJ 13 te gebruiken om wormen tellen, en J. Ashraf voor hulp met Google SketchUp. CTM is een Pew Scholar in de Biomedische Wetenschappen, een McKnight Scholar, en een Keck Scholar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | S227 | Prepare 1 M concentration in distilled water |
| Ethyl Alcohol 190 Proof | Pharmco-AAPER | DSP-CT-18 | >95% Ethanol may have impurities that interfere with chemotaxis assays |
| 2-Butanone 99+% | Acros Organics | 14967-0010 | |
| Basler IEEE-1394/FireWire Area Scan CMOS Camera | Edmund Scientific | NT56-683 | |
| InfiniMite Video Lens – Alpha Industrial | Edmund Scientific | NT56-202 | |
| Dolan-Jenner MI-150 Fiber Optic Illuminator | Edmund Scientific | NT55-718 | |
| 8” x 8” Backlight | Schott AG | A08927 | |
| Standard Boom Stand | Edmund Scientific | NT54-120 | |
| 3/4” Post Adaptor for Boom Stands | Edmund Scientific | NT54-124 | |
| Standard Fixed 1/4-20 Mounting Plate | Edmund Scientific | NT54-122 |
References
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74, 515-515 (1993).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 817-817 (1973).
- Bono, M. de, Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu Rev Neurosci. 28, 451-451 (2005).
- Mori, I. Genetics of chemotaxis and thermotaxis in the nematode Caenorhabditis elegans. Annu Rev Genet. 33, 399-399 (1999).
- Zhang, Y., Lu, H., Bargmann, C. I. Pathogenic bacteria induce aversive olfactory learning in Caenorhabditis elegans. Nature. 438, 179-179 (2005).
- Kauffman, A. L. Insulin signaling and dietary restriction differentially influence the decline of learning and memory with age. PLoS Biol. 8, e1000372-e1000372 (2010).
- Torayama, I., Ishihara, T., Katsura, I. Caenorhabditis elegans integrates the signals of butanone and food to enhance chemotaxis to butanone. J Neurosci. 27, 741-741 (2007).
- Silva, A. J., Kogan, J. H., Frankland, P. W., Kida, S.
- Meyer, F. Iterative image transformations for an automatic screening of cervical smears. J Histochem Cytochem. 27, 128-128 (1979).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, 62-62 (1979).
- Brenner, S.
- Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. Dimensionality and dynamics in the behavior of C. elegans. PLoS Comput Biol. 4, e1000028-e1000028 (2008).
- Abramoff, M. agelhaes, Ram, P. J., J, S.
