Summary
Nous décrivons ici les méthodes d'essais de C. elegans apprentissage associatif et à court et à long terme la mémoire associative. Ces dosages de la population utilisent les capacités des vers à chemotax vers odorants volatils, et de former des associations positives sur les accords mets butanone chimiotactique. Augmenter le nombre de périodes de conditionnement induit mémoire à long terme.
Abstract
La mémoire des expériences et des informations apprises est essentiel pour les organismes de faire des choix que l'aide à leur survie. C. elegans navigue son environnement grâce à des neurones spécifiques de détection des odeurs de nourriture et de produits chimiques 1, 2, et peut associer des États nutritive avec 3 odeurs chimiques, température de 4, et la pathogénicité d'une source de 5 nourriture.
Ici, nous décrivons des dosages de C. elegans apprentissage associatif et à court et à long terme la mémoire associative. Nous avons modifié un paradigme d'apprentissage aversif olfactive au lieu de 6 à produire une réponse positive, l'épreuve consiste à affamer les vers ~ 400, puis nourrir les vers à la présence de l'AWC neurone-butanone senti chimioattractive volatiles à une concentration qui provoque un index chimiotactique faible (similaires d'Toroyama et al. 7). Une population standard chimiotactisme assay1 essais attrait des vers à l'odorant immédiatement ou minutes à quelques heures après le conditionnement.
Après chimiotactisme conditionné, animaux de type sauvage »aux augmentations de butanone ~ 0,6 unités Indice chimiotactisme, son« indice de l'apprentissage ". L'apprentissage associatif est dépendante de la présence de la nourriture et le butanone pendant la formation. Accord mets et de butanone pour une période de conditionnement unique («formation massés") produit à court terme la mémoire associative, qui dure environ 2 heures. Périodes de conditionnement multiples avec des périodes de repos entre («formation espacées») des rendements à long terme la mémoire associative (<40 heures), et est dépendante de la protéine AMPc Element Binding Réponse (CREB), 6 un facteur de transcription requis pour mémoire à long terme à travers espèces 8.
Notre protocole comprend également des méthodes d'analyse d'image pour la détermination rapide et précise des indices de chimiotactisme. Haut contraste des images d'animaux sur les plaques de dosage chimiotactisme sont capturés et analysés par un logiciel de comptage dans le ver MatLab. Le logiciel corrige pour le fond inégale en utilisant une transformation tophat morphologiques. Méthode 9 Otsu est ensuite utilisé pour déterminer un seuil pour les vers séparer de l'arrière-plan. 10 très petites particules sont supprimés automatiquement et les grands non-ver régions (bords de la plaque ou de poinçons agar) sont enlevé par sélection manuelle. Le logiciel évalue alors la taille du seul ver, en ignorant les régions qui sont au-dessus d'une taille maximale spécifiée et en prenant la taille médiane des autres régions. Le nombre de vers est alors estimée en divisant la superficie totale occupée par identifiés comme des vers par la taille estimée d'un seul ver.
Nous avons constaté que l'apprentissage et à court terme et mémoire à long terme peuvent être distingués, et que ces processus partagent les mêmes molécules clés avec les organismes supérieurs. 6,8 Nos tests peuvent tester rapidement nouveaux gènes candidats ou des molécules qui affectent l'apprentissage et à court ou à long terme de mémoire en C. elegans qui sont pertinents à travers les espèces.
Protocol
Ces C. elegans apprentissage associatif et les tests de mémoire nécessitent une préparation préalable. Pour un horaire suggéré de préparation, voir le calendrier présenté dans la Figure 1A. A noter également que les souvenirs des vers »peut être perturbé par l'agitation physique (pipetage rugueux, centrifugation, vortex), et que le chimiotactisme naïve peut être perturbé par les odeurs excessives (parfum, etc) dans l'environnement.
1. Préparation des animaux Assay
- Cultiver des vers sur 100 mm média à forte croissance (HGM) plaques (voir la section 7.1 pour la recette) ensemencée avec 1 ml E. OP50 coli en utilisant des méthodes standard de 11.
- Hypochlorite de traiter au moins deux plaques densément peuplées HGM des vers adultes gravides à obtenir une large population synchronisée des oeufs.
Remarque: Pour obtenir de meilleurs rendements, l'eau de Javel à la première génération d'obtenir une population hautement synchronisée, puis l'eau de Javel la deuxième génération comme Jour 2 adultes d'obtenir des œufs pour l'étape ultérieure. - Répartir les oeufs sur des plaques HGM 3-4 ensemencée avec 1 ml E. OP50 coli pour chaque hypochlorite de tôles traitées.
Remarque: Il est important que les vers sont cultivées avec beaucoup d'aliments frais que la famine peut affecter le résultat de tests olfactifs. - Incuber les vers à 20oC pendant environ 72 heures, le temps qu'il faut pour les animaux atteignent le stade de jeune adulte.
2. Pré-conditionnement de mourir de faim
- Vérifiez vos assiettes HGM avec de jeunes adultes pour s'assurer que les vers ont encore beaucoup de nourriture, et qu'il ya assez de vers pour le dosage (≥ 200 vers par plaque de dosage).
- Lavez les vers hors de plaques HGM avec M9 tampon 11 dans un tube de 15 ml conique. Pour la moindre agitation pendant les lavages, appliquer doucement le tampon M9 en versant quelques millilitres sur la plaque HGM, et mélanger doucement en tournant la plaque pour les vers libres de l'OP50 collante de bactéries. Ensuite, inclinez le plateau, tirer vers le haut de la mémoire tampon M9 / ver mélange du coin de la plaque en utilisant un Pipetman P1000, et le transfert des vers dans le tube 15 ml conique. Si les vers sont encore à gauche sur la plaque, répétez cette étape 1-2X.
Remarque: Rough laver déloge les bactéries hors de la plaque qui peut le faire dans le tube avec les vers. Cette bactérie est impossible de se débarrasser de et peuvent interférer avec les dosages. NE PAS pipeter des vers contre le côté du tube, car cela peut endommager les vers et interférer avec les dosages. - Laissez-les vers se déposent par gravité (NE PAS centrifugeuse). Retirer le surnageant par aspiration et laver avec au moins 3-4 ml de M9. Répéter 2X pour un total de 3 lavages.
Remarque: La centrifugation lors de lave va tirer vers le bas les bactéries restantes dans la population de vers, qui peut interférer avec les dosages. Au lieu de cela, ajouter doucement M9 tampon pour les lavages suivants en le versant directement dans le tube de 15 ml conique. Worms sont déposées au fond du tube doit se mélanger dans la mémoire tampon M9 sur son addition. Si les vers est resté réglé, retourner doucement le tube pour mélanger. - Après le troisième lavage, utiliser une partie de la population de vers pour les essais de chimiotaxie naïve (article 5).
Remarque: Il est essentiel de travailler assez rapidement à toutes les étapes de lavage, que les vers vont commencer à mourir de faim si ils sont assis trop longtemps dans M9 tampon, qui peut augmenter le chimiotactisme naïve envers le butanone. - Ajouter 3-4 ml de tampon M9 au tube de 15 ml conique, laissez-les vers meurent de faim dans le tampon M9 à température ambiante pendant 1 heure (figure 1B, C).
3. Mémoire à court terme associative (massés) Formation
Voir Figure 1B pour le court terme workflow de mémoire associative de dosage.
- A la fin de la période de mourir de faim dans M9 tampon (section 2), série 2 pi de butanone 10% (dans 95% EtOH) à l'intérieur des couvercles de 60 mm de nématodes de croissance des médias (NGM) 11 plaques qui ont été ensemencés avec des 500 ul OP50 E. coli.
Remarque: Une population de départ idéal pour des dosages de mémoire à court et à long terme est ≥ 500 ul de vers. Plaques de conditionnement multiples sont nécessaires pour soutenir par génotype toute la population pendant la formation. Lorsque vous travaillez avec des produits chimiques volatils, ouvert seulement les couvercles des plaques, si nécessaire, en leur laissant fermée à tout autre moment. - Retirer le surnageant de tampon M9 du tube 15 ml coniques de vers affamés par le vide et utiliser un Pipetman P1000 à appliquer 100-200 ul de vers de terre pour les plaques de conditionnement.
Remarque: Essayez d'enlever autant de liquide M9 que possible, afin que les vers peuvent rapidement accéder à la source de nourriture OP50 lors de son transfert vers les plaques de conditionnement. Worms se coller à l'intérieur de l'embout de la pipette et peut être conservé par le pipetage des volumes plus petits. - Incuber les boîtes de conditionnement à température ambiante pendant 1 heure (figure 1B).
- Lavez les vers hors de plaques avec ~ 1 mL de tampon M9 dans un tube de 15 ml conique. Laissez-les vers déposent par gravité. Laver à nouveau 1-2X jusqu'à ce tampon M9 dans le tube est clair.
Remarque: Utilisez les méthodes douces laver décrites dans la section2. Le même 15 ml tube conique peut être utilisé de la section 2. - Après le lavage final, éliminer le surnageant de tampon M9 par le vide, et d'utiliser certaines de la population vis sans fin pour essais de chimiotaxie (section 5) pour tester 1x (massés) apprentissage associatif de l'association des aliments-butanone immédiatement après conditionnement (0 point dans le temps minute ).
Apprendre Index (LI) = CI 0 h - CI Naive. - Transférer la population restante de vers à 60 plaques NGM mm ensemencé avec 500 ul de OP50 (maintenez plaques). Encore une fois, appliquer de 100 à 200 uL de vers par plaque pour s'assurer qu'il n'ya assez de bactéries pour soutenir la population.
Remarque: Le nombre de plaques utilisées par génotype détiennent au moins le nombre de court terme associatives des moments de mémoire à tester. - Incuber post-conditionnement des plaques de 0,5, 1 ou 2 heures (à court terme associative moments de mémoire) à température ambiante (figure 1B).
Remarque: à court terme la mémoire associative de type sauvage des animaux se termine par deux heures après la formation. Points de temps peut-être besoin d'être ajusté pour les génotypes ou de conditions différentes. - Pour tester la mémoire à court terme associatif de l'association des aliments-butanone, après chaque point du temps, lavez doucement vers des assiettes dans un tube de 15 ml conique et à nouveau 1-2X avec le tampon M9. Utilisez des vers pour les dosages de chimiotaxie (article 5). Apprendre Index (LI) = point de temps CI - CI Naive.
Remarque: Utilisez les méthodes lavage doux à la section 2. Pour chaque point de temps, jeter tout des vers supplémentaires qui ne sont pas utilisés dans les essais de chimiotaxie.
4. Mémoire à long terme associative (Spaced) Formation
Voir figure 1C à long terme workflow de mémoire associative de dosage.
- Suivez les étapes 3.1 à 3.2 dans la section 3.
- Incuber les boîtes de conditionnement à température ambiante pendant 30 minutes (figure 1C).
- Suivez l'étape 3.4 de la section 3.
Remarque: Pour rester dans un délai de 30 minutes, on peut commencer tous les lavages pendant la formation à ~ 25 minutes. - Après le lavage final, retirez M9 surnageant par les vers de vide et de transfert à 60 plaques ensemencées NGM mm.
Note: L'utilisation de plusieurs plaques par génotype n'est pas nécessaire à cette étape puisque les vers sont affamés. - Starve sur 60 plaques NGM mm à température ambiante pendant 30 minutes (figure 1C).
- Lavez les vers avec M9 tampon dans le tube de 15 ml conique. Laissez-les vers se déposent par gravité (NE PAS centrifugeuse).
Note: Bien que il devrait y avoir aucune bactérie dans le tampon à ce point, la centrifugation peut être un traitement potentiellement dommageables des vers, et peut perturber la formation de la mémoire à long terme. - Répétez les étapes 4.1 à 4.6 à plusieurs reprises jusqu'à un total de 7 blocs de climatisation et 6 affamer blocs ont été réalisées (figure 1C). (Voir tableau 1 pour une feuille de temps représentatif.)
- Lavez délicatement les vers des assiettes dans le tube 15 ml conique et à nouveau 1-2X avec le tampon M9.
- Après le lavage final, utiliser une partie de la population de vers pour les essais de chimiotaxie (section 5) pour tester 7x (interligne) apprentissage associatif de l'association des aliments-butanone immédiatement après conditionnement (0 point dans le temps l'heure). Apprendre Index (LI) = CI 0 h - CI Naive.
- Transférer la population restante de vers à 100 mm plaques HGM ensemencé avec 1 mL d'OP50 (maintenez plaques). Encore une fois, appliquer de 100 à 200 uL de vers par plaque pour s'assurer qu'il n'ya assez de bactéries pour soutenir la population.
Remarque: Le nombre de plaques utilisées par génotype détiennent au moins le nombre de long terme associatives des moments de mémoire à tester. 100 plaques NGM mm peuvent être utilisés comme post-conditionnement des plaques, mais il faut être très prudent qu'il ya suffisamment OP50 pour soutenir la population de vers de terre pendant au moins 16 heures. - Incuber post-conditionnement des plaques de 16, 24 et 40 heures (à long terme associatives des moments de mémoire) à 20oC (figure 1C).
Remarque: à long terme la mémoire associative de type sauvage des animaux se termine par 40 heures après la formation. Points de temps peut-être besoin d'être ajusté pour les génotypes ou de conditions différentes. - Pour tester la mémoire à long terme associatif de l'association des aliments-butanone, lavez doucement vers des assiettes dans un tube de 15 ml conique et à nouveau 1-2X avec le tampon M9 après chaque point du temps. Utilisez des vers pour les dosages de chimiotaxie (article 5). Apprendre Index (LI) = point de temps CI - CI Naive.
Remarque: Utilisez les méthodes lavage doux à la section 2. Pour chaque point de temps, jeter tout des vers supplémentaires non utilisés dans les essais de chimiotaxie.
5. Chimiotactisme Assay
- Préparer les plaques d'essai de chimiotaxie. Marquer le bas de 100 plaques ensemencées avec des taches NGM mm sur le fond et de chaque côté de la plaque (figure 2A).
Remarque: À moins 3 répétitions par génotype doit être exécuté pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. - Spot 1 uL de 1 M NaN 3 à l'odorant et detache de contrôle (figure 2B).
Note: Ne pas repérer vos assiettes avec cet agent paralysant plus de 15 minutes avant de commencer le dosage, ou le NaN 3 va diffuser à distance à partir des taches, et les animaux deviennent paralysés avant d'atteindre l'odorant ou des taches de contrôle. Soyez prudent de ne pas percer la gélose lors de l'application NaN 3 puisque les vers se creusent dans les zones perforé. - Alors que les vers s'installent dans le tube conique après plusieurs lavages de tampon M9 (section 2), la tache 1 ul chacun de EtOH à 95% et 10% butanone (voir section 7.2) aux endroits appropriés sur la plaque de dosage marqué (figure 2C) sur haut de la préalablement repéré NaN 3.
Remarque: Les produits chimiques doivent être repérés avant d'ajouter que les vers (section 5.4). Prenez note de ce qui spot a EtOH ou butanone. Lorsque vous travaillez avec ces produits chimiques volatiles, veillez à seulement ouvert les couvercles des plaques, si nécessaire, et gardez-les fermés à tout autre moment. - Enlevez autant de la mémoire tampon M9 que possible du tube de vers installés. Utilisez un Pipetman P20 avec une pointe de pré-coupé (voir section 7.3) pour offrir des vers 3X 5 uL (200-400 animaux) à l'origine de la plaque de dosage marqué (figure 2D).
Remarque: Conservez les vers restant dans le tube 15 ml conique pour une utilisation en pré-conditionné affamer et tests de mémoire (sections 2-4). Worms se placer à l'intérieur des embouts de pipette, ajoutant ainsi des vers à la plaque en plus petites quantités conserve votre population ver et réduit la quantité de liquide qui se déclenchera avec les vers sur la plaque de dosage. - Twist le coin d'une Kimwipe à un petit point et l'utiliser pour éponger l'excès du tampon M9. Ceci libérera les vers sur la plaque de dosage (figure 2E).
Remarque: Veillez à ne pas perforer l'agar-agar avec le Kimwipe, sinon vers se creusent à l'origine. Certains vers peuvent être perdus dans cette étape car ils sont tiré dans le Kimwipe avec le tampon M9 quand buvard. Si en utilisant l'imagerie et l'analyse de compter les vers (article 6), de prendre les plaques de la station d'imagerie avant de libérer les vers de l'origine. Une image du ver à l'origine immédiatement après la libération donnera le nombre total d'animaux pour une plaque de dosage. - Incuber la plaque de dosage chimiotactisme pour 1 heure à température ambiante.
- Comptez le nombre de vers à l'origine, EtOH, et les taches butanone (figure 2), ainsi que le nombre total de vers sur la plaque de dosage.
Remarque: Généralement, les vers paralysé par NaN 3 sera dans un rayon ~ 1 cm des taches, et apparaîtra bâton-droite avec de nombreux animaux empilés les uns contre les autres. Si vous utilisez un logiciel d'analyse d'imagerie et de compter les vers (article 6), prendre des images de l'origine, EtOH, et les taches butanone. Une image de la quantité totale des vers devraient avoir été prises dans la section 5.5. Les vers peuvent aussi être «comptés à la main." - Calculer l '«indice chimiotactisme" (CI). IC = ([(n butanone) - (n EtOH )]/[( Total-n 'origine)].
6. Worm comptage par analyse d'image
- Prenez haut contraste noir et blanc des images de vers sur des plaques de dosage chimiotactisme (figure 3A, voir la section 7.4 pour la description de configuration de la caméra). Pour calculer un indice de chimiotactisme, les images sont nécessaires à la butanone, EtOH, et les taches d'origine d'une plaque de dosage chimiotactisme à la fin d'un essai, ainsi que le nombre total de vers (photo de vers à l'origine immédiatement après leur sortie de tampon M9 au début de l'essai, la section 5.5).
Remarque: Les images des plaques d'essai chimiotactisme couvrant environ un rayon de 2 cm autour de chaque spot généralement capturer tous les animaux pour chaque tache. - Assurez-vous que les fichiers de tous les essais d'un point de temps (par exemple naïf, 0 h, etc) sont contenues dans un dossier, nommé de façon appropriée.
- Fichiers pour chaque plaque de chimiotaxie doit être nommé en tant que telle: mais # png (spot butanone, essai #), Ori # png (origine, essai #), eth # png (spot éthanol, le procès de #), # tot png.... (total, le procès de #). (Par exemple, si deux essais ont été effectués pour un point dans le temps, dans le même dossier les fichiers suivants seraient présents: but1.png, but2.png, eth1.png, eth2.png, ori1.png, ori2.png, tot1 . png, tot2.png)
- Ouvrez Matlab (voir section 7.5).
- Dans le "Répertoire courant" ligne dans le haut de la fenêtre de Matlab, de parcourir les dossiers, et choisissez "count_worms_v0.5.3 dossier" (M-files disponible Renseignements supplémentaires).
- Dans le "Command Window", tapez "count_worms_directory ()." Appuyez sur Entrée.
Remarque: La taille par défaut lorsque le ver de cette commande est 10 min, max 80 pixels. Pour ajuster ce basé sur un génotype spécifique ou de stade de développement, de type "count_worms_directory ('minsize', 10 'maxsize', 80)" et changer le nombre de pixels en conséquence. - Lorsque vous êtes invité, choisissez le dossier d'images à analyser.
Remarque: Seul un dossier d'images peuvent être analysées à la fois. - Chaque image dans le dossier en cours d'analyse s'affiche avec un seuil déjà défini, et les particules sélectionnées (figure 3A). Faites glisser l'outil rectangle sur les particules qui ne sont pas sélectionnés pour supprimer les vers eem. Lorsque vous avez terminé avec l'image, appuyez sur la touche Echap.
- Après toutes les images dans le dossier sont vérifiées, 4 colonnes apparaissent dans la fenêtre de commande: nom de l'image (1) (par exemple But1), (2) toujours "[1];» (3) taille de pixel moyenne pour un ver calculée par le programme de l'image en particulier, et (4) le nombre de vers calculé pour être à l'image.
- Une fois que ce programme a été exécuté, il déposera deux. Csv (peut être ouvert que des tableurs Excel) dans le dossier d'images, elle vient d'analyser. Le "worm_counts_stats" fichier fournit les colonnes de sortie dans la fenêtre de commande (article 6.9). Le "worm_counts_summary" fichier fournit 5 colonnes: numéro d'essai (1); nombre de vers dans (2), mais, (3) eth, et (4) points Ori, et (5) le nombre total de vers.
7. Remarques Matériaux
- Pour préparer 100 mm média à forte croissance (HGM) plaques (section 1): Dissoudre 3 g de NaCl, 20 g bactopeptone, et 30 g de Bacto-agar dans 700 ml d'eau distillée. Amener le volume à 1 L avec de l'eau distillée. Après autoclavage, refroidir à 65 ° C agar et ajouter 4 ml de 5 mg / ml de cholestérol dans l'éthanol, 1 ml chacun de 1 M CaCl 2, 1 M MgSO 4, et 25 ml de 1 M KPO 4 (pH = 6,0).
- 95% EtOH est utilisé, comme EtOH pourcentage plus élevé a tendance à contenir des impuretés du procédé de purification qui peuvent affecter les résultats. C'est une bonne idée de faire de la butanone 10% (dans 95% EtOH) de bouillon jusqu'à fraîche chaque fois quelques dosage est exécuté.
- P20 conseils doivent avoir quelques millimètres coupés pour créer un assez grand trou de vers pour passer à travers sans être endommagé. P1000 conseils ont déjà des trous assez grands pour les vers pour passer à travers.
- Le dosage de plaque d'imagerie chimiotactisme station (figure 3B) dans le laboratoire de Murphy contient une caméra Firewire avec une lentille de grossissement variable attachée à une perche. Un rétro-éclairage est placé au fond du stand sous une plateforme d'imagerie personnalisé avec un plateau en verre (figure 3C), qui permet de plaques de dosage chimiotactisme d'être éclairé par le bas. "Mesure et automatisation" logiciel (National Instruments) est utilisé pour capturer des images. Matériaux pour cette station d'imagerie mis en place sont similaires à ceux publiés antérieurement, 12 et peut être trouvé dans la table des réactifs spécifiques et les équipements.
8. Les résultats représentatifs:
Un indice de chimiotactisme typiques naïfs (CI) pour vers de type sauvage pour le butanone 10% est d'environ 0,2 (figure 4A). 6 Massé (1x) ou espacés (7x) de formation augmente généralement l'indice chimiotactisme à 0,7-0,8 au temps 0 (Figure 4A, CD) pour donner un indice d'apprentissage (LI = formés CI -. naïve IC) de 0,6 ~ 6 L'apprentissage qui se produit avec la formation massés ou espacés est très robuste. Un LI de moins de 0,5 se produit généralement quand il ya des problèmes avec le dosage de chimiotactisme naïf, et les animaux ont une CI naïve de 0,3 ou plus. Habituellement, cela se produit parce que les vers sont affamées ou trop bondé sur des plaques de culture entre le blanchiment et le début de l'essai, ou des vers assis trop longtemps dans le tampon M9 entre les lavages et commencent à mourir de faim; odeurs environnementales peuvent aussi augmenter les naïfs CI. Des vers affamés ont une beaucoup plus élevés CI naïf pour le butanone 10% (figure 4B). 6 Nous constatons que des problèmes avec le chimiotactisme naïfs sont généralement réglés avec soin ver améliorée et la culture.
La durée de la mémoire dans ces essais est le temps qu'il faut pour l'indice de chimiotactisme immédiatement après l'entraînement pour revenir à des niveaux naïf, quand l'indice d'apprentissage = 0. En animaux de type sauvage, à court terme la mémoire associative commence généralement à diminuer de 1 heure après l'entraînement massé, dure environ 2 heures, et est indépendante du facteur de transcription CREB (figure 4C). 6 à long terme la mémoire associative n'est généralement pas commencer à considérablement diminuer jusqu'à 16 heures après la formation espacées, dure jusqu'à 40 heures, et est CREB-dépendants (figure 4D) 6 long terme la mémoire associative peut ne pas atteindre son plein potentiel dans plusieurs cas: (1). ver n'ont pas assez OP50 E. coli pendant les périodes de conditionnement de 30 minutes, (2) les bactéries restent dans la mémoire tampon M9 pendant les périodes de famine; ou (3) vers sont endommagés pendant le dosage (par exemple les vers sont pipetés contre le côté du tube).
Les résultats sont généralement statistiquement significatives lorsque quatre ou plusieurs essais de dosage chimiotactisme sont gérés par génotype par point de temps. Exécution de six répétitions par génotype produit généralement des résultats très significatifs, sans devenir trop difficile à gérer, mais les débutants pouvez commencer avec seulement trois répétitions. Généralement, le travail avec 2-3 génotypes ou des conditions à un moment qui est confortable pour ceux qui sont expérimentés avec ces tests d'apprentissage et de mémoire.
Hand-compter les vers sur les plaques de dosage chimiotactisme prend beaucoup de temps, peut ajouter une variabilité entre les expériences de laboratoire ou des copains, et peut également introduire des biais dans l'analyse et jenterpreting données. Worm comptage par analyse d'image (article 6) standardise la collecte de données et d'analyse dans le laboratoire, et en moyenne, réduit le temps d'analyse de données pour les membres de laboratoire expérimenté pour 1 / 5 de celle nécessaire pour le comptage à la main. Lorsque l'on compare les indices calculés en utilisant le chimiotactisme compte le ver manuel pour ceux qui sont déterminés par le logiciel Count_worms, nous trouvons une erreur moyenne de 3,07 (± 1,19)%.
| Jour 1 | |
| Temps | Étape |
| 09:00 | 1 h mourir de faim dans M9 tampon Démarrer naïve chimiotactisme test |
| 10:00 | Condition # 1 (60 mm plaques NGM avec de la nourriture et la butanone), 30 min Fin naïve chimiotactisme test |
| 10:30 | Starve # 1 (60 mm plaques NGM), 30 min |
| 11:00 | Condition n ° 2, 30 min |
| 11:30 | Starve # 2, 30 min |
| 12:00 | Condition n ° 3, 30 min |
| 12:30 | Starve # 3, 30 min |
| 01:00 | Condition n ° 4, 30 min |
| 01:30 | Starve # 4, 30 min |
| 02:00 | Condition n ° 5, 30 min |
| 02:30 | Starve # 5, 30 min |
| 03:00 | Condition n ° 6, 30 min |
| 03:30 | Starve # 6, 30 min |
| 04:00 | Condition n ° 7, 30 min |
| 04:30 | Commencez 0-h chimiotactisme test Transfert vers restants pour tenir les plaques pour les 16 à 40 heures |
| 05:30 | Fin 0-h chimiotactisme test |
| Jour 2 | |
| Temps | Étape |
| 08:30 | Commencez à 16 h chimiotactisme test |
| 09:30 | Fin 16 h test chimiotactisme |
Tableau 1. Échéancier représentant à long terme de dosage mémoire associative. Dans cet exemple, le dosage commence le 1er jour à 9 heures avec une 1-hr mourir de faim. 30 min condition et affamer les périodes sont alternées jusqu'à les vers ont été conditionnés à sept reprises. Essais de chimiotaxie sont gérés au début (naïfs) et fin (0 h) de formation. Le total d'exécution du début à la fin est de 8,5 heures. Worms sur des plaques détiennent sont testés pour le chimiotactisme au butanone à partir du Jour 2, 16-40 heures après la formation.
Figure 1. Court terme et à long terme workflow associatifs test de mémoire. (A) échéancier recommandé de préparation menant à des dosages jour sont effectuées. (B) à court terme de dosage mémoire associative: des vers affamés sont conditionnés pendant 1 heure et testé immédiatement pour l'apprentissage 1x (0 min.) Via des dosages chimiotactisme, ou transférés sur des plaques tenant avec un aliment à 0,5, 1 ou 2 heures après le conditionnement. (C) à long terme de dosage mémoire associative: animaux affamés reçoivent 7 blocs de formation de climatisation / affamés avant d'être testés pour l'apprentissage ou LTAM 16-40 heures après la formation.
Figure 2. Setup test de chimiotaxie. (A) Schéma de la plaque d'essai de chimiotaxie. Des petites taches sont ajoutés à la plaque à l'aide d'une règle ou un autre dispositif de guidage pour marquer l'origine (en bas) et butanone et EtOH (gauche et droite) des taches sur la plaque. (B) 1 ul NaN 3 est ajouté à la butanone et taches EtOH. (C) 1 uL chacun de butanone 10% et 95% EtOH sont ajoutés les taches sur le côté droit ou gauche de la plaque. (D) 200-400 ver en suspension dans du tampon M9 sont ajoutés à l'origine de la plaque. (E) A Kimwipe tordue en un point est utilisé pour absorber tampon M9 et les vers une libération sur la plaque de dosage.
Figure 3. Worm compter avec l'analyse d'image. (A) Exemple de "count_worms_v0.5.3" fenêtre de sélection de l'image de particules. Le programme ouvre originale image à fort contraste noir et blanc (à gauche) sort automatiquement une fenêtre avec une image seuillée (au milieu). L'outil rectangle peut être utilisé pour mettre en évidence et d'éliminer les indésirables non ver "particules", comme les marques de plaque de dosage (1), bords de la plaque (2), ou des perforations de gélose (3). (B) l'image de la station de laboratoire Murphy chimiotactisme imagerie dosage. Plaques de dosage chimiotactisme sont éclairés par le bas pour créer des images à contraste élevé pour l'analyse. (C) Schéma du sur-mesureplateforme d'imagerie utilisés dans la station d'imagerie chimiotaxie.
Figure 4. Typiques apprentissage associatif et les résultats de la mémoire. (A) Les naïfs chimiotactisme indice de vers de type sauvage à des augmentations de 10% sur le butanone massé (1x) de formation. L'association appris nécessite l'appariement des aliments (OP50 E. coli) et la butanone. Numéros dessus des barres représentent l '«indice d'apprentissage» (LI = CITrained - CI Naive). (B) Sauvage chimiotactisme naïve type butanone 10% est fortement accru lorsque les vers sont morts de faim pendant 16 heures. AD Les panneaux sont adaptés de Kauffman et al., 2010. 6 (C) de type sauvage mémoire à court terme associative dure environ 2 heures, et est indépendante du facteur de transcription CREB. (D) de type sauvage à long terme la mémoire associative dure environ 40 heures, et est CREB-dépendants.
Renseignements supplémentaires
Discussion
Le C. elegans apprentissage olfactif associatif et des dosages de mémoire présenté ici de distinguer entre les processus de l'apprentissage massé, l'apprentissage espacées, mémoire à court terme, et mémoire à long terme. Ces tests s'appuient sur les capacités des vers au sens des odeurs alimentaires et chimiques dans leur environnement et 1,2 pour former des associations positives entre les deux. 6 Par conséquent, les dosages sont très sensibles à la famine dans la population de départ des animaux, et un grand soin doit être prises pour s'assurer que les vers sont bien nourris, avant et après la formation. Simple formation massés rendements à court terme la mémoire associative. L'augmentation du nombre de périodes de conditionnement et le paradigme de formation espacées est essentiel pour parvenir à long terme la mémoire associative en C. elegans comme il est dans d'autres organismes. Peut-être 6,8 ce test pourrait être modifié pour produire souvenirs à long terme des associations entre les différents stimuli conditionnés ou non conditionnés.
Notre apprentissage associatif et les tests de mémoire peuvent être utilisées pour comparer les capacités d'apprentissage et de mémoire de type sauvage au vieillissement ou génétique des animaux mutants. Par exemple, alors que les deux apprentissage associatif et à long terme la mémoire associative diminution des capacités dans le vieillissement vers de type sauvage, l'apprentissage est maintenu plus longtemps avec l'âge chez les animaux avec signalisation de l'insuline réduite, et de l'apprentissage et la mémoire est maintenue plus longtemps avec l'âge chez les animaux calorique restreints 6. Ces tests sont également prête à l'ARNi traitement ou la manipulation pharmacologique de C. elegans. Par exemple, le traitement des vers avec daf-2 améliore l'ARNi à court et à long terme la mémoire associative, à l'inverse, le blocage de la transcription génique et la synthèse des protéines avec des médicaments (actinomycine D et la cycloheximide, respectivement) pendant l'entraînement espacés perturbe la formation de la mémoire à long terme. 6
Mémoire à long terme est un processus qui est crucial pour la survie de tous les animaux, et il semble que la plupart des machines moléculaires impliqués dans la mémoire d'une association pavlovien est conservée par les vers pour les mammifères. 6 La capacité de distinguer et de tester l'apprentissage associatif, court terme et mémoire à long terme l'utilisation de ces tests olfactifs fait C. elegans un excellent système pour l'étude plus approfondie de la mémoire, et peut donner un aperçu des processus neurodégénératifs qui conduisent à la perte de l'apprentissage et la mémoire chez les humains.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions W. Ryu pour des conseils sur notre imagerie configuration initiale, Z. Gitaï à la suggestion d'utiliser ImageJ 13 pour compter les vers, et J. Achraf pour les aider avec Google SketchUp. CTM est une bourse d'études Pew dans les sciences biomédicales, un chercheur McKnight, et chercheur Keck.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | S227 | Prepare 1 M concentration in distilled water |
| Ethyl Alcohol 190 Proof | Pharmco-AAPER | DSP-CT-18 | >95% Ethanol may have impurities that interfere with chemotaxis assays |
| 2-Butanone 99+% | Acros Organics | 14967-0010 | |
| Basler IEEE-1394/FireWire Area Scan CMOS Camera | Edmund Scientific | NT56-683 | |
| InfiniMite Video Lens – Alpha Industrial | Edmund Scientific | NT56-202 | |
| Dolan-Jenner MI-150 Fiber Optic Illuminator | Edmund Scientific | NT55-718 | |
| 8” x 8” Backlight | Schott AG | A08927 | |
| Standard Boom Stand | Edmund Scientific | NT54-120 | |
| 3/4” Post Adaptor for Boom Stands | Edmund Scientific | NT54-124 | |
| Standard Fixed 1/4-20 Mounting Plate | Edmund Scientific | NT54-122 |
References
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