細胞内のミトコンドリアの機能をプロファイリングするための方法の説明が表示されます。基礎呼吸速度、ATP -結合型呼吸、プロトンの漏れ、及び予備容量:生成されたミトコンドリアのプロファイルは、1つの実験で測定することができるミトコンドリア機能の4つのパラメータを提供します。
細胞代謝を測定し、ミトコンドリアの機能障害を理解する能力は、肥満のミトコンドリアの機能の役割を理解する上で自分の研究を進めるために世界中の科学者、糖尿病、老化、癌、心血管機能と安全性の毒性を有効にしている。
細胞の代謝は、酸素、グルコース、脂肪酸、およびグルタミン、および酵素的に制御された酸化および還元反応の一連を通して、その後のエネルギー変換などの基質の取り込み、のプロセスです。このような細胞外環境への乳酸やCO 2などのATPの生産、熱や化学副産物のリリースでは、これらの細胞内の生化学反応の結果。
酸素消費速度 – – またはOCR細胞の生理的状態、およびそれらのセルの状態の変化に貴重な洞察力は、細胞、ミトコンドリア呼吸の指標で消費される酸素の割合を測定することによって得ることができる。細胞はまた、解糖、すなわちを通じてATPを生成する:酸素の乳酸、独立へのグルコースの変換。培養ウェル内で、乳酸は、プロトンの主要な源である。またはECAR – 培地の酸性化は、細胞外酸性化速度を提供する原因となる細胞を周囲の細胞外培地中に放出陽子、を介して間接的に生成された乳酸を測定する。
この実験では、C2C12筋芽細胞は、タツノオトシゴの細胞培養プレートの所定の密度で播種する。基礎酸素消費量(OCR)と細胞外酸性化(ECAR)のレートは、ベースラインの速度を確立するために測定されます。その後、細胞を代謝的に細胞の生体エネルギープロファイルをシフトする別の化合物(連続)の三添加によって摂動されています。
このアッセイは、ミトコンドリア評価するために古典的な実験から導出され、ミトコンドリアの生理学的および病態生理学的機能の両方を理解することを目的とした、より複雑な実験を構築するために、ストレスおよび/または侮辱に応答する細胞の能力を予測することでフレームワークとして機能します。
このアッセイは、ミトコンドリアの機能を調べるために古典的な実験から導出され、細胞の代謝、ミトコンドリアの機能、および全体的な生体エネルギーの様々な変化を理解することを目的とした、より複雑な実験を構築することでフレームワークとして機能します。
この実験で使用されるすべての化合物は、最大限の効果を提供する濃度のために最適化する必要があります。つまり、1つは、これらの値を確認するために別々の滴定の実験を実行する必要があります。滴定曲線は非常にシャープになる傾向がある、とあまりにも多くのFCCPは、実際にOCRでの応答を減少させることができるので、これは、FCCPは特に重要です。テストする典型的な範囲は、(最終濃度)のようになります。
上記の各化合物(特にFCCP)への応答をアッセイ培地組成物(基本型、[グルコース]、[ピルビン酸] BSAの、存在/非存在、など)によって影響されることに注意してください。 XFのアッセイ培地組成が変更された場合、さらに、最適化を再実行する必要があります。プレゼンスとピルビン酸の濃度は、FCCPによる最大呼吸の能力を得ることに特に重要です。バイオサイエンスタツノオトシゴは、ピルビン酸の不作為は、FCCPに(ベースラインの上)に最大限に対応する細胞の能力をabrogatesているセルの行数で観察している。通常は、1〜10 mMのピルビン酸の濃度は、最大呼吸を得るためにピルビン酸の至適濃度を理解するためにテストする必要があります。なお、[ピルビン酸]と[グルコース]実験のための最適培地条件を得るために"クロス滴定"になる必要がある。
この実験の典型的な結果は、OCR対時間と、別表示ECAR対時間を示すグラフで、以下に提示されています:
図2。OCR対時間
図3。ECAR対時間
セルが連続する各化合物で処理されるためここでは、OCRとECARで期待される応答を観察した。オリゴマイシンの場合は、OCRは、細胞がOXPHOSを経由してATPを合成することができないので、彼らはATPに対する需要を満たすために解糖に戻すミトコンドリア複合体VでブロックしてATP合成の結果として減少し、従って我々はECARの増加を観察。前述のように、FCCPは、脱共役剤として作用する。細胞は現在、ミトコンドリア内膜を横切るプロトンリークを克服する必要があるため、より多くの酸素がミトコンドリア膜を渡って過剰なプロトンをポンプするために消費されると、OCRが大幅に増加します。最後に、ロテノンは、それぞれ、ミトコンドリア複合体Iと複合体IIIを阻害するには、電子伝達系で停止する電子の流れを引き起こすため、O2の消費量が大幅に削減されます。
図4の呼吸パラメータ
呼吸とECARで予想される変化を超えて、呼吸器のパラメータの数はこのデータから得ることができる。これは、上図にまとめられています。
ここで我々は細胞の基底呼吸、ATPの生産と同様にプロトン勾配を(H +リークが原因で)維持に費やさ金額に捧げられた酸素消費量のパーセントについての情報を取得する可能性があることを参照してください。さらに、我々は非連動呼吸(時々予備の呼吸器の容量と呼ばれる)の条件下で最大呼吸速度を取得することができると最終的に、我々は、ミトコンドリアのプロセスによるものでは酸素消費量を決定することができます。
研究の急増は、細胞の生体エネルギーを評価するミトコンドリアの機能障害を特定し、ストレス及び/または侮辱に応答する細胞の能力を予測するために、このミトコンドリアのプロファイルを採用しています。この実験的な方法と予備の呼吸容量の考え方についての詳細情報および詳細については、以下の資料1-8を参照して参照してください。
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Oligomycin, FCCP, Rotenone and Antimycin A Solutions | Seahorse Bioscience | Seahorse Mito Stress Test Kit | ||
DMEM Running Media | Seahorse Bioscience | 100965-000 | ||
DMSO | Sigma | D8418 | ||
Distilled Water | Gibco | 15230-170 | ||
Calibration buffer | Seahorse Bioscience |