A descrição de um método para caracterização da função mitocondrial em células é fornecido. O perfil mitocondrial gerado fornece quatro parâmetros da função mitocondrial, que pode ser medido em um experimento: taxa de respiração basal, ATP-linked respiração, vazamento de prótons, e capacidade de reserva.
A capacidade de medir o metabolismo celular e compreender a disfunção mitocondrial, permitiu que os cientistas em todo o mundo para fazer avançar a sua investigação na compreensão do papel da função mitocondrial em obesidade, diabetes toxicidade, envelhecimento, câncer, função cardiovascular e segurança.
Metabolismo celular é o processo de absorção do substrato, tais como oxigênio, glicose, ácidos graxos, e glutamina, e subseqüente conversão de energia através de uma série de oxidação enzimática controlada e as reações de redução. Estas reações bioquímicas intracelulares resultam na produção de ATP, a liberação de calor e produtos químicos derivados, tais como lactato e CO 2 no ambiente extracelular.
Informações valiosas sobre o estado fisiológico das células, ea alteração do estado das células, pode ser adquirida através da medição da taxa de oxigênio consumido pelas células, um indicador da respiração mitocondrial – a Taxa de Consumo de Oxigênio – ou OCR. Células também gerar ATP através da glicólise, ou seja: a conversão de glicose em lactato, independente do oxigênio. Em poços de cultura, o lactato é a principal fonte de prótons. Medindo o ácido láctico produzido indiretamente através de prótons lançado no meio extracelular em torno das células, o que provoca a acidificação do meio fornece a taxa de acidificação extra-celular – ou ECAR.
Neste experimento, as células C2C12 mioblastos são semeados a uma densidade dada em placas de cultura de células Seahorse. O consumo de oxigênio basal (OCR) e extracelular acidificação (ECAR) taxas são medidas para determinar as taxas de referência. As células são então metabolicamente perturbado por três adições de compostos diferentes (em sucessão), que mudar o perfil da bioenergética celular.
Este ensaio é derivado de uma experiência clássica para avaliar a mitocôndria e serve como um quadro com o qual construir experiências mais complexas como objetivo compreender a função tanto fisiológicas e fisiopatológicas das mitocôndrias e para prever a habilidade das células de responder ao estresse e / ou insultos.
Este ensaio é derivado da experiência clássica para sondar a função mitocondrial e serve como um quadro com o qual construir experiências mais complexas como objetivo compreender várias mudanças no metabolismo celular, a função mitocondrial, e bioenergética global.
Todos os compostos utilizados neste experimento devem ser otimizados para a concentração que proporciona o efeito máximo. Ou seja, deve-se realizar experimentos de titulação separado para verificar esses valores. Isto é especialmente importante com FCCP, como a curva de titulação tende a ser bastante acentuada, e FCCP em excesso pode realmente diminuir as respostas em OCR. Intervalos típicos (concentração final) para teste seria:
Note-se que as respostas a cada composto acima (especialmente FCCP) será influenciada pela composição do ensaio de mídia (tipo base, [glicose], [piruvato], presença / ausência de BSA, etc). Além disso, se o ensaio XF composição media é alterada, otimização terá de ser re-executadas. A presença e concentração de piruvato é especialmente importante na obtenção da capacidade respiratória máxima, devido à FCCP. Seahorse Bioscience tem observado em um número de linhas de células que omissão de piruvato anula a capacidade das células para responder ao máximo (acima de linha de base) para FCCP. Tipicamente, as concentrações de piruvato mM 10/01 deve ser testado para entender a melhor concentração de piruvato para obter a respiração máxima. Note-se que [piruvato] e [glicose] pode ser necessário "cross-titulada" para obter as condições ideais de mídia para o experimento.
Os resultados típicos deste experimento são apresentados a seguir em um gráfico que mostra OCR vs tempo e outro mostrando ECAR versus tempo:
Figura 2. OCR Tempo vs
Figura 3. ECAR Tempo vs
Aqui observamos as respostas esperadas em OCR e ECAR como as células são tratadas com cada composto sucessivas. Para oligomicina, OCR diminui como resultado do bloqueio da síntese de ATP mitocondrial no Complexo V. Uma vez que as células são incapazes de sintetizar ATP via OXPHOS, voltam a glicólise para atender à demanda de ATP, portanto, observamos um aumento na ECAR. Como mostrado anteriormente, FCCP atua como um agente desacoplamento. Uma vez que as células precisam agora superar o vazamento de prótons através da membrana mitocondrial interna, OCR aumenta significativamente a O2 é consumido mais para bombear o excesso de prótons de volta através da membrana mitocondrial. Finalmente, rotenona inibe mitocondrial Complexo I e Complexo III, respectivamente, o que faz com que o fluxo de elétrons para cessar na cadeia de transporte de elétrons e, assim, o consumo de O2 é reduzido drasticamente.
Figura 4. Respiração parâmetros
Além das alterações esperadas na respiração e ECAR, uma série de parâmetros respiratórios podem ser obtidas a partir destes dados. Isto é resumido na figura acima:
Aqui vemos que podemos obter informações sobre a respiração basal das células, o percentual de consumo de O2 dedicada à produção de ATP, bem como o montante atribuído para a manutenção do gradiente de prótons (H + devido ao vazamento). Além disso, podemos obter a taxa respiratórias máximas em condições de respiração desacoplado (por vezes referido como reposição da capacidade respiratória) e, finalmente, podemos determinar a quantidade de consumo de O2 não devido a processos mitocondriais.
Um número crescente de estudos estão empregando este perfil mitocondrial para avaliar bioenergética celular, identificar disfunção mitocondrial e para prever a habilidade das células de responder ao estresse e / ou insultos. Para mais informações e detalhes sobre este método experimental ea idéia de capacidade respiratória de reserva, por favor veja se referir as seguintes publicações 1-8.
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Oligomycin, FCCP, Rotenone and Antimycin A Solutions | Seahorse Bioscience | Seahorse Mito Stress Test Kit | ||
DMEM Running Media | Seahorse Bioscience | 100965-000 | ||
DMSO | Sigma | D8418 | ||
Distilled Water | Gibco | 15230-170 | ||
Calibration buffer | Seahorse Bioscience |