وتقدم وصفا لطريقة لتوصيف وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا. ملف الميتوكوندريا ولدت يوفر أربعة معلمات وظيفة الميتوكوندريا التي يمكن قياسها في تجربة واحدة : القاعدية معدل التنفس ، والتنفس ATP المرتبطة ، تسرب بروتون ، وقدرة احتياطية.
وقد أتاح القدرة على قياس وفهم الأيض الخلوي الخلل الميتوكوندريا ، والعلماء في جميع أنحاء العالم لتطوير الأبحاث في فهم دور وظيفة الميتوكوندريا في البدانة ، والسكري ، والشيخوخة والسرطان والقلب والأوعية الدموية وظيفة سلامة السمية.
الأيض الخلوي هو عملية امتصاص الركيزة ، مثل الأوكسجين والجلوكوز والأحماض الدهنية ، والجلوتامين ، وبعد تحويل الطاقة من خلال سلسلة من الأكسدة وردود الفعل للرقابة إنزيمي التخفيض. هذه الخلايا نتيجة التفاعلات الكيميائية الحيوية في إنتاج ATP ، والإفراج عن الحرارة والمشتقات الكيميائية ، مثل اللاكتات وCO 2 في البيئة خارج الخلية.
معرفة ثاقبة الحالة الفسيولوجية للخلايا ، وتغيير للدولة من تلك الخلايا ، ويمكن المكتسبة من خلال قياس نسبة الأوكسجين المستهلكة من قبل الخلايا ، وهو مؤشر للتنفس الميتوكوندريا — معدل استهلاك الأوكسجين — أو OCR. توليد الخلايا أيضا من خلال تحلل ATP ، أي : تحويل الجلوكوز لاكتات ومستقلة من الأوكسجين. مثقف في الآبار ، اللاكتات هي المصدر الرئيسي للبروتونات. قياس حامض اللبنيك المنتجة غير مباشر عن طريق البروتونات التي يتم إطلاقها في المتوسط خارج الخلية التي تحيط الخلايا ، والذي يسبب تحمض على المديين المتوسط ويوفر معدل التحمض خارج الخلوي — أو ECAR.
في هذه التجربة ، هي خلايا المصنف myoblast C2C12 في مناطق ذات كثافة معينة في لوحات فرس البحر ثقافة الخلية. ويتم قياس استهلاك الأوكسجين القاعدية (OCR) وخارج الخلية تحمض المعدلات (ECAR) لتحديد معدلات الأساس. ثم يتم التمثيل الغذائي للخلايا بالقلق قبل ثلاثة الإضافات للمركبات مختلفة (على التوالي) التي تحول ملف الطاقة البيولوجية للخلية.
ويستمد هذا الاختبار من التجربة الكلاسيكية لتقييم الميتوكوندريا ويخدم كإطار التي لبناء تجارب أكثر تعقيدا تهدف إلى فهم وظيفة كل من فيزيولوجي والفسيولوجية المرضية من الميتوكوندريا والتنبؤ قدرة الخلايا على الاستجابة للإجهاد و / أو الشتائم.
ويستمد هذا الاختبار من التجربة الكلاسيكية للتحقيق في وظيفة الميتوكوندريا ويخدم كإطار التي لبناء تجارب أكثر تعقيدا تهدف إلى فهم مختلف التغيرات في التمثيل الغذائي للخلية ، وظيفة الميتوكوندريا والطاقة الحيوية بشكل عام.
وينبغي أن يكون الأمثل جميع المركبات المستخدمة في هذه التجربة من أجل التركيز الذي يوفر تأثير القصوى. وهذا هو ، يجب على المرء أن إجراء تجارب للتأكد من معايرة منفصلة هذه القيم. وهذا أمر مهم خصوصا مع FCCP ، ومنحنى المعايرة يميل إلى أن يكون حادا جدا ، والكثير من FCCP يمكن أن تقلل في الواقع الردود في التعرف الضوئي على الحروف. ويتراوح نموذجي (تركيزات النهائي) لاختبار ما يلي :
علما أنه سيتم أثرت في الردود على كل مجمع أعلاه (وخاصة FCCP) من قبل وسائل الاعلام مقايسة التكوين (النوع الأساسي ، [الجلوكوز] ، [البيروفات] ، وجود / غياب جيش صرب البوسنة ، الخ). علاوة على ذلك ، إذا تم تغيير التركيبة XF مقايسة وسائل الاعلام ، وسوف تحتاج إلى التحسين يعاد تنفيذها. وجود وتركيز البيروفات مهم بشكل خاص في الحصول على القدرات التنفسية القصوى بسبب FCCP. وقد لاحظ فرس البحر العلوم البيولوجية في عدد من خطوط الخلايا التي إغفال البيروفات يلغي قدرة الخلايا على الاستجابة إلى الحد الأقصى (فوق خط الأساس) لFCCP. عادة ، يجب اختبار تركيزات البيروفات ملي 10-10 لفهم تركيز الأمثل للحصول على التنفس البيروفات القصوى. علما بأن [البيروفات] و [الجلوكوز] قد تحتاج إلى أن يكون "عبر معاير" للحصول على أفضل الشروط وسائل الاعلام عن التجربة.
وتعرض نتائج هذه التجربة النموذجية أدناه في الرسم البياني يظهر OCR مقابل مرة وآخر مرة يظهر مقابل ECAR :
الشكل 2 دوام مقابل OCR
الشكل 3 دوام مقابل ECAR
لاحظ هنا أننا الردود المتوقعة في التعرف الضوئي على الحروف وECAR كما يتم التعامل مع الخلايا مع كل مجمع المتعاقبة. لoligomycin ، OCR النقصان نتيجة لعرقلة التوليف اعبي التنس المحترفين في مجمع الميتوكوندريا خامسا منذ الخلايا غير قادرة على تجميع ATP عبر OXPHOS ، فإنها تعود إلى تحلل لتلبية مطلبهم لاعبي التنس المحترفين ، وبالتالي فإننا نلاحظ زيادة في ECAR. كما هو موضح سابقا ، FCCP كوكيل uncoupling. منذ الآن يجب أن تتغلب على الخلايا تسرب بروتون عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلية ، والتعرف الضوئي على الحروف بشكل ملحوظ كما استهلكت أكثر O2 ضخ البروتونات الزائدة عبر غشاء الميتوكوندريا. أخيرا ، أنا روتينون يمنع مجمع مجمع الميتوكوندريا والثالث ، على التوالي ، والذي يسبب تدفق الالكترونات توقف في سلسلة نقل الإلكترون ، وبذلك يتم خفض كبير في استهلاك O2.
الشكل 4. التنفس المعلمات
ما وراء التغيرات المتوقعة في التنفس وECAR ، قد حصلت على عدد من المعلمات الجهاز التنفسي من هذه البيانات. وتتلخص هذه في الشكل أعلاه :
هنا نرى أننا قد الحصول على معلومات حول التنفس القاعدية من الخلايا ، في المئة من استهلاك O2 المكرسة لإنتاج ATP فضلا عن المبلغ المخصص لصيانة التدرج بروتون (بسبب تسرب + H). كذلك ، قد نحصل على معدل التنفس في ظل الظروف القصوى للتنفس uncoupled (يشار إليه أحيانا على القدرات التنفسية كما الغيار) ، وأخيرا ، يمكننا تحديد كمية استهلاك O2 لا يرجع الى عمليات الميتوكوندريا.
وهناك عدد متزايد من الدراسات وبسرعة توظيف هذا الملف الميتوكوندريا لتقييم الطاقة الحيوية الخلوية ، وتحديد الخلل الميتوكوندريا والتنبؤ قدرة الخلايا على الاستجابة للإجهاد و / أو الشتائم. لمزيد من المعلومات والتفاصيل حول هذا الأسلوب التجريبي وفكرة قدرة الجهاز التنفسي الغيار ، يرجى الرجوع إلى رؤية المنشورات التالية 1-8.
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Oligomycin, FCCP, Rotenone and Antimycin A Solutions | Seahorse Bioscience | Seahorse Mito Stress Test Kit | ||
DMEM Running Media | Seahorse Bioscience | 100965-000 | ||
DMSO | Sigma | D8418 | ||
Distilled Water | Gibco | 15230-170 | ||
Calibration buffer | Seahorse Bioscience |