Una descripción de un método para crear perfiles de la función mitocondrial en las células se proporciona. El perfil de las mitocondrias generan proporciona cuatro parámetros de la función mitocondrial que se puede medir en un experimento: la tasa de respiración basal, la respiración ATP-linked, fuga de protones, y la capacidad de reserva.
La capacidad de medir el metabolismo celular y comprender la disfunción mitocondrial, ha permitido a los científicos de todo el mundo para avanzar en su investigación en la comprensión del papel de la función mitocondrial en la obesidad, la toxicidad de la diabetes, el envejecimiento, el cáncer, la función cardiovascular y la seguridad.
El metabolismo celular es el proceso de asimilación del sustrato, tales como oxígeno, glucosa, ácidos grasos, y la glutamina, y la conversión de energía posterior a través de una serie de oxidación enzimática controlada y las reacciones de reducción. Estos resultados reacciones bioquímicas intracelulares en la producción de ATP, la liberación de los subproductos de calor y productos químicos, como el lactato y CO 2 en el medio extracelular.
Información valiosa sobre el estado fisiológico de las células, y la alteración del estado de las células, se puede obtener a través de la medición de la tasa de oxígeno consumido por las células, un indicador de la respiración mitocondrial – La tasa de consumo de oxígeno – o OCR. Las células también generar ATP a través de la glucólisis, es decir: la conversión de glucosa a lactato, independiente de oxígeno. En los pozos de cultivo, el lactato es la principal fuente de protones. La medición del ácido láctico producido indirectamente a través de los protones liberados en el medio extracelular que rodea las células, lo que provoca la acidificación del medio proporciona la velocidad de acidificación extracelular – o ECAR.
En este experimento, las células C2C12 mioblastos se sembraron a una densidad dada en placas de cultivo celular Seahorse. El consumo de oxígeno basal (OCR) y las tasas de acidificación extracelular (ECAR) se miden para determinar las tasas de referencia. Las células son metabólicamente perturbada por tres adiciones de diferentes compuestos (en la sucesión) que cambian el perfil bioenergético de la célula.
Este ensayo se deriva de un experimento clásico para evaluar las mitocondrias y sirve como un marco con el cual construir experimentos más complejos destinados a comprender la función tanto fisiológicas y fisiopatológicas de la mitocondria y para predecir la capacidad de las células a responder al estrés y / o insultos.
Este ensayo se deriva del experimento clásico para probar la función mitocondrial y sirve como marco de referencia para crear experimentos más complejos destinados a comprender los diversos cambios en el metabolismo celular, la función mitocondrial, y la bioenergética en general.
Todos los compuestos utilizados en este experimento deben ser optimizados para la concentración que proporciona el máximo efecto. Es decir, uno debe llevar a cabo experimentos separados de valoración para determinar estos valores. Esto es especialmente importante con FCCP, como la curva de valoración tiende a ser bastante fuerte, y FCCP demasiado en realidad puede disminuir las respuestas de OCR. Rangos típicos (concentraciones finales) para poner a prueba sería la siguiente:
Tenga en cuenta que las respuestas a cada compuesto anterior (especialmente FCCP) se verá influido por la composición de ensayo de los medios de comunicación (tipo base, [glucosa], [piruvato], la presencia / ausencia de BSA, etc.) Además, si el ensayo de los medios de comunicación XF composición se modifica la optimización será necesario volver a realizar. La presencia y concentración de piruvato es especialmente importante en la obtención de la capacidad respiratoria máxima debido a FCCP. Seahorse Bioscience ha observado en una serie de líneas de células que la omisión de piruvato anula la capacidad de las células a responder al máximo (por encima de línea de base) para FCCP. Por lo general, las concentraciones de piruvato 1-10 mm debe ser probado para entender la concentración óptima de piruvato para obtener la respiración máxima. Tenga en cuenta que [piruvato] Y [glucosa] puede ser necesario "cross-titulada" para obtener las condiciones óptimas para los medios de comunicación el experimento.
Los resultados típicos de este experimento se presentan a continuación en un gráfico que muestra OCR en función del tiempo y otra que muestra el tiempo frente a ECAR:
Figura 2. OCR frente a tiempo
Figura 3. ECAR frente a tiempo
Aquí observamos las respuestas esperadas en OCR y ECAR ya que las células se tratan con cada compuesto sucesivas. Para oligomicina, OCR disminuye como resultado de bloqueo de la síntesis de ATP mitocondrial en el Complejo V. Dado que las células son incapaces de sintetizar ATP a través de la fosforilación oxidativa, vuelven a la glicólisis para satisfacer su demanda de ATP, por lo que se observa un aumento de la ECAR. Como se indica anteriormente, FCCP actúa como un agente de desacoplamiento. Dado que las células deben ahora superar la pérdida de protones a través de la membrana mitocondrial interna, OCR aumenta significativamente a medida que más se consume O2 para bombear el exceso de protones al otro lado de la membrana mitocondrial. Por último, la rotenona inhibe la mitocondria del complejo I y III Complex, respectivamente, lo que hace que el flujo de electrones a cesar en la cadena de transporte de electrones, y por lo tanto el consumo de O2 se reduce drásticamente.
Figura 4. Respiración parámetros
Más allá de los cambios esperados en la respiración y la ECAR, una serie de parámetros respiratorios pueden ser obtenidos a partir de estos datos. Esto se resume en la figura anterior:
Aquí vemos que podemos obtener información acerca de la respiración basal de las células, el porcentaje de consumo de O2 dedicada a la producción de ATP, así como el monto destinado a mantener el gradiente de protones (H + debido a la fuga). Además, podemos obtener el máximo de la frecuencia respiratoria en condiciones de respiración desacoplada (a veces conocido como la capacidad respiratoria de repuesto) y, finalmente, podemos determinar la cantidad de consumo de O2 no se debe a los procesos de las mitocondrias.
Un creciente número de estudios que utilizan este perfil mitocondrial para evaluar la bioenergética celular, identificar la disfunción mitocondrial y para predecir la capacidad de las células a responder al estrés y / o insultos. Para más información y detalles acerca de este método experimental y la idea de la capacidad respiratoria de repuesto, consulte refieren a las siguientes publicaciones 1-8.
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Oligomycin, FCCP, Rotenone and Antimycin A Solutions | Seahorse Bioscience | Seahorse Mito Stress Test Kit | ||
DMEM Running Media | Seahorse Bioscience | 100965-000 | ||
DMSO | Sigma | D8418 | ||
Distilled Water | Gibco | 15230-170 | ||
Calibration buffer | Seahorse Bioscience |