Summary
माउस मूत्राशय दीवार इंजेक्शन orthotopically मूत्राशय स्टेम सेल और कैंसर जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी तरीका है. इस नाजुक microsurgical विधि सावधान तकनीक और अभ्यास के साथ महारत हासिल किया जा सकता है.
Abstract
माउस मूत्राशय दीवार इंजेक्शन orthotopically स्टेम सेल, चिकनी पेशी, और कैंसर जीव विज्ञान सहित मूत्राशय घटना, अध्ययन के लिए एक उपयोगी तकनीक है. इंजेक्शन शुरू करने से पहले, शल्य चिकित्सा क्षेत्र साबुन और पानी और एंटीसेप्टिक समाधान के साथ साफ होना चाहिए. सर्जिकल उपकरणों का उपयोग करने से पहले और प्रत्येक जानवर के बीच निष्फल होना चाहिए. प्रत्येक माउस साँस isoflurane संज्ञाहरण के तहत रखा गया है (प्रेरण के लिए 2-5%, रखरखाव के लिए 1-3%) और उसके मूत्राशय कैंची के साथ एक midline पेट चीरा द्वारा उजागर. अगर मूत्राशय भरा हुआ है, यह आंशिक रूप से दो उंगलियों के बीच कोमल फैलाएंगे द्वारा decompressed है. ब्याज की सेल निलंबन intramurally मूत्राशय एक 29 या 30 गेज सुई और 1 सीसी या छोटे सिरिंज का उपयोग कर गुंबद की दीवार में अंतःक्षिप्त है. घाव तो घाव क्लिप और एक वार्मिंग पैड पर ठीक करने के लिए अनुमति दी माउस का उपयोग बंद कर दिया है. मूत्राशय दीवार इंजेक्शन एक नाजुक microsurgical तकनीक है कि अभ्यास के साथ महारत हासिल किया जा सकता है.
Protocol
1. माउस मूत्राशय दीवार इंजेक्शन
माउस तनाव, उम्र और सेक्स के विकल्प प्रयोगात्मक की जरूरत से तय है. हम उम्र के 8 और 12 सप्ताह के बीच चूहों का उपयोग करें, क्योंकि यह प्रतिरक्षाविज्ञानी परिपक्वता की एक खिड़की senescence से पहले है. एक सामान्य दिशानिर्देश के रूप में, चूहों में कम से कम एक सप्ताह के प्रयोगात्मक हेरफेर से पहले आने के क्रम में तनाव प्रेरित कारकों से बचने के लिए चाहिए.
- साबुन और पानी के साथ शल्य मेज की सतह को साफ करें.
- Cide swipes या एंटीसेप्टिक वाइप्स के साथ शल्य मेज की सतह को साफ कर लें.
- साफ शल्य चिकित्सा उपकरणों से पहले आटोक्लेव शल्य चिकित्सा में उपयोग करने के लिए.
- इसके अलावा, गर्म मनका अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ के साथ शल्य चिकित्सा उपकरणों को तुरंत पहले बाँझ उपयोग करने के लिए, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सर्जरी के दौरान पशुओं के बीच.
- 100 μL हैमिल्टन सीरिंज और 29 या 30 (1 / 2 इंच लंबी) गेज दोहराया आकांक्षा और पूर्ण शराब के साथ पहले का उपयोग करने से पहले इंजेक्शन द्वारा और अंतिम शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के अंत में सुई साफ़.
- धो और निष्फल प्रत्येक जानवर के बीच खारा फॉस्फेट बफर के साथ हैमिल्टन सीरिंज कुल्ला.
- उन्हें एक isoflurane प्रेरण कक्ष में 2-5% के बीच isoflurane सेट के साथ रखकर चूहों anesthetize.
- एक बार सामान्य संज्ञाहरण हासिल की है, और एक गर्म पैड के साथ लापरवाह स्थिति में चैम्बर जगह से माउस को हटाने के नीचे सामान्य शरीर का तापमान बनाए रखने में मदद करने के लिए.
- एक isoflurane भाप बनकर (1-3% से titrated आवश्यक के रूप में उपयुक्त संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए) युक्त नोजल में पशु थूथन रखकर रखरखाव संज्ञाहरण पाना.
- कतरनी के साथ पेट की त्वचा दाढ़ी.
- एक डिस्पोजेबल, बाँझ सर्जिकल कपड़ा प्रयोग गुदा को कवर करने के लिए सर्जरी के दौरान fecal प्रदूषण को रोकने के.
- एक दूसरे प्रयोज्य, बाँझ सर्जिकल कपड़ा का प्रयोग करने के लिए शल्य चिकित्सा के क्षेत्र (पेट के निचले हिस्से) को कवर.
- तैयारी Betadine - लथपथ धुंध के तीन टुकड़े के साथ पेट. इस कदम को तीन बार दोहराएँ.
- आवर्धन के लिए एक विदारक सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, कैंची के साथ एक कम midline पेट चीरा बनाते हैं.
- मूत्राशय बेनकाब.
- अगर मूत्राशय भरा हुआ है, आंशिक रूप से यह गुंबद पर कोमल नीचे दबाव से दबाव हटाना.
- नमूना समाधान (50 μL) सुई, एक 29 या 30 गेज सुई और सिरिंज का उपयोग कर सुई के बेवल ऊपर का सामना करना पड़ के साथ मूत्राशय गुंबद (अंदर इंजेक्शन) की दीवार में.
- सिरिंज के सवार पुश मूत्राशय दीवार में नमूना समाधान इंजेक्षन. एक अच्छी तरह से स्थानीयकृत छाला मूत्राशय दीवार में कोशिकाओं के सफल इंजेक्शन का एक संकेत है.
- सिरिंज निकालें, घाव क्लिप के साथ चीरा बंद और एक वार्मिंग पैड पर माउस को ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं.
2. प्रतिनिधि परिणाम:
एक अच्छी तरह से स्थानीयकृत छाला है कि रिसाव तरल पदार्थ नहीं करता है और आकार में स्थिर रहता है मूत्राशय की दीवार (चित्रा 1) में कोशिकाओं के सफल इंजेक्शन का एक संकेत है. Histological विश्लेषण मूत्राशय दीवार में इंजेक्शन कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है है.
चित्रा 1 सफल मूत्राशय दीवार चित्रण के लिए भारत स्याही का उपयोग इंजेक्शन के उदाहरण.
चित्रा 2 प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के योजनाबद्ध.
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Discussion
माउस मूत्राशय दीवार इंजेक्शन मूत्राशय दीवार की परिभाषित क्षेत्रों में विशिष्ट कक्षों का आरोपण के लिए अनुमति देता है. इस तकनीक मूत्राशय कैंसर, चिकनी पेशी, और स्टेम कोशिका जीव विज्ञान के माउस मॉडल के लिए विस्तृत आवेदन किया है. परिभाषा के अनुसार, माउस मूत्राशय दीवार इंजेक्शन एक orthotopic स्थान में मूत्राशय कैंसर या स्टेम सेल की शुरूआत की सुविधा इतनी है कि उनके विकास और भेदभाव physiologically प्रासंगिक शारीरिक संदर्भ में अध्ययन किया जा सकता है. वास्तव में, Dinney एट अल. पहले इस तकनीक का वर्णन क्रम में नग्न चूहों में 1 orthotopic मानव मूत्राशय कैंसर xenografts का अध्ययन.
जबकि मूत्राशय दीवार इंजेक्शन तकनीक मूत्राशय कैंसर और स्टेम सेल 1-9 अध्ययन का एक संख्या में उपयोग किया गया है, यह केवल प्रयोग किया जाता विधि नहीं है. कई वैज्ञानिकों का नग्न चूहों में चमड़े के नीचे, intraperitoneal, या अंतःशिरा इंजेक्शन द्वारा मूत्राशय कैंसर कोशिकाओं का प्रत्यारोपण करने की कोशिश की है, लेकिन इन मॉडलों को उम्मीद के मुताबिक tumorigenicity और metastatic गुण है कि vivo में सेल लाइनों में 11-13 का चयन की अनुमति नहीं प्रदर्शन किया है. इसके अलावा, वहाँ मूत्राशय कैंसर मॉडल है जो ट्यूमर 14 कोशिकाओं के साथ चूहों के transurethral टीका पर भरोसा के एक नंबर रहे हैं . मूत्राशय carcinogenesis posits के एक प्रमुख सिद्धांत है कि ट्यूमर के प्रसार के कैंसर कोशिकाओं द्वारा सामान्य urothelium "बोने" द्वारा होता है मूत्र पथ में कहीं से मूत्र धारा में बहाया. इस दृष्टिकोण से, transurethral टीका, जो मूत्राशय की luminal ओर से कैंसर की कोशिकाओं को urothelium के जोखिम में परिणाम मूत्राशय दीवार इंजेक्शन की तुलना में अधिक प्रासंगिक physiologically हो सकता है. हालांकि, transurethral टीका नहीं प्रत्यक्ष कर सकते हैं जहां कोशिकाओं को अपने मूत्राशय के भीतर प्रत्यारोपण जाएगा.
इसके विपरीत में, मूत्राशय दीवार इंजेक्शन द्वारा orthotopic मूत्राशय ट्यूमर आरोपण लगातार मूत्राशय की दीवार में स्थित ट्यूमर का उत्पादन कर सकते हैं. इस प्रकार, इस पद्धति का भी चिकनी मांसपेशियों और स्टेम सेल जीव विज्ञान 3, 5, 9 के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है.
इस तकनीक में, सुई आकार और सिरिंज महत्वपूर्ण हैं. हमने पाया है कि आधा इंच लंबी, 29 और 30 गेज सुई मूत्राशय दीवार इंजेक्शन के लिए सबसे अच्छा कर रहे हैं. अब सुई अधिक मृत अंतरिक्ष जो बर्बाद inocula और कम सटीक इंजेक्शन मात्रा में योगदान कर सकते है. व्यापक सुइयों (28 गेज या कम) मुश्किल कर रहे हैं के साथ इंजेक्षन, और बड़ी सुई पटरियों जो आसानी से इंजेक्शन सामग्री हटा करने के लिए नेतृत्व. हम 100 microliter हैमिल्टन सीरिंज का उपयोग करें, क्योंकि वे वांछित मात्रा के बेहद सटीक प्रशासन की अनुमति. इसके अलावा, कोशिकाओं और मलबे को आसानी से और एकत्रित कर रहे हैं जबकि इंजेक्शन सुई के अंत में clumped. इस प्रकार, सेल निलंबन सिरिंज और सिरिंज में तैयार किया जा रहा है और सुई बार बार प्रत्येक इंजेक्शन के बीच बाँझ सामान्य नमक के साथ साफ किया जाना चाहिए से पहले अच्छी तरह से मिश्रित चाहिए. हमने पाया है कि न्यूनतम, सटीक इंजेक्शन की मात्रा लगभग 10 microliters है. कोई और अधिक की तुलना में लगभग 50 microliters माउस मूत्राशय इंजेक्शन ऊतक के छोटे आकार के कारण दीवार में इंजेक्ट किया जा सकता है. भारत स्याही का उपयोग इंजेक्शन novices के द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता करने में मदद की पुष्टि वे उचित तकनीक का उपयोग कर रहे हैं. माउस प्रक्रियाओं के साथ अनुभवी व्यक्तियों के लिए सीखने की अवस्था कम है. मूत्राशय दीवार इंजेक्शन केवल 5-10 चूहों के बाद लगभग 100% सफलता दर के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है है. हम आशा करते है कि माउस microsurgery के साथ अपरिचित श्रमिकों के लिए भी बहुत ही उच्च सफलता दर 10-15 चूहों के भीतर प्राप्त किया जाना चाहिए. इंजेक्शन विफलता चूहों नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
अंत में, मूत्राशय दीवार इंजेक्शन मूत्राशय में परिभाषित स्थानों के लिए कोशिकाओं के अत्यधिक लक्षित वितरण में परिणाम, यह मूत्राशय के जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए एक अत्यंत आकर्षक विकल्प बना सकते हैं. बहरहाल, इस तकनीक का एक संबद्ध सीखने की अवस्था है और समय और मास्टर करने के लिए अभ्यास की आवश्यकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम कृतज्ञता स्टैनफोर्ड बाल चिकित्सा अनुसंधान और NIDDK से फंड K08DK087895-01 से एक पायलट अनुदान के समर्थन को स्वीकार करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| 29 or 30 gauge needles | Hamilton Co | 7803-06 or 7803-07 | |
| 100 microliter syringe | Hamilton Co | 7656-01 |
References
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