Summary
Injection de mur souris vessie est une approche utile pour l'étude des cellules souches orthotopique de la vessie et la biologie du cancer. Cette méthode microchirurgicale délicates peuvent être maîtrisées avec une technique minutieuse et pratique.
Abstract
Injection de mur souris vessie est une technique utile pour étudier les phénomènes orthotopique vessie, y compris les cellules souches, le muscle lisse, et la biologie du cancer. Avant de commencer les injections, la zone chirurgicale doit être nettoyé avec du savon et de l'eau et une solution antiseptique. Équipements chirurgicaux doivent être stérilisés avant leur utilisation et entre chaque animal. Chaque souris est placée sous anesthésie à l'isoflurane inhalées (2-5% pour l'induction, de 1-3% pour l'entretien) et sa vessie exposée par une incision abdominale médiane avec des ciseaux. Si la vessie est pleine, elle est partiellement décompressées par serrant doucement entre deux doigts. La suspension de cellules d'intérêt est intra-muros injectée dans la paroi du dôme de la vessie à l'aide d'une aiguille de calibre 29 ou 30 et 1 cc ou moins seringue. La plaie est ensuite fermée à l'aide des clips de la plaie et la souris a permis de récupérer sur un pad réchauffement. Injection de paroi de la vessie est une technique de microchirurgie délicate qui peut être maîtrisé avec la pratique.
Protocol
1. Injection mur souris vessie
Choix de la souche de souris, l'âge et le sexe est dicté par les besoins expérimentaux. Nous utilisons des souris entre 8 et 12 semaines d'âge, puisque c'est une fenêtre de maturité immunologique avant la sénescence. En règle générale, les souris doivent arriver au moins une semaine avant la manipulation expérimentale, afin d'éviter le stress induit par des facteurs confondants.
- Nettoyer la surface de la table de chirurgie avec du savon et l'eau.
- Essuyez la surface de la table chirurgicale avec Swipes Cide ou des lingettes antiseptiques.
- Autoclave nettoyer les instruments chirurgicaux avant de l'utiliser en chirurgie.
- En outre, les stériliser les instruments chirurgicaux avec stérilisateur à billes chaudes immédiatement avant l'utilisation, ainsi qu'entre les animaux pendant la chirurgie.
- Nettoyez 100 uL seringues Hamilton et 29 ou de calibre 30 (1 / 2 pouce de long) d'aiguilles par aspiration et l'injection répétée d'alcool absolu avant la première utilisation et à la fin de la procédure chirurgicale définitive.
- Lavez et rincez les seringues stérilisées Hamilton avec un tampon phosphate salin entre chaque animal.
- Anesthetize souris en les plaçant dans une chambre d'induction isoflurane, avec l'ensemble isoflurane entre 2-5%.
- Une fois l'anesthésie générale est atteint, retirez la souris de la chambre et le placer dans la position couchée avec un tampon chaud en dessous pour aider à maintenir la température normale du corps.
- Réaliser une anesthésie de maintenance en plaçant le museau de l'animal dans une buse contenant vaporisent l'isoflurane (titré à partir de 1-3% comme nécessaire pour maintenir une anesthésie appropriée).
- Raser la peau de l'abdomen avec une tondeuse.
- Utilisez un jetable, drapé chirurgical stérile pour couvrir l'anus pour empêcher la contamination fécale pendant la chirurgie.
- Utilisez un deuxième jetables, drapé chirurgical stérile pour couvrir le champ opératoire (abdomen inférieur).
- Préparation de l'abdomen avec trois morceaux de gaze imbibée de Bétadine. Répétez cette étape trois fois.
- En utilisant un microscope à dissection pour l'agrandissement, faire une incision médiane inférieure abdominale avec des ciseaux.
- Exposer la vessie.
- Si la vessie est pleine, le décompresser partiellement par une pression douce à la baisse de la coupole.
- Injecter la solution échantillon (jusqu'à 50 pi), en utilisant une aiguille de calibre 29 ou 30 et une seringue, dans la paroi de la vessie de la coupole (injection intra-muros) avec le biseau de l'aiguille vers le haut.
- Poussez le piston de la seringue pour injecter la solution d'échantillon dans la paroi vésicale. Une bulle bien localisée est une indication de l'injection réussie des cellules dans la paroi vésicale.
- Retirez la seringue, à proximité de l'incision avec des pinces de la plaie et permettent de récupérer la souris sur un pad réchauffement.
2. Les résultats représentatifs:
Une bulle bien localisées qui ne fluide fuite et reste stable dans la taille est une indication de l'injection réussie des cellules dans la paroi vésicale (figure 1). L'analyse histologique peut être effectuée pour confirmer la présence des cellules injectées dans la paroi de la vessie.
Figure 1. Exemple d'injection vésicale mur de succès en utilisant l'encre de Chine pour l'illustration.
Figure 2. Schéma des procédures expérimentales.
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Discussion
Injection de la vessie mur de la souris permet l'implantation de cellules spécifiques dans des domaines précis de la paroi vésicale. Cette technique a des applications large pour les modèles murins de cancer de la vessie, le muscle lisse, et la biologie des cellules souches. Par définition, l'injection mur de souris vessie facilite l'introduction du cancer de la vessie ou de cellules souches dans un endroit orthotopique de sorte que leur croissance et leur différenciation peut être étudiée dans un contexte physiologiquement pertinents anatomique. En fait, Dinney et al. décrite pour la première de cette technique afin d'étudier orthotopique humains xénogreffes de cancer de la vessie chez la souris nude 1.
Alors que la technique d'injection vésicale mur a été utilisé dans un certain nombre de cancers de la vessie et des études sur les cellules souches 1-9, ce n'est pas la seule méthode utilisée. De nombreux scientifiques ont essayé d'implanter les cellules vésicales cancéreuses à des souris nude par voie sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse, mais ces modèles n'ont pas montré tumorigénicité prévisible et que les propriétés métastatiques permettre la sélection de lignées de cellules in vivo dans les 11-13. En outre, il existe un certain nombre de modèles de cancer de la vessie qui reposent sur l'inoculation des souris transurétrale avec des cellules tumorales 14. Une théorie de premier plan de la vessie postule que la carcinogenèse propagation de la tumeur se fait par «ensemencement» des urothélium normale par les cellules cancéreuses versé dans le flux urinaire d'ailleurs dans les voies urinaires. Dans cette perspective, l'inoculation transurétrale, qui aboutit à l'exposition de l'urothélium aux cellules cancéreuses de la face luminale de la vessie, peut-être plus physiologiquement pertinents que l'injection paroi de la vessie. Toutefois, l'inoculation transurétrale ne peut pas diriger, où les cellules vont se implant dans la vessie.
En revanche, l'implantation orthotopique tumeur de la vessie par injection paroi de la vessie peut toujours produire des tumeurs situées dans la paroi de la vessie. Ainsi, cette méthode peut également être appliquée à des études de muscles lisses et biologie des cellules souches 3, 5, 9.
Dans cette technique, la taille des aiguilles et seringues sont critiques. Nous avons constaté que ½ pouce de long, 29 et 30 aiguilles de calibre sont les meilleurs pour l'injection paroi de la vessie. Longer aiguilles ont plus d'espace de morts qui peuvent contribuer à inoculums gaspillage et les volumes d'injection moins précis. Large aiguilles (calibre 28 ou inférieur) sont difficiles à injecter, et conduire à des pistes grosse aiguille qui facilement extruder matériau injecté. Nous utilisons 100 microlitres seringues Hamilton, car elles permettent l'administration de haute précision des volumes souhaités. En outre, les cellules et les débris sont facilement agrégées et agglutinées à l'extrémité de l'aiguille pendant l'injection. Ainsi, la suspension cellulaire doit être bien mélangé avant d'être aspiré dans la seringue et la seringue et l'aiguille doit être nettoyé avec plusieurs reprises une solution saline normale stérile entre chaque injection. Nous avons constaté que le minimum, le volume exact injectables est d'environ 10 microlitres. Pas plus d'environ 50 microlitres peut être injecté dans la paroi vésicale souris à cause de la petite taille du tissu injecté. Injection en utilisant l'encre de Chine peut être utilisé par des novices pour aider à confirmer qu'ils sont en utilisant la bonne technique. La courbe d'apprentissage pour les personnes expérimentées avec les procédures de la souris est courte. Injections paroi de la vessie peut être réalisée avec près de 100% des taux de succès après seulement souris 5-10. Nous prévoyons que, même pour les travailleurs peu familiers avec la souris la microchirurgie, les taux de réussite très élevé devrait être réalisable dans les 10-15 souris. Souris panne d'injection peuvent être utilisés comme témoins négatifs.
En conclusion, l'injection paroi de la vessie peut entraîner de livraison très ciblée de cellules à des endroits définis dans la vessie, ce qui en fait une option très attrayante pour les études de la biologie de la vessie. Néanmoins, cette technique a une courbe d'apprentissage associée et nécessite du temps et de pratique pour maîtriser.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à souligner l'appui d'une subvention de projet pilote du Fonds de recherche de Stanford pédiatrique et K08DK087895-01 du NIDDK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| 29 or 30 gauge needles | Hamilton Co | 7803-06 or 7803-07 | |
| 100 microliter syringe | Hamilton Co | 7656-01 |
References
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