Summary
Fare mesane duvar enjeksiyon orthotopically mesane kök hücre ve kanser biyolojisi incelemek için yararlı bir yaklaşımdır. Bu hassas mikrocerrahi yöntemi dikkatli tekniği ve uygulamaları ile hakim olabilir.
Abstract
Fare mesane duvarında enjeksiyonu, kök hücre, düz kas ve kanser biyolojisi dahil olmak üzere mesane olgu, orthotopically incelemek için yararlı bir tekniktir. Enjeksiyonlar başlamadan önce, cerrahi alanda, su ve sabunla ve antiseptik solüsyon ile temizlenmesi gerekir. Cerrahi teçhizat kullanımdan önce ve her hayvan arasında sterilize edilmelidir. Her bir fare inhale izofluran anestezi altında yerleştirilir (indüksiyon için% 2-5, bakım için% 1-3) ve mesane makas ile karın orta hat kesi yaparak maruz kalmaktadır. Mesane doluysa, iki parmak arasında sıkarak nazik tarafından kısmen sıkıştırılmış. Ilgi hücre süspansiyonu intramural 29 veya 30 iğne ve 1 cc ya da daha küçük bir şırınga kullanarak mesane kubbe duvarın içine enjekte edilir. Sonra yara yara klipleri ve ısıtıcı kurtarmak için izin fare kullanılarak kapatılır. Mesane duvar enjeksiyon, hassas bir mikrocerrahi tekniği uygulama ile hakim olabilir.
Protocol
1. Fare mesane Duvar Enjeksiyon
Fare suşu, yaş ve cinsiyet seçimi, deneysel ihtiyaçlarına göre belirlenir. Bu immünolojik olgunluk, yaşlılık önce bir penceredir bu yana, 8 ile 12 hafta arasında yaş fareler kullanın. Genel bir kural olarak, farelerin stres kaynaklı karıştırıcı faktörlerin önlemek için deneysel manipülasyon en az bir hafta önce gelmelisiniz.
- Cerrahi masa yüzeyi sabun ve su ile temizleyin.
- Cide Swipes'ı veya antiseptik mendil ile cerrahi masa yüzeyi silin.
- Cerrahi kullanımdan önce temiz cerrahi aletler Otoklav.
- Ayrıca, kullanımı hemen önce sıcak boncuk sterilizatör cerrahi aletlerin sterilize yanı sıra ameliyat sırasında hayvanlar arasında.
- 100 mcL Hamilton şırınga ve 29 veya 30 gauge (1 / 2 inç uzun) İlk kullanımdan önce mutlak alkol ile tekrarlanan aspirasyon ve enjeksiyon ve son cerrahi işlemin sonunda iğne temizleyin.
- Hamilton her hayvan arasındaki fosfat tamponlu salin solüsyonu steril şırıngalar yıkayın ve durulayın.
- Izofluran% 2-5 arasında, izofluran indüksiyon odasında yerleştirerek farelerin anestezisi.
- Genel anestezi sağlandıktan sonra normal vücut ısısını korumaya yardımcı olmak için altında, sıcak bir ped ile yatar pozisyonda odası ve yerden fare kaldırmak.
- Memesi izofluran buharlaştırmak (uygun anestezi korumak için gerekli olarak% 1-3 oranında titre) içeren bir hayvanın burnu koyarak bakım anestezi elde edin.
- Kesme makineleri ile karın cilt Tıraş.
- Ameliyat sırasında dışkı bulaşmasını önlemek için anüs karşılamak için tek kullanımlık, steril cerrahi örtü kullanın.
- (Alt karın) cerrahi alanında karşılamak için ikinci bir tek, steril cerrahi örtü kullanın.
- Hazırlık üç adet Betadine batırılmış gazlı bez ile karın. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
- Büyütme diseksiyon mikroskobu kullanarak, daha düşük bir makas ile karın orta hat kesi olun.
- Mesane Açığa.
- Mesane dolu ise, kısmen kubbe hafifçe aşağı doğru basınç sıkıştırın.
- Duvar içine iğne yukarı bakacak şekilde eğim ile mesane kubbesi (içi enjeksiyon), 29 veya 30 iğne ve şırınga kullanılarak, örnek solüsyonu (50 mcL kadar) enjekte edilir.
- Mesane duvar içine örnek solüsyon enjekte etmek için şırınga pistonu itin. İyi lokalize bleb mesane duvar içine hücreleri başarılı enjeksiyon bir göstergesidir.
- Şırınga çıkarın yara klipler ile kesi yakın ve fareyi bir ısıtıcı kurtarmak için izin.
2. Temsilcisi Sonuçlar:
Kaçak sıvı değildir ve büyüklüğü sabit kalır iyi lokalize bleb mesane duvar (Şekil 1) içine hücrelerin başarılı bir enjeksiyon bir göstergesidir. Mesane duvarında enjekte edilen hücrelerin varlığını doğrulamak için histolojik analiz yapılabilir.
Şekil 1 örnek olması için Hindistan mürekkep kullanarak başarılı mesane duvar enjeksiyon örneği.
Şekil 2 deneysel prosedürleri şematik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fare mesane duvarında enjeksiyon mesane duvar tanımlanmış alanlara belirli hücrelerin implantasyonu için sağlar. Bu teknik, mesane kanseri, düz kas ve kök hücre biyolojisi fare modelleri için geniş bir uygulama alanı vardır. Büyüme ve farklılaşma fizyolojik ilgili anatomik bağlamında ele böylece tanımı gereği, fare mesane duvar enjeksiyon ortotopik bir konuma mesane kanseri ya da kök hücrelerin giriş kolaylaştırır. Aslında, Dinney ve ark. ilk çıplak farelerin 1 ortotopik insan mesane kanseri xenografts araştırmak için bu tekniği tanımlamıştır.
Mesane duvarı, mesane kanseri ve kök hücre çalışmaları 1-9 çok sayıda enjeksiyon tekniği kullanılmıştır olsa da, kullanılan tek yöntem değildir . Birçok bilim adamı tarafından çıplak farelere subkutan, intraperitoneal veya intravenöz enjeksiyon mesane kanseri hücrelerini implant denedi, ancak bu modellerin öngörülebilir Tümör Gelişimi ve in vivo hücre hatları 11-13 seçimine izin metastatik özellikleri sergilenmektedir değil . Ayrıca, farelerde tümör hücrelerinin 14 transüretral aşılama güveniyor mesane kanseri modelleri vardır. Tümör yayılmış kanser hücreleri tarafından normal ürotelyum "tohumlama" oluşur önde gelen mesane karsinogenez öne süren teorisi, idrar yollarında başka, idrar akışı içine döken. Bu açıdan bakıldığında, luminal tarafında mesane kanser hücreleri ürotelium'un maruz kalma sonucu transüretral aşılama, mesane duvarına enjeksiyon daha fazla fizyolojik ilgili olabilir. Ancak, transüretral aşılama hücreleri mesane içinde kendilerini implant nerede doğrudan değil.
Buna karşılık, mesane duvar enjeksiyon yoluyla ortotopik mesane tümörü implantasyon sürekli mesane duvarında bulunan tümörler üretebilir. Böylece düz kas ve kök hücre biyolojisi 3, 5, 9 çalışmalar, bu yöntem de uygulanabilir olabilir.
Bu teknikte, iğne büyüklüğü ve şırınga kritik öneme sahiptir. Biz ½ uzun inç, 29 ve 30 numaralı insülin iğnesi mesane duvar enjeksiyon için en iyi olduğunu buldular. Daha uzun iğneler, israf inocula ve daha az hassas enjeksiyon hacimleri katkıda bulunabilir daha ölü boşluk var. Daha geniş bir iğne (28 gauge veya daha düşük) ile enjekte ve kolaylıkla enjekte malzemeyi çıkarmak büyük iğne parçaları neden zordur. Istenen miktarları son derece hassas bir yönetime izin çünkü 100 mikrolitrelik Hamilton şırınga kullanabilirsiniz. Buna ek olarak, hücreler ve enkaz kolaylıkla toplanır ve enjekte ederken iğne sonunda clumped. Böylece, hücre süspansiyonu, şırınga ve şırınga içine çekilir ve iğne tekrar tekrar her enjeksiyon arasındaki steril serum fizyolojik ile temizlenmelidir önce iyice karıştırılır olmalıdır. Biz, en az doğru enjektabl hacmi yaklaşık 10 mikrolitre olduğunu buldular. 50 yaklaşık daha mikrolitre, enjekte edilen doku küçük boyutu nedeniyle fare mesane duvarında içine enjekte edilebilir. Hindistan mürekkep kullanılarak enjeksiyon uygun tekniği kullanılarak teyit yardımcı olmak için yeni başlayanlar tarafından kullanılabilir. Fare prosedürleri ile deneyimli kişiler için öğrenme eğrisi kısadır. Mesane duvar enjeksiyonları sadece 5-10 fareler sonra yaklaşık% 100 başarı oranları ile yapılabilir. Fare mikrocerrahi ile yabancı işçiler için bile, çok yüksek başarı oranları 10-15 fareler içinde ulaşılabilir olması gerektiğini tahmin ediyoruz. Enjeksiyon yetmezliği fareler, negatif kontrol olarak kullanılabilir.
Sonuç olarak, mesane duvar enjeksiyon mesane biyoloji çalışmaları için son derece cazip bir seçenek haline, mesane tanımlanan yerlerde hücrelerinin yüksek oranda hedeflenen teslim neden olabilir. Bununla birlikte, bu teknik ilişkili bir öğrenme eğrisi vardır ve master için zaman ve pratik gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz minnetle NIDDK Stanford Pediatrik Araştırma Fonu ve K08DK087895-01 Pilot hibe desteği kabul etmiş sayılırsınız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| 29 or 30 gauge needles | Hamilton Co | 7803-06 or 7803-07 | |
| 100 microliter syringe | Hamilton Co | 7656-01 |
References
- Dinney, C. P., Fishbeck, R., Singh, R. K., Eve, B., Pathak, S., Brown, N., Xie, B., Fan, D., Bucana, C., Fidler, I. J., Killion, J. J. Isolation and Characterization of Metastatic Variants from Human Transitional Cell Carcinoma Passaged by Orthotopic Implantation in Athymic Nude Mice. The Journal of Urology. 154, 1532-1538 (1995).
- Singh, A. V., Franke, A. A., Blackburn, G. L., Zhou, J. Soy Phytochemicals Prevent Orthotopic Growth and Metastasis of Bladder Cancer in Mice by Alterations of Cancer Cell Proliferation and Apoptosis and Tumor Angiogenesis. Cancer Res. 66, 1851-1858 (2006).
- Yanagiuchi, A., Miyake, H., Nomi, M., Takenaka, A., Fujisawa, M. Modulation of the Microenvironment by Growth Factors Regulates the In Vivo Growth of Skeletal Myoblasts. BJU International. 103, 1569-1573 (2009).
- Miyake, H., Hara, I., Yamanaka, K., Gohji, K., Arakawa, S., Kamidono, S. Overexpression of Bcl-2 Enhances Metastatic Potential of Human Bladder Cancer Cells. British Journal of Cancer. 79, 1651-1656 (1999).
- Chancellor, M. B., Yokoyama, T., Tirney, S., Mattes, C. E., Ozawa, H., Yoshimura, N., Groat, W. C. de, Huard, J. Preliminary Results of Myoblast Injection into the Urethra and Bladder Wall: a Possible method for the Treatment of Stress Urinary Incontinence and Impaired Detrusor Contractility. Neurourol Urodyn. 19, 279-287 (2000).
- Dinney, C. P., Tanguay, S., Bucana, C. D., Eve, B. Y., Fidler, I. J. Intravesical Liposomal Muramyl Tripeptide Phosphatidylethanolamine Treatment of Human Bladder Carcinoma Growing in Nude Mice. J Interferon Cytokine Res. 15, 585-592 (1995).
- Mohamedali, K. A., Kedary, D., Sweeney, P., Kamaty, A., Davisy, D. W., Evey, B. Y., Huangy, S., Thorpez, P. E., Dinney, C. P., Rosenblum, M. G. The Vascular-targeting Fusion toxin VEGF121/rGel Inhibits the Growth of Orthotopic Human Bladder Carcinoma Tumors. Neoplasia. 7, 912-920 (2005).
- Slaton, J. W., Perrotte, P., Inoue, K., Dinney, C. P., Fidler, I. J. Interferon-α-mediated Down-Regulation of Angiogenesis-related Genes and Therapy of Bladder Cancer Are Dependent on Optimization of Biological Dose and Schedule. Clinical Cancer Research. 5, 2726-2734 (1999).
- Yokoyama, T., Huard, J., Pruchnic, R., Yoshimura, N., Qu, Z., Cao, B., De Groat, W. C., Kumon, H., Chancellor, M. B. Muscle-Derived Cell Transplantation and Differentiation into Lower Urinary Tract Smooth Muscle. Urology. 57, 826-831 (2001).
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse Orthotopic Models for Bladder Cancer Research. BJU International. 104, 1286-1291 (1988).
- Russell, P. J., Jelbart, M., Wills, E., Singh, S., Wass, J., Witherspoon, J., Raghavan, D. Establishment and characterization of a new human bladder cancer cell line showing features of squamous and glandular differentiation. Int. J. Cancer. 41, 74-74 (1988).
- Ahlering, T. E., Dubeau, L., Jones, P. A. A new in vivo model to study invasion and metastasis of human bladder carcinoma. Cancer Res. 41, 6660-6660 (1987).
- Heaney, J. A., Omellas, E. P., Daly, J. J., Lin, J. C., Rout, G. R. In vivo growth of human bladder cancer cell lines. Invest. Urol. 15, 380-380 (1978).
- Hadaschik, B., Black, P., Sea, J., Metwalli, A., Fazli, L., Dinney, C., Gleave, M., So, A. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumor inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
