Summary
حقن الفأر جدار المثانة هو نهج مفيد لدراسة orthotopically المثانة الخلايا الجذعية وعلم الأحياء السرطان. يمكن أن يتقن هذه الطريقة المجهرية الدقيقة مع تقنية دقيقة والممارسة.
Abstract
حقن الفأر جدار المثانة هي تقنية مفيدة لدراسة الظواهر orthotopically المثانة ، بما في ذلك الخلايا الجذعية ، العضلات الملساء ، وعلم الأحياء السرطان. قبل البدء في الحقن ، يجب تنظيف المنطقة الجراحية بالماء والصابون ومحلول مطهر. يجب تعقيم المعدات الجراحية قبل الاستخدام ، وبين كل حيوان. يتم وضع كل الماوس تحت التخدير isoflurane استنشاقه (2-5 ٪ للتحريض ، 1-3 ٪ للصيانة) والمثانة لها كشفها بواسطة صنع شق خط الوسط في البطن مع المقص. إذا كانت المثانة ممتلئة ، فمن ضغط جزئيا لطيف الضغط بين إصبعين. يتم حقن intramurally تعليق خلية من الاهتمام في جدار القبة المثانة باستخدام إبرة قياس 29 أو 30 و 1 سم أو أصغر المحاقن. ثم يتم إغلاق الجرح باستخدام مقاطع الجرح وسمح لاسترداد الماوس على لوحة الاحتباس الحراري. حقن المثانة الجدار هو أسلوب المجهرية الدقيقة التي يمكن أن يتقن مع الممارسة.
Protocol
1. حقن المثانة الماوس الجدار
وأملت اختيار سلالة الفأر ، والعمر ، والجنس ، وفقا لاحتياجات التجريبية. نستخدم الفئران بين 8 و 12 أسبوعا من العمر ، حيث أن هذه هي نافذة من النضج المناعية قبل الشيخوخة. كمبدأ عام ، يجب أن تصل الفئران على الأقل قبل أسبوع واحد للتلاعب التجريبية بغية تجنب التوتر الناجم عن عوامل خارجية.
- تنظيف سطح الطاولة الجراحية بالصابون والماء.
- مسح سطح الطاولة الجراحية مع احدث الضربات الشديدة أو مناديل مطهرة.
- الأوتوكلاف الأدوات الجراحية النظيفة قبل استخدامها في الجراحة.
- بالإضافة إلى ذلك ، مع تعقيم الأدوات الجراحية معقمة حبة الساخنة مباشرة قبل استخدامها ، وكذلك بين الحيوانات أثناء الجراحة.
- محاقن نظيفة 100 ميكرولتر هاميلتون و 29 أو 30 مقياس (1 / 2 بوصة طويلة) بواسطة الإبر والحقن التطلع المتكررة مع الكحول المطلق قبل الاستخدام لأول مرة وعند نهاية الإجراء الجراحي النهائي.
- غسل وشطف المحاقن المعقمة هاميلتون مع الفوسفات مخزنة المالحة بين كل الحيوانات.
- تخدير الفئران عن طريق وضعها في غرفة isoflurane الاستقراء ، مع مجموعة isoflurane بين 2-5 ٪.
- متى تم تحقيق التخدير العام ، وإزالة الماوس من الغرفة ووضعه في موقف ضعيف مع وسادة دافئة تحت للمساعدة في الحفاظ درجة حرارة الجسم طبيعية.
- تحقيق التخدير الصيانة عن طريق وضع أنف الحيوان في فوهة تحتوي على تبخير isoflurane (معاير من 1-3 ٪ حسب الضرورة للحفاظ على التخدير المناسبة).
- حلق جلد البطن مع لوس انجليس كليبرز.
- استخدام ، ثنى الجراحية المعقمة المتاح لتغطية فتحة الشرج لمنع تلوث برازي أثناء الجراحة.
- استخدام الثاني ، ثنى الجراحية المعقمة المتاح لتغطية الجراحي الميداني (أسفل البطن).
- الإعدادية في البطن مع ثلاث قطع من الشاش Betadine غارقة. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
- باستخدام مجهر تشريح للتضخم ، وجعل الدنيا شق البطن خط الوسط مع المقص.
- تعرض المثانة.
- إذا كانت المثانة ممتلئة ، ضغط جزئيا من قبل الضغط النزولي لطيف في القبة.
- حقن محلول العينة (تصل إلى 50 ميكرولتر) ، وذلك باستخدام إبرة قياس 29 أو 30 والمحاقن ، في جدار القبة المثانة (حقن جماعية) مع شطبة من الإبرة التي تواجه صعودا.
- دفع المكبس من حقنة لحقن محلول العينة في جدار المثانة. وفقاعة جيدا المترجمة هو مؤشر على نجاح حقن الخلايا في جدار المثانة.
- إزالة المحاقن ، وإغلاق شق الجرح مع لقطات والسماح الماوس لاستعادة العافية الاقتصادية على منصة ارتفاع حرارة الارض.
2. ممثل النتائج :
وفقاعة جيدا المترجمة التي لا تسرب السوائل ويبقى مستقرا في الحجم هو دليل على نجاح حقن الخلايا في جدار المثانة (الشكل 1). ويمكن إجراء التحليل النسيجي للتأكد من وجود حقن الخلايا في جدار المثانة.
الشكل 1. مثال لنجاح حقن المثانة الحائط باستخدام الحبر الهند التوضيح.
الشكل 2. تخطيطي الإجراءات التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
حقن الفأر جدار المثانة يسمح للزرع خلايا معينة في مناطق محددة من جدار المثانة. هذه التقنية لها تطبيقات واسعة لنماذج الماوس من مرض سرطان المثانة ، العضلات الملساء ، وبيولوجيا الخلايا الجذعية. بحكم التعريف ، وحقن الماوس جدار المثانة يسهل إدخال سرطان المثانة أو الخلايا الجذعية في مكان مثلي بحيث يمكن دراستها نموها والتمايز في سياق التشريحية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. في الواقع ، Dinney وآخرون. أول وصف لهذه التقنية من أجل دراسة مثلي سرطان المثانة الإنسان xenografts في الفئران عارية 1.
في حين تم الاستفادة من تقنية حقن جدار المثانة في عدد من سرطان المثانة ودراسات الخلايا الجذعية 1-9 ، وأنها ليست الطريقة الوحيدة المستخدمة. وقد حاول العديد من العلماء لزرع خلايا سرطان المثانة في الفئران عارية من قبل تحت الجلد ، داخل الصفاق ، أو الحقن في الوريد ، ولكن هذه النماذج لم تعرض tumorigenicity يمكن التنبؤ بها والخصائص التي تسمح المنتشر في اختيار خطوط الخلايا الحية 11-13. وعلاوة على ذلك ، هناك عدد من النماذج سرطان المثانة التي تعتمد على التلقيح عبر الاحليل من الفئران باستخدام خلايا الورم 14. تسلط نظرية الرائدة في مجال يفترض المثانة ورم السرطان التي تنتشر يحدث من قبل "بذور" من الظهارة البولية طبيعية من الخلايا السرطانية في مجرى البول من أماكن أخرى في المسالك البولية. من هذا المنظور ، قد التلقيح عبر الاحليل ، والذي ينتج من التعرض الظهارة البولية لخلايا السرطان من الجانب اللمعية من المثانة ، أن يكون أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية حقن جدار المثانة. ومع ذلك ، يمكن تلقيح عبر الاحليل غير مباشرة حيث سيتم زرع الخلايا نفسها داخل المثانة.
في المقابل ، يمكن مثلي زرع ورم المثانة عن طريق الحقن في جدار المثانة تنتج باستمرار الأورام الموجودة في جدار المثانة. وبالتالي ، يمكن أيضا أن تطبق هذه الطريقة لدراسات العضلات الملساء وبيولوجيا الخلايا الجذعية 3 ، 5 ، 9.
في هذه التقنية ، وحجم الإبر والمحاقن حاسمة. لقد وجدنا أن نصف بوصة طويلة ، والإبر قياس 29 و 30 هي الأفضل للحقن جدار المثانة. تعد الإبر وجود مساحة مزيد من القتلى والتي يمكن أن تساهم في تبديد قائح وأحجام حقن أقل دقة. أوسع الإبر (28 أو أقل تقدير) من الصعب ضخ معها ، وتؤدي إلى مسارات الإبرة الكبيرة التي قذف حقن المادة بسهولة. نحن نستخدم 100 ميكروليتر المحاقن هاميلتون لأنها تسمح إدارة دقيقة للغاية المنشودة من وحدات التخزين. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تجميعها بسهولة الخلايا والحطام وتجمعت في نهاية الإبرة بينما بالحقن. وبالتالي ، ينبغي أن تكون مختلطة تعليق الخلية جيدا قبل الانجرار الى حقنة والمحاقن والإبر يجب تنظيفها بشكل متكرر مع المالحة العادي العقيمة بين كل حقنة. لقد وجدنا أن ودقيقة كحد أدنى حجم للحقن حوالي 10 microliters. ويمكن حقن أي أكثر من حوالي 50 في microliters الماوس جدار المثانة نتيجة لصغر حجم أنسجة حقن. ويمكن استخدام الحقن باستخدام الحبر الهند لمساعدة المبتدئين تؤكد أنها تستخدم تقنية سليمة. منحنى التعلم للأفراد من ذوي الخبرة مع إجراءات الماوس قصيرة. يمكن إجراء الحقن جدار المثانة مع ما يقرب من 100 ٪ نسبة النجاح بعد الفئران فقط 50-10. ونحن نتوقع أنه حتى بالنسبة للعمال غير مألوف مع الماوس المجهرية ، ومعدلات نجاح عالية جدا وينبغي أن يكون قابلا للتحقيق خلال 10-15 الفئران. ويمكن استخدام حقن الفئران كما فشل ضوابط السلبية.
في الختام ، يمكن حقن المثانة نتيجة الجدار في التسليم الموجه للغاية من الخلايا إلى أماكن محددة في المثانة ، مما يجعلها خيارا جذابا للغاية لدراسات البيولوجيا المثانة. ومع ذلك ، فإن هذا الأسلوب له منحنى التعلم المرتبطة بها ، ويتطلب الوقت والممارسة لاتقان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نحن الامتنان على الدعم من منحة رائدة من ستانفورد للأبحاث صندوق الأطفال و01 - K08DK087895 من جوائز كبيرة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| 29 or 30 gauge needles | Hamilton Co | 7803-06 or 7803-07 | |
| 100 microliter syringe | Hamilton Co | 7656-01 |
References
- Dinney, C. P., Fishbeck, R., Singh, R. K., Eve, B., Pathak, S., Brown, N., Xie, B., Fan, D., Bucana, C., Fidler, I. J., Killion, J. J. Isolation and Characterization of Metastatic Variants from Human Transitional Cell Carcinoma Passaged by Orthotopic Implantation in Athymic Nude Mice. The Journal of Urology. 154, 1532-1538 (1995).
- Singh, A. V., Franke, A. A., Blackburn, G. L., Zhou, J. Soy Phytochemicals Prevent Orthotopic Growth and Metastasis of Bladder Cancer in Mice by Alterations of Cancer Cell Proliferation and Apoptosis and Tumor Angiogenesis. Cancer Res. 66, 1851-1858 (2006).
- Yanagiuchi, A., Miyake, H., Nomi, M., Takenaka, A., Fujisawa, M. Modulation of the Microenvironment by Growth Factors Regulates the In Vivo Growth of Skeletal Myoblasts. BJU International. 103, 1569-1573 (2009).
- Miyake, H., Hara, I., Yamanaka, K., Gohji, K., Arakawa, S., Kamidono, S. Overexpression of Bcl-2 Enhances Metastatic Potential of Human Bladder Cancer Cells. British Journal of Cancer. 79, 1651-1656 (1999).
- Chancellor, M. B., Yokoyama, T., Tirney, S., Mattes, C. E., Ozawa, H., Yoshimura, N., Groat, W. C. de, Huard, J. Preliminary Results of Myoblast Injection into the Urethra and Bladder Wall: a Possible method for the Treatment of Stress Urinary Incontinence and Impaired Detrusor Contractility. Neurourol Urodyn. 19, 279-287 (2000).
- Dinney, C. P., Tanguay, S., Bucana, C. D., Eve, B. Y., Fidler, I. J. Intravesical Liposomal Muramyl Tripeptide Phosphatidylethanolamine Treatment of Human Bladder Carcinoma Growing in Nude Mice. J Interferon Cytokine Res. 15, 585-592 (1995).
- Mohamedali, K. A., Kedary, D., Sweeney, P., Kamaty, A., Davisy, D. W., Evey, B. Y., Huangy, S., Thorpez, P. E., Dinney, C. P., Rosenblum, M. G. The Vascular-targeting Fusion toxin VEGF121/rGel Inhibits the Growth of Orthotopic Human Bladder Carcinoma Tumors. Neoplasia. 7, 912-920 (2005).
- Slaton, J. W., Perrotte, P., Inoue, K., Dinney, C. P., Fidler, I. J. Interferon-α-mediated Down-Regulation of Angiogenesis-related Genes and Therapy of Bladder Cancer Are Dependent on Optimization of Biological Dose and Schedule. Clinical Cancer Research. 5, 2726-2734 (1999).
- Yokoyama, T., Huard, J., Pruchnic, R., Yoshimura, N., Qu, Z., Cao, B., De Groat, W. C., Kumon, H., Chancellor, M. B. Muscle-Derived Cell Transplantation and Differentiation into Lower Urinary Tract Smooth Muscle. Urology. 57, 826-831 (2001).
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse Orthotopic Models for Bladder Cancer Research. BJU International. 104, 1286-1291 (1988).
- Russell, P. J., Jelbart, M., Wills, E., Singh, S., Wass, J., Witherspoon, J., Raghavan, D. Establishment and characterization of a new human bladder cancer cell line showing features of squamous and glandular differentiation. Int. J. Cancer. 41, 74-74 (1988).
- Ahlering, T. E., Dubeau, L., Jones, P. A. A new in vivo model to study invasion and metastasis of human bladder carcinoma. Cancer Res. 41, 6660-6660 (1987).
- Heaney, J. A., Omellas, E. P., Daly, J. J., Lin, J. C., Rout, G. R. In vivo growth of human bladder cancer cell lines. Invest. Urol. 15, 380-380 (1978).
- Hadaschik, B., Black, P., Sea, J., Metwalli, A., Fazli, L., Dinney, C., Gleave, M., So, A. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumor inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
