Summary
Vescica iniezione del mouse muro è un approccio utile per lo studio delle cellule staminali ortotopicamente della vescica e della biologia del cancro. Questo metodo microchirurgico delicato può essere padroneggiato con tecnica attenta e pratica.
Abstract
Vescica iniezione del mouse muro è una tecnica utile per lo studio dei fenomeni ortotopicamente vescica, tra cui cellule staminali, muscolo liscio, e la biologia del cancro. Prima di iniziare le iniezioni, l'area chirurgica devono essere pulite con acqua e sapone e soluzione antisettica. Strumenti chirurgici devono essere sterilizzati prima dell'uso e tra ogni animale. Ogni mouse è posta sotto anestesia per via inalatoria isoflurano (2-5% per l'induzione, 1-3% per la manutenzione) e la sua vescica esposti facendo una incisione addominale mediana con le forbici. Se la vescica è piena, è parzialmente decompresso dalla spremitura delicata tra due dita. La sospensione di cellule di interesse è intramurale iniettato nella parete della cupola della vescica con un 29 o 30 gauge e 1 cc o più piccoli siringa. La ferita viene poi chiusa con clip ferita e il topo ha permesso di recuperare su un blocco del riscaldamento. Parete vescicale iniezione è una tecnica microchirurgica delicato che può essere masterizzato con la pratica.
Protocol
1. Topo iniezione parete della vescica
Scelta del ceppo di topi, l'età e il sesso è dettata da esigenze sperimentali. Noi usiamo topi tra 8 e 12 settimane di età, dal momento che questo è una finestra di maturità immunologica prima senescenza. Come regola generale, i topi dovrebbero arrivare almeno una settimana prima di manipolazione sperimentale al fine di evitare fattori di confondimento indotta da stress.
- Pulire la superficie del tavolo operatorio con acqua e sapone.
- Pulire la superficie del tavolo operatorio con Swipes Cide o salviette antisettico.
- Autoclave pulizia degli strumenti chirurgici prima di utilizzare in chirurgia.
- Inoltre, sterilizzare strumenti chirurgici con sterilizzatore a caldo tallone immediatamente prima dell'uso, così come tra gli animali durante l'intervento.
- Pulire 100 microlitri siringhe Hamilton e 29 o 30 gauge (1 / 2 pollice di lunghezza), aghi da aspirazione ripetute e iniezione con alcool assoluto prima del primo utilizzo e, alla fine della procedura chirurgica definitiva.
- Lavaggio e risciacquo siringhe Hamilton con sterilizzati PBS tra ogni animale.
- Anestetizzare topi mettendoli in una camera di induzione isoflurano, con il set isoflurano tra 2-5%.
- Una volta che l'anestesia generale si ottiene, rimuovere il mouse dalla camera e posto in posizione supina con un batuffolo di caldo sotto per aiutare a mantenere la normale temperatura corporea.
- Ottenere l'anestesia manutenzione mettendo muso dell'animale in un ugello che contiene vaporizzare isoflurano (titolato dal 1-3% se necessario per mantenere l'anestesia del caso).
- Rasatura della pelle addominale con Clippers.
- Utilizzare un monouso, telino sterile chirurgico per coprire l'ano per evitare la contaminazione fecale durante l'intervento.
- Utilizzare un secondo usa e getta, telino sterile chirurgico per coprire il campo operatorio (basso addome).
- Prep all'addome con tre pezzi di garza imbevuta di Betadine. Ripetere questa operazione tre volte.
- Utilizzando un microscopio da dissezione di ingrandimento, fare abbassare un'incisione addominale mediana con le forbici.
- Esporre la vescica.
- Se la vescica è piena, parzialmente da decomprimere delicata pressione verso il basso la cupola.
- Iniettare la soluzione del campione (fino a 50 mL), con un calibro 29 o 30 aghi e siringhe, nella parete della cupola vescicale (iniezione intramurale) con la smussatura dell'ago verso l'alto.
- Spingere lo stantuffo della siringa per iniettare la soluzione di esempio nella parete della vescica. A ben localizzato bleb è un'indicazione di iniezione di successo delle cellule nella parete della vescica.
- Rimuovere la siringa, chiudere l'incisione con clip ferita e permettono di recuperare il mouse su un blocco del riscaldamento.
2. Rappresentante dei risultati:
A ben localizzato bleb che non fluido perdite e resta stabile in dimensioni è un'indicazione di iniezione di successo delle cellule nella parete della vescica (Figura 1). L'analisi istologica può essere eseguito per confermare la presenza delle cellule iniettate nella parete della vescica.
Figura 1. Esempio di iniezione di successo parete vescicale utilizzando inchiostro di china per l'illustrazione.
Figura 2. Schematica delle procedure sperimentali.
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Discussion
Vescica iniezione del mouse parete permette l'impianto di cellule specifiche in determinati settori della parete vescicale. Questa tecnica ha applicazioni gamma di modelli murini di cancro alla vescica, muscolo liscio, e biologia delle cellule staminali. Per definizione, la vescica di iniezione del mouse parete facilita l'introduzione di cancro della vescica o di cellule staminali in una posizione ortotopico in modo che la loro crescita e differenziazione possono essere studiati in un contesto fisiologicamente rilevanti anatomica. In realtà, Dinney et al. primo ha descritto questa tecnica per studiare ortotopico umano xenotrapianti cancro della vescica in topi nudi 1.
Mentre la parete vescicale tecnica di iniezione è stato utilizzato in un certo numero di cancro alla vescica e gli studi sulle cellule staminali 1-9, non è l'unico metodo utilizzato. Molti scienziati hanno cercato di impiantare le cellule di cancro della vescica nei topi nudi per via sottocutanea, intraperitoneale, o per iniezione endovenosa, ma questi modelli non hanno mostrato tumorigenicità prevedibile e le proprietà metastatiche che permettono la selezione di linee di cellule in vivo 11-13. Inoltre, ci sono una serie di modelli di cancro alla vescica che si basano su inoculazione transuretrale di topi con cellule tumorali 14. Una teoria postula leader di carcinogenesi della vescica che si verifica la diffusione del tumore dalla "semina" di dell'urotelio normali da parte delle cellule tumorali rilasciato nel flusso urinario da altre parti del tratto urinario. Da questa prospettiva, l'inoculazione transuretrale, che si traduce in esposizione dell'urotelio alle cellule tumorali dal lato luminale della vescica, può essere più fisiologicamente rilevanti da quello a iniezione parete della vescica. Tuttavia, l'inoculazione transuretrale non può dirigere in cui le cellule si saranno impianto all'interno della vescica.
Al contrario, l'impianto ortotopico tumore della vescica mediante iniezione vescica muro può produrre costantemente i tumori localizzati nella parete della vescica. Così, questo metodo può essere applicato anche agli studi della muscolatura liscia e biologia delle cellule staminali 3, 5, 9.
In questa tecnica, le dimensioni di aghi e siringhe sono critici. Abbiamo scoperto che ½ pollice di lunghezza, 29 e 30 aghi calibro sono i migliori per l'iniezione a parete della vescica. Aghi più lunghi hanno più spazio morto che possono contribuire alla inoculi sprecato e volumi di iniezione meno precisi. Più ampia aghi (28 gauge o inferiore) sono difficili da iniettare con, e portare a tracce ago grandi che facilmente estrudere materiale iniettato. Utilizziamo 100 microlitri siringhe Hamilton perché permettono l'amministrazione ad alta precisione dei volumi desiderati. Inoltre, le cellule e detriti sono facilmente aggregati e aggregata alla fine l'ago durante l'iniezione. Così, la sospensione cellulare devono essere miscelati bene prima di essere aspirata nella siringa e la siringa e l'ago devono essere ripetutamente lavati con soluzione fisiologica sterile fra ogni iniezione. Abbiamo trovato che il minimo, il volume precisa iniettabili è di circa 10 microlitri. Non più di circa 50 microlitri può essere iniettato nella parete vescicale del mouse a causa delle ridotte dimensioni del tessuto iniettato. Iniezione utilizzando inchiostro di china può essere utilizzato da principianti per aiutare a confermare che stanno utilizzando la tecnica corretta. La curva di apprendimento per le persone con esperienza con le procedure del mouse è breve. Iniezioni parete della vescica può essere eseguita con i tassi di quasi il 100% di successo dopo solo topi 5-10. Ci aspettiamo che anche per i lavoratori non hanno familiarità con il mouse microchirurgia, i tassi di successo molto alto dovrebbe essere realizzabile in 10-15 topi. Topi fallimento di iniezione possono essere utilizzati come controlli negativi.
In conclusione, l'iniezione parete della vescica può causare la consegna altamente mirato delle cellule nei punti definiti nella vescica, il che rende un'opzione molto interessante per gli studi di biologia della vescica. Tuttavia, questa tecnica ha una curva di apprendimento associata e richiede tempo e pratica per padroneggiare.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Noi riconosciamo con gratitudine il supporto di una borsa di studio pilota del Fondo Stanford Research Pediatrica e K08DK087895-01 dal NIDDK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| 29 or 30 gauge needles | Hamilton Co | 7803-06 or 7803-07 | |
| 100 microliter syringe | Hamilton Co | 7656-01 |
References
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