Summary
Mus blåsväggen injektion är en användbar metod för orthotopically studera celler i urinblåsan stamceller och cancer biologi. Denna delikata mikrokirurgisk metod kan bemästras med noggrann teknik och praktik.
Abstract
Mus blåsväggen injektion är en användbar teknik för att orthotopically studera urinblåsan fenomen, inbegripet stamceller, glatt muskulatur och cancer biologi. Innan du börjar injektioner måste kirurgiska området tvättas med tvål och vatten och antiseptisk lösning. Kirurgisk utrustning måste steriliseras före användning och mellan varje djur. Varje mus placeras under inhaleras isoflurananestesi (2-5% för induktion, 1-3% för underhåll) och urinblåsan utsätts genom att göra en mittlinje buksnitt med en sax. Om blåsan är full, det är delvis expanderats genom att försiktigt pressa mellan två fingrar. Cellsuspensionen av intresse intramurally sprutas in i väggen i urinblåsan kupol med en 29 eller 30 gauge nål och 1 cc eller mindre spruta. Såret är då stängs med sår klipp och musen får återhämta sig på en uppvärmning pad. Blåsväggen injektion är en känslig mikrokirurgisk teknik som kan bemästras med praktik.
Protocol
1. Mus blåsväggen Injection
Val av musstam, ålder och kön styrs av experimentell behov. Vi använder möss mellan 8 och 12 veckors ålder, eftersom det är ett fönster av immunologiska mognad innan åldrande. Som en allmän riktlinje bör möss kommer fram minst en vecka före experimentell manipulation för att undvika stress-induced störfaktorer.
- Rengör kirurgiska tabellen ytan med tvål och vatten.
- Torka av kirurgiska tabellen ytan med Sidi swipes eller antiseptiska våtservetter.
- Autoklav rent kirurgiska instrument före användning i kirurgi.
- Dessutom sterilisera kirurgiska instrument med heta pärla autoklav omedelbart före användning, liksom mellan djur under operation.
- Rengör 100 mikroliter Hamilton sprutor och 29 eller 30 gauge (1 / 2 tum lång) nålar genom upprepade aspiration och injektion med absolut alkohol innan första användningen och i slutet av den sista kirurgiska ingrepp.
- Tvätta och skölj Hamilton sprutor med sterilt fosfatbuffrad koksaltlösning mellan varje djur.
- Bedöva möss genom att placera dem i en isofluran induktion kammare, med isofluran ligger mellan 2-5%.
- När generell anestesi uppnås, ta bort musen från kammaren och placera i ryggläge med en varm platta på undersidan för att upprätthålla normal kroppstemperatur.
- Uppnå underhållsanestesi genom att placera djurets nos i ett munstycke som innehåller förångas isofluran (titrerades från 1-3% som krävs för att upprätthålla lämpliga anestesi).
- Raka buken huden med Clippers.
- Använd en disponibel, sterila kirurgiska drapera för att täcka anus för att förhindra fekal kontaminering under operation.
- Använd en andra disponibel, sterila kirurgiska drapera för att täcka de kirurgiska området (nedre delen av magen).
- Prep buken med tre bitar av Betadine-indränkt gasbinda. Upprepa detta steg tre gånger.
- Med hjälp av en dissekera mikroskop för förstoring, gör en lägre mittlinjen buksnitt med en sax.
- Exponera urinblåsan.
- Om blåsan är full, delvis packa upp den genom att försiktigt pressa på kupolen.
- Injicera provlösningen (upp till 50 mikroliter) med en 29 eller 30 gauge nål och spruta, in i väggen i urinblåsan kupolen (intramural injektion) med fasning av nålen uppåt.
- Tryck in kolven på sprutan för att injicera provlösningen in i blåsväggen. En väl lokaliserad blåsa är en indikation på lyckad injektion av celler i blåsväggen.
- Ta bort sprutan, nära snittet med såret klipp och låt musen för att återhämta sig på en uppvärmning pad.
2. Representativa resultat:
En väl lokaliserad Bleb som inte läcker vätska och förblir stabil i storlek är ett tecken på framgångsrik injektion av celler i urinblåsan väggen (Figur 1). Histologisk analys kan göras för att bekräfta närvaron av den injicerade cellerna i blåsväggen.
Figur 1. Exempel på framgångsrika urinblåsans vägg injektion med tusch för illustration.
Figur 2. Schematisk experimentella procedurer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mus blåsväggen injektion möjliggör implantation av specifika celler i definierade områden av blåsväggen. Denna teknik har många ansökningar om musmodeller för cancer i urinblåsan, glatt muskulatur, och stamcellsbiologi. Per definition underlättar mus blåsväggen injektion införandet av blåscancer eller stamceller i en orthotopic plats så att deras tillväxt och differentiering kan studeras i ett fysiologiskt relevanta anatomiska sammanhang. I själva verket Dinney et al. först beskrev denna teknik för att studera orthotopic mänskliga implanterad cancer i urinblåsan hos nakna möss 1.
Medan blåsväggen injektionsteknik har använts i ett antal cancer i urinblåsan och stamceller studier cell 1-9, det är inte den enda metod som används. Många forskare har försökt att implantera celler blåscancer i nakna möss genom subkutan, intraperitoneal eller intravenös injektion, men dessa modeller har inte ställt ut förutsägbar tumorigenicitetsprov och metastaserande egenskaper som möjliggör val av in vivo-cellinjer 11-13. Dessutom finns ett antal modeller cancer i urinblåsan som är beroende av transuretral inympning av möss med tumörceller 14. En ledande teori om urinblåsan cancer antar att tumören spridit sker av "sådd" av normal urotel av cancerceller utsöndras i urinen strömma från andra håll i urinvägarna. Ur detta perspektiv kan transuretral inympning, vilket resulterar i exponering av urotel till cancerceller från luminala sidan av urinblåsan, bli mer fysiologiskt relevant än blåsväggen injektion. Däremot kan transuretral ympning direkt inte där celler kommer implanteras i urinblåsan.
Däremot kan orthotopic urinblåsan tumör implantation av blåsväggen injektion ger genomgående tumörer som ligger i väggen i urinblåsan. Därför kan metoden också användas till studier av glatt muskulatur och stamcellsbiologi 3, 5, 9.
Med den här tekniken nålen storlek och spruta är kritiska. Vi har funnit att ½ tum lång, 29 och 30 gauge nålar är bäst för blåsväggen injektion. Längre nålar har mer Dead Space som kan bidra till spillo inokulat och mindre exakta volymer injektion. Bredare nålar (28 gauge eller lägre) är svåra att injicera med, och leda till stora nål spår som lätt pressa injiceras material. Vi använder 100 mikroliter Hamilton sprutor eftersom de tillåter mycket exakt förvaltning av önskade volymer. Dessutom celler och skräp lätt aggregerade och hopklumpade i slutet av nålen medan injicering. Därför bör cellsuspension blandas väl innan de dras in i sprutan och sprutan och nålen ska upprepade gånger rengörs med steril koksaltlösning mellan varje injektion. Vi har funnit att det minsta, noggrann injicerbara volym är cirka 10 mikroliter. Inte mer än cirka 50 mikroliter kan injiceras i musen blåsväggen på grund av den begränsade storleken på den injicerade vävnad. Injektion med Indien bläck kan användas av nybörjare för att bekräfta att de använder rätt teknik. Inlärningskurvan för individer med erfarenhet av musen förfaranden är kort. Blåsväggen injektioner kan utföras med nästan 100 priser% framgång efter bara 5-10 möss. Vi räknar med att även arbetstagare som inte känner till musen mikrokirurgi, bör mycket höga svarsfrekvensen kan uppnås inom 10-15 möss. Injektionen misslyckas möss kan användas som negativa kontroller.
Sammanfattningsvis kan blåsväggen injektion resultera i mycket riktad leverans av celler till definierade platser i urinblåsan, vilket gör det ett mycket attraktivt alternativ för studier av urinblåsan biologi. Icke desto mindre har denna teknik en tillhörande inlärningskurva och kräver tid och metoder för att bemästra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi erkänner tacksamt stöd av en pilot bidrag från Stanford pediatrisk forskning fonden och K08DK087895-01 från NIDDK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| 29 or 30 gauge needles | Hamilton Co | 7803-06 or 7803-07 | |
| 100 microliter syringe | Hamilton Co | 7656-01 |
References
- Dinney, C. P., Fishbeck, R., Singh, R. K., Eve, B., Pathak, S., Brown, N., Xie, B., Fan, D., Bucana, C., Fidler, I. J., Killion, J. J. Isolation and Characterization of Metastatic Variants from Human Transitional Cell Carcinoma Passaged by Orthotopic Implantation in Athymic Nude Mice. The Journal of Urology. 154, 1532-1538 (1995).
- Singh, A. V., Franke, A. A., Blackburn, G. L., Zhou, J. Soy Phytochemicals Prevent Orthotopic Growth and Metastasis of Bladder Cancer in Mice by Alterations of Cancer Cell Proliferation and Apoptosis and Tumor Angiogenesis. Cancer Res. 66, 1851-1858 (2006).
- Yanagiuchi, A., Miyake, H., Nomi, M., Takenaka, A., Fujisawa, M. Modulation of the Microenvironment by Growth Factors Regulates the In Vivo Growth of Skeletal Myoblasts. BJU International. 103, 1569-1573 (2009).
- Miyake, H., Hara, I., Yamanaka, K., Gohji, K., Arakawa, S., Kamidono, S. Overexpression of Bcl-2 Enhances Metastatic Potential of Human Bladder Cancer Cells. British Journal of Cancer. 79, 1651-1656 (1999).
- Chancellor, M. B., Yokoyama, T., Tirney, S., Mattes, C. E., Ozawa, H., Yoshimura, N., Groat, W. C. de, Huard, J. Preliminary Results of Myoblast Injection into the Urethra and Bladder Wall: a Possible method for the Treatment of Stress Urinary Incontinence and Impaired Detrusor Contractility. Neurourol Urodyn. 19, 279-287 (2000).
- Dinney, C. P., Tanguay, S., Bucana, C. D., Eve, B. Y., Fidler, I. J. Intravesical Liposomal Muramyl Tripeptide Phosphatidylethanolamine Treatment of Human Bladder Carcinoma Growing in Nude Mice. J Interferon Cytokine Res. 15, 585-592 (1995).
- Mohamedali, K. A., Kedary, D., Sweeney, P., Kamaty, A., Davisy, D. W., Evey, B. Y., Huangy, S., Thorpez, P. E., Dinney, C. P., Rosenblum, M. G. The Vascular-targeting Fusion toxin VEGF121/rGel Inhibits the Growth of Orthotopic Human Bladder Carcinoma Tumors. Neoplasia. 7, 912-920 (2005).
- Slaton, J. W., Perrotte, P., Inoue, K., Dinney, C. P., Fidler, I. J. Interferon-α-mediated Down-Regulation of Angiogenesis-related Genes and Therapy of Bladder Cancer Are Dependent on Optimization of Biological Dose and Schedule. Clinical Cancer Research. 5, 2726-2734 (1999).
- Yokoyama, T., Huard, J., Pruchnic, R., Yoshimura, N., Qu, Z., Cao, B., De Groat, W. C., Kumon, H., Chancellor, M. B. Muscle-Derived Cell Transplantation and Differentiation into Lower Urinary Tract Smooth Muscle. Urology. 57, 826-831 (2001).
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse Orthotopic Models for Bladder Cancer Research. BJU International. 104, 1286-1291 (1988).
- Russell, P. J., Jelbart, M., Wills, E., Singh, S., Wass, J., Witherspoon, J., Raghavan, D. Establishment and characterization of a new human bladder cancer cell line showing features of squamous and glandular differentiation. Int. J. Cancer. 41, 74-74 (1988).
- Ahlering, T. E., Dubeau, L., Jones, P. A. A new in vivo model to study invasion and metastasis of human bladder carcinoma. Cancer Res. 41, 6660-6660 (1987).
- Heaney, J. A., Omellas, E. P., Daly, J. J., Lin, J. C., Rout, G. R. In vivo growth of human bladder cancer cell lines. Invest. Urol. 15, 380-380 (1978).
- Hadaschik, B., Black, P., Sea, J., Metwalli, A., Fazli, L., Dinney, C., Gleave, M., So, A. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumor inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
