Summary
Vejiga ratón inyección de pared es un enfoque útil para el estudio de células de vejiga ortotópicamente madre y la biología del cáncer. Este método de microcirugía delicada se puede dominar con una técnica cuidadosa y práctica.
Abstract
Vejiga ratón inyección de pared es una técnica útil para estudiar los fenómenos ortotópicamente vejiga, incluyendo células madre del músculo liso, y la biología del cáncer. Antes de comenzar las inyecciones, el área quirúrgica se debe limpiar con agua y jabón y solución antiséptica. Equipo quirúrgico debe ser esterilizado antes de su uso y entre cada animal. Cada ratón se coloca debajo de la anestesia con isoflurano inhalado (2-5% para la inducción, el 1-3% para el mantenimiento) y su vejiga expuesta al hacer una incisión abdominal con unas tijeras. Si la vejiga está llena, es parcialmente descomprimido suave apretar con dos dedos. La suspensión de células de interés es intramural se inyecta en la pared de la cúpula de la vejiga usando una aguja de calibre 29 o 30 cc y una jeringa o menor. La herida se cerró con clips de la herida y el ratón les permitió recuperarse en un cojín de calentamiento. Inyección de pared de la vejiga es una técnica de microcirugía delicada que se puede dominar con la práctica.
Protocol
1. Vejiga ratón pared de inyección
Elección de la cepa del ratón, la edad y el sexo está determinado por las necesidades experimentales. Nosotros usamos ratones de entre 8 y 12 semanas de edad, ya que esta es una ventana de madurez inmunológica antes de la senescencia. Como pauta general, los ratones deben llegar por lo menos una semana antes de la manipulación experimental con el fin de evitar la tensión inducida por factores de confusión.
- Limpie la superficie de la mesa quirúrgica con agua y jabón.
- Limpie la superficie de la mesa quirúrgica con Golpes Cide o toallitas antisépticas.
- Autoclave de limpiar el instrumental quirúrgico antes de su uso en la cirugía.
- Además, esterilizar los instrumentos quirúrgicos con esterilizador de cuentas caliente inmediatamente antes de su uso, así como entre los animales durante la cirugía.
- Limpie 100 L jeringas Hamilton y 29 o calibre 30 (1 / 2 pulgada de largo) por agujas de inyección y aspiración repetida con alcohol absoluto antes del primer uso y al final de la intervención quirúrgica definitiva.
- Lavar y enjuagar las jeringas esterilizadas Hamilton con tampón fosfato salino entre cada animal.
- Anestesiar a los ratones, colocándolos en una cámara de inducción con isoflurano, con el conjunto de isoflurano entre 2-5%.
- Una vez que la anestesia general se consigue quitar el ratón de la cámara y colocar en posición supina, con una compresa caliente debajo para ayudar a mantener la temperatura corporal normal.
- Conseguir una anestesia de mantenimiento mediante la colocación de hocico del animal en una boquilla que contiene vaporizar isoflurano (titulado de 1-3% según sea necesario para mantener la anestesia adecuada).
- Afeitarse la piel del abdomen con una maquinilla.
- Use un paño desechable quirúrgica estéril para cubrir el ano para evitar la contaminación fecal durante la cirugía.
- Use un segundo paño desechable quirúrgica estéril para cubrir el campo quirúrgico (parte inferior del abdomen).
- Preparación del abdomen con tres piezas de gasa empapada en Betadine. Repita este paso tres veces.
- Utilizando un microscopio de disección para la ampliación, hacer una incisión en línea media abdominal inferior con unas tijeras.
- Exponer la vejiga.
- Si la vejiga está llena, parcialmente descomprimirlo por una suave presión hacia abajo en la cúpula.
- Inyectar la solución de la muestra (hasta 50 l), utilizando una aguja de calibre 29 o 30 y una jeringa, en la pared de la cúpula de la vejiga (inyección intramural) con el bisel de la aguja hacia arriba.
- Empuje el émbolo de la jeringa para inyectar la solución de la muestra en la pared de la vejiga. Una ampolla bien localizada es un indicador del éxito de la inyección de las células en la pared de la vejiga.
- Retire la jeringa, cerca de la incisión con grapas de la herida y permitir que el ratón para recuperar en un cojín de calentamiento.
2. Los resultados representativos:
Una ampolla bien localizadas que no pierden líquido y se mantiene estable en el tamaño es un indicador de éxito de la inyección de las células en la pared vesical (Figura 1). El análisis histológico se puede realizar para confirmar la presencia de las células inyectadas en la pared de la vejiga.
Figura 1. Ejemplo de inyección de éxito pared de la vejiga usando tinta china para la ilustración.
Figura 2. Esquema de los procedimientos experimentales.
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Discussion
Vejiga ratón inyección de pared permite la implantación de células específicas en áreas definidas de la pared de la vejiga. Esta técnica tiene amplias aplicaciones para los modelos de ratón de cáncer de vejiga, el músculo liso, y la biología de células madre. Por definición, la vejiga ratón inyección de pared facilita la introducción de cáncer de vejiga o de células madre en un lugar ortotópico de modo que su crecimiento y la diferenciación puede ser estudiado en un contexto anatómico fisiológicamente relevantes. De hecho, Ðîññèÿ et al. describió por primera vez esta técnica para estudiar ortotópico xenoinjertos de cáncer de vejiga humano en ratones desnudos 1.
Mientras que la pared de la vejiga técnica de inyección se ha utilizado en una serie de estudios de cáncer de vejiga y de células madre 1.9, no es el único método utilizado. Muchos científicos han tratado de implantar las células de cáncer de vejiga en ratones desnudos por inyección subcutánea, intraperitoneal, o la inyección intravenosa, pero estos modelos no han mostrado tumorigenicidad predecible y propiedades metastásicas que permiten la selección de líneas celulares en vivo 11-13. Además, hay una serie de modelos de cáncer de vejiga que se basan en la inoculación transuretral de ratones con células tumorales 14. Una de las principales teorías de la vejiga carcinogénesis postula que la extensión del tumor se produce por la "siembra" de urotelio normal por las células cancerosas eliminadas en el flujo de la orina de otras partes del tracto urinario. Desde esta perspectiva, la inoculación transuretral, ya que la exposición del urotelio a las células cancerosas de la cara luminal de la vejiga, puede ser fisiológicamente más relevantes que la inyección de la pared vesical. Sin embargo, la inoculación transuretral no puede dirigir en células se implantan dentro de la vejiga.
Por el contrario, la implantación ortotópica tumor de la vejiga mediante la inyección de la pared vesical constante puede producir tumores localizados en la pared de la vejiga. Por lo tanto, este método también se puede aplicar a los estudios de la musculatura lisa y la biología de células madre de 3, 5, 9.
En esta técnica, el tamaño de la aguja y la jeringa son críticos. Hemos encontrado que ½ pulgada de largo, 29 y 30 agujas de calibre son los mejores para la inyección de la pared vesical. Agujas más largas tienen más espacio muerto lo que puede contribuir a la inoculación perdido y los volúmenes de inyección son menos precisos. Más amplia agujas (calibre 28 o menor) son difíciles de inyectar con, y conducir a pistas de agujas de gran tamaño que fácilmente extruir material inyectado. Usamos 100 microlitros jeringas Hamilton, ya que permiten la administración de alta precisión de los volúmenes deseados. Además, las células y los desechos son fácilmente agregados y agrupados en el extremo de la aguja durante la inyección. Por lo tanto, la suspensión de células se deben mezclar bien antes de ser cargada la jeringa y la jeringa y la aguja debe ser repetidamente limpiadas con solución salina normal estéril entre cada inyección. Hemos encontrado que el volumen mínimo, inyectables exacta es de aproximadamente 10 microlitros. No más de aproximadamente 50 microlitros se pueden inyectar en la pared de la vejiga ratón debido a las reducidas dimensiones del tejido inyectado. Inyección con tinta china puede ser utilizado por novatos para ayudar a confirmar que están utilizando la técnica adecuada. La curva de aprendizaje para personas con experiencia con los procedimientos del ratón es corta. Inyecciones de la pared vesical se puede realizar con casi 100% de éxito después de las tasas de los ratones sólo 5.10. Anticipamos que, incluso para los trabajadores no están familiarizados con la microcirugía del ratón, las tasas de éxito muy altas deben ser alcanzables dentro de 10-15 ratones. Ratones inyección de fallos se pueden utilizar como controles negativos.
En conclusión, la inyección de pared de la vejiga puede provocar un parto muy específica de las células a ubicaciones definidas en la vejiga, por lo que es una opción muy atractiva para los estudios de la biología de la vejiga. Sin embargo, esta técnica tiene una curva de aprendizaje asociada y requiere tiempo y práctica para dominar.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Agradecemos el apoyo de una subvención piloto del Fondo de Investigación de Stanford Pediátrica y K08DK087895 01-desde el NIDDK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| 29 or 30 gauge needles | Hamilton Co | 7803-06 or 7803-07 | |
| 100 microliter syringe | Hamilton Co | 7656-01 |
References
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