Summary
Murine Haut-und Weichteilinfektionen Infektionen Modell ist für die Beurteilung der Virulenz Funktion von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) und dem Host-Immunreaktionen eingesetzt. Hier präsentierten wir eine subkutane Infektion Modell für Haut-und Weichteilinfektionen.
Abstract
MRSA ist eine weltweite Bedrohung für die öffentliche Gesundheit und MRSA Haut-und Weichteil-Infektionen mittlerweile mehr als die Hälfte aller Weichteil-Infektionen in den Vereinigten Staaten. Unter Weichteilinfektionen, haben Myositis, pyomyositis und nekrotisierende Fasziitis zunehmend in Verbindung mit MRSA aus der Gemeinde berichtet. Um zu verstehen, das Wechselspiel zwischen MRSA-und Host-Immunität führt zu schweren Infektion ist die Verfügbarkeit von Tiermodellen kritisch, erlaubt die Untersuchung von Host-und bakterielle Faktoren. Mehrere Infektion Modelle wurden eingeführt, um die Pathogenese von S. bewerten aureus während oberflächliche Infektion der Haut. Hier beschreiben wir eine subkutane Infektion Modell, das die Haut, Unterhaut und Muskulatur Pathologien untersucht.
Protocol
1. Vorbereiten des MRSA für Infektionsforschung (zwei Tage vor der Infektion)
- Impfen einer Öse MRSA aus einer Stammkultur eine Blut-Agar (Trypticase Soy Agar (TSA)) Platte.
- Überprüfen Sie die Hämolyse Phänotyp (eine klare Zone um jede Kolonie) auf das Blut-Agar-Platte.
- Wählen Sie eine Kolonie, die eine hämolytische Phänotyp, die im Einklang mit anderen Experimenten wurde.
- Impfen der Kolonie in 3 ml Todd Hewitt Broth (THB), mit dem angeeigneten Antibiotikum, wenn nötig, in einer 15 ml-Snap-Röhrchen.
- Bei 37 ° C über Nacht unter Schütteln bei 220 Umdrehungen pro Minute.
2. Vorbereitung der Mäuse für Infektionsforschung (einen Tag vor der Infektion)
- Je nach Größe der Mäuse, rasieren das Fell ab einer 3 x 4 cm-Bereich auf der Rückseite von Mäusen.
- Bewerben ~ 5 mm 3 Haarentferner Creme (gekauft von einer örtlichen Drogerie) auf die rasierte Fläche.
- Lassen Sie die Haarentfernung Creme auf der Haut für ca. 1 min inkubieren.
- Wet Papierhandtücher mit ddH 2 O.
- Wischen Sie die Haarentfernung Creme mit dem nassen Papiertuch.
3. Vorbereiten des MRSA für Infektionsforschung (am Tag der Infektion)
- Verdünnen Sie die Nacht Bakterienkultur bei 1:500 bis 1:1000 mit 10 ml vorgewärmten THB, in einem 50 mL Röhrchen mit Schraubverschluss.
- Bei 37 ° C für ca. 2,5 Stunden unter Schütteln bei 220 rpm, bis A 540 erreicht 2,5.
- Sammeln MRSA durch Zentrifugation bei 3.225 xg für 10 min bei 4 ° C.
- Überstand verwerfen.
- Resuspendieren Sie das Bakterienpellet in 10 ml Dulbecco phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS).
- Wiederholen Sie die Schritte 3 und 4.
- Resuspendieren Sie das Bakterienpellet in DPBS auf eine gewünschte Konzentration.
- Serienmäßig verdünnen Bakteriensuspension von Januar 10 - August 10.
- Platte der verdünnten Bakteriensuspension auf Blut-Agar-Platten.
- Die Inkubation bei 37 ° C über Nacht.
- Beobachtung und Aufzeichnung der hämolytischen Phänotyp der Inokula.
- Zählen Sie die Kolonie bildenden Einheiten (KBE) Nummer auf der Platte.
- Berechnen Sie die Inokula auf die CFU-Nummer auf der Platte basiert.
4. Subkutane Infektion von MRSA (am Tag der Infektion und 3 Tage nach der Infektion)
- Inject subkutan 100 ul Bakteriensuspension in die rasierte Fläche.
- Beobachten Sie die Tiere für 3 bis 5 Stunden nach der Injektion sicherstellen, dass die Mäuse am Leben sind.
- Beachten Sie die Läsion auf dem Rücken der Tiere täglich und notieren Sie die Läsion Bereich täglich, wenn es gebraucht wird. Läsion Beobachtung sollte die Aufnahme der Läsion Größe und Morphologie. Beide Haut und Muskel Läsionen sind durch Multiplikation der Länge und Breite der Läsion quantifiziert. Unregelmäßig geformte Läsionen müssen in kleinere symmetrische Stücke zerbrochen werden, und jedes Stück mit dem gleichen Verfahren gemessen. Läsion Messungen können auch eine EDV-gestützte histomorphometrische Assessment Program (ImageJ, Open-Source zur Verfügung von der NIH in http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) 2.
- Sacrifice die Tiere am Tag 3 nach der Infektion durch Inhalation von Isofluran durch Genickbruch folgte.
- Beobachtung und Aufzeichnung der Läsion auf der Haut.
- Nick die Haut mit einem Paar sterile Schere.
- Ziehen Sie die Haut vorsichtig ab und beobachten und aufzeichnen der Läsion auf den Muskel.
- Excise der Läsion und ca. 2 bis 5 mm von der Umgebung.
- Sammeln Milz und Nieren.
- Homogenisieren des Gewebes mit einem Gewebe-Homogenisator oder durch wiederholte Anwendung eines Kolbens aus einer 1 ml-Spritze ein Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Gewebe und 100 ul DPBS.
- Add 900 ul DPBS in jedes Röhrchen.
- Vortex die Proben für 5 min.
- Serienmäßig verdünnt die Suspension mit DPBS 1 Oktober - 6. Oktober.
- Platte der verdünnten Suspensionen auf THA-Platten.
5. Repräsentative Ergebnisse:
- Unmittelbar nach jeder subkutane Injektion wird eine Blase an der Hautoberfläche beobachtet werden, wenn die Infektion richtig eingestellt ist (Abbildung 1A) durchgeführt. Wenn keine Bläschen auf der Haut beobachtet wird, kann die Injektion zu tief sein, und dies kann das Ergebnis der Infektion (Größe der Läsion, CFU) zu beeinflussen.
- Die Bakteriensuspension muss seriell verdünnt und die CFU müssen auf Blutagarplatten für jedes Experiment untersucht werden. Dieser Schritt wird liefern wichtige Informationen: 1) ob die Inokula homogenen Phänotyp haben, 2) die exakte praktikable Keimzahl für die Infektion.
- Die Läsionen und bakteriellen Überleben kann zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion beurteilt werden. Hier haben wir die Infektion an Tag 3 nach der Infektion. Die Läsion Größen sind auf der Hautoberfläche (: 1x 10 9; Abbildung 1D: 1B 1 x 10 7 CFU) analysiert und auf den Muskel (Abbildung 1C: 1x 10 9 7 CFU). Die Läsion Bereich gleicher Länge (mm) x Breite (mm) kann für die Beurteilung der Gewebeschädigung (Abb. 2 A und B) gemessen werden. Dieses Ergebnis könnte helfen, bestimmen das Ausmaß der Gewebeschädigung durch einen bestimmten Virulenzfaktor verursacht. Darüber hinaus sind die Läsionen exzidiert und homogenisiert in DPBS und beschichtet, um die CFU-Nummer (Abbildung 2C), welche die Lebensfähigkeit der Bakterien am Ort der Infektion zeigt quantifizieren.
Abbildung 1. Die Haut und Muskel Läsionen. CD1 Mäusen wurden subkutan an einer Flanke mit MRSA (LAC) geimpft. Die Bilder wurden zum Zeitpunkt 0 und Tag 3 nach der Infektion aufgenommen. (A) Zeit 0 nach der Infektion (pi), (B) - (G) Tag 3 pi; B, D. und F: Hautläsionen; C, E und G: Muskel-Läsionen; B und C: 1x 10 9 CFU infiziert, D und E: 1x 10 7 CFU infiziert, F und G: Mock.
Abbildung 2. Hautläsion Größe und lebensfähigen Bakterien am Ort der Infektion zählen am Tag 3 nach der Infektion. Haut-und Muskel-Verletzungen auf MRSA (LAC) infiziert CD1-Mäusen. (A) Hautläsion Größe. (B) Muscle Läsionsgröße. (C) Total Gewebe CFU. H: 1 x 10 9 KBE Inokula; L: 1 x 10 7 CFU Inokula. *: P <0,05, Mann-Whitney-Test.
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Discussion
- Die murine Haut-und Weichteilinfektionen Infektionen Modell ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die in vivo Virulenz Beurteilung eines Erregers. Die Pathogenität von S. aureus in Haut-und Weichteilinfektionen kann je nach einer Reihe von Parametern. Dazu gehören Inokulum Größe, das Wachstum von Bakterien Phase, Tiefe der Impfung, Alter der Mäuse, und die Maus genetischen Hintergrund 7, 8. Bei der Prüfung der Virulenz-Funktion mit diesem Modell ist es wichtig, für diese Parameter werden, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse konsistent sein werden. Wir haben MRSA Infektion der Haut in mehrere Stämme von Mäusen, einschließlich SKH1 (haarlose Mäuse), C57Bl / 6, BALB / c und CD1 untersucht. Infection Ergebnisse variieren in den verschiedenen Stämmen 7, im Einklang mit anderen Berichten, die das Erbgut der Maus eine wichtige Determinante für die Schwere der MRSA-Infektion 1 ist. In diesem Experiment nutzen wir CD1-Mäusen, weil diese Mausstamm erwiesen hat, werden für Untersuchungen von S. gut geeignet aureus Virulenzfaktoren 5 und ist weniger teuer als andere Stämme.
- Um sicherzustellen, dass die Ergebnisse von Experimenten konsistent sind, die Kolonie für die Infektion griff muss für seine Hämolyse Phänotyp überprüft vor jedem Experiment werden. Β-hämolytischen Phänotyp auf Schafsblutagarplatte (eine klare Zone um die Kolonie) spiegelt Ausdruck α-Toxin durch die S. aureus zu isolieren. Dieser Schritt ist notwendig, weil spontane Mutation eines S. aureus globalen Regulator ist berichtet worden, auftreten, die bei depressiven α-Toxin Ausdruck 6. S. aureus fehlt α-Toxin Ausdruck weist eine weniger virulent Phänotyp im Vergleich zu isogenen Stämme, zum Ausdruck α-Toxin 4.
- Nach der Rasur das Fell vom Rücken von Mäusen, gelten ca. 5 mm 3 große Haarentferner Creme (Kauf von lokalen Apotheke) auf die rasierte Fläche. Dieser Schritt wird die Rückseite von Mäusen frei von Haaren zu halten für 5 bis 7 Tage. Mehrere Arten von Haarentferner Creme funktioniert, jedoch ist es wichtig, eine, die den geringsten Hautirritationen hervorruft wählen. Wir empfehlen Haarentferner Cremes mit Babyöl.
- Bei der Injektion der Bakteriensuspension wird eine Blase an der Hautoberfläche (Abbildung 2A) beobachtet werden. Wenn eine Injektion zu tief (keine Blase beobachtet) ist, kann die Suspension in den Muskel geimpft werden, was die Infektion Ergebnis wegen der falschen Infektionsstelle beeinflussen, und Läsion und CFU Erholung aus dem subkutanen Gewebe für die Maus wird anders sein.
- Neben Größe der Läsion und CFU zählen, können abhängige Variablen ebenfalls geprüft, um Virulenz zu beurteilen. Dazu gehören Bakterien Verbreitung, Serum-Zytokin-Ebenen, Infektionsstelle Zytokin-und Chemokin-Ebenen, PMN Rekrutierung und Histologie 3, 6.
- Für die Histologie und Immunchemie Analyse können infizierte Gewebe herausgeschnitten und in 10% Formalin fixiert Nacht werden. Wenn Exzision der infizierten Geweben, 2 bis 5 mm gesundes Gewebe klingende die Läsion muss mit der Läsion geschnitten werden. Dies wird sicherstellen, dass keine tiefen pathologischen Gewebe verzichtet werden.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Burroughs-Wellcome Career Award und von den National Institutes of Health gewähren AI074832 zu GY Liu unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| THB | VWR international | 95025-314 | |
| DPBS | Invitrogen | 21-031-CV | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 27G1/2 needle | BD Biosciences | 305109 | |
| Sheep Blood Agar (TSA) | VWR international | 90004-328 |
References
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