Summary
Murine 피부와 부드러운 조직 감염 모델은 methicillin 내성 포도상 구균 (MRSA) 및 호스트 면역 응답의 독성 기능을 평가하기위한 활용합니다. 여기, 우리는 피부와 부드러운 조직 감염 피하 감염 모델을 소개하고 있습니다.
Abstract
MRSA는 공중 보건에 대한 세계적인 위협이며, MRSA 피부와 부드러운 조직 감염은 이제 더 미국에있는 모든 소프트 조직 감염의 절반 이상을 차지하고있다. 소프트 조직 감염 가운데, myositis, pyomyositis 및 염 괴사는 점차 MRSA가 지역 사회에서 발생하는과 공동으로보고되었습니다. MRSA 더 심각한 감염으로 이어지는 호스트 면역 간의 상호 작용을 이해하기 위해서는, 동물 모델의 가용성은 호스트 및 세균성 요인의 연구를 허용, 중요합니다. 여러 감염 모델은 S.의 pathogenesis을 평가하기 위해 도입되었습니다 표면 피부 감염 동안 구균. 여기, 우리는 피부, 피하 및 근육 pathologies을 검사 피하 감염 모델을 설명합니다.
Protocol
1. 감염 MRSA를 (감염하기 전에 이틀) 준비
- 주식 문화의 혈액 한천 (Trypticase의 소이 아가르 (TSA)) 접시에 MRSA의 loopful의 예방.
- 혈액 한천 플레이트에 용혈의 표현형 (각 콜로니 주위에 맑은 구역)을 확인하시기 바랍니다.
- 다른 실험과 일치하는 용혈성 표현형을 가진 식민지를 선택하십시오.
- 15 ML 스냅 덮인 관에서, appropriated 항생제 필요한 경우와 3 ML 토드 휴이트 맛을 (THB)에 식민지의 예방.
- 37 품어 ° C 220 rpm으로 잡고 하룻밤.
2. 감염에 대한 마우스를 준비하는 것은 (이전 감염 하루)
- 생쥐의 크기에 따라 생쥐의 뒷면에 3 X 4cm 지역에서 모피를 면도.
- 면도 영역에 ~ 5mm 3 머리 제거 크림 (현지 약국에서 구입한)이 적용됩니다.
- 머리 제거 크림은 약 1 분 피부 표면에 품어 수 있습니다.
- ddH 2 O.와 젖은 종이 타올
- 젖은 종이 타월로 머리 제거 크림을 닦아주십시오.
3. (감염의 날)에 감염 MRSA 준비
- 50 ML 나사 덮인 관에서, 사전 예열 THB 10 ML과 1:500에서 1:1000으로 밤새 박테리아 문화를 희석.
- ° C 약 2.5 시간 동안 540 2.5에 도달할 때까지, 220 rpm으로 잡고 37 알을 품다.
- 4 10 분 3,225 XG에서 원심 분리하여 MRSA를 수집 ° C.
- 뜨는 폐기하십시오.
- 10 ML Dulbecco의 인산에있는 박테리아 펠렛을 Resuspend 호수 (DPBS)가 버퍼.
- 3 단계와 4 단계를 반복합니다.
- 원하는 농도에 DPBS에있는 박테리아 펠렛을 Resuspend.
- 순차적으로 10월 8일부터 10월 1일까지에서 세균 현탁액을 희석.
- 혈액 한천 플레이트 플레이트에 희석 박테리아 현탁액합니다.
- ° C 야간 37 번호판을 품어.
- 관찰과 inocula의 용혈성 표현형를 기록합니다.
- 접시 단위를 형성하는 콜로니 (CFU)이 번호를 세어보세요.
- 접시에 CFU 번호를 기반으로 inocula을 계산합니다.
4. MRSA의 피하 감염 (감염의 일 및 3 일 후 감염에 대한)
- 면도 지역의 subcutaneously 100 μL 세균 현탁액을 주사.
- 생쥐가 살아 있는지 확인하기 위해 주사 후 3~5시간 위해 동물을 관찰.
- 매일 동물의 뒷면에있는 병변을 관찰하고 필요하면 매일 장애 영역을 기록합니다. 병변 관찰 병변의 크기와 형태의 기록을 포함해야합니다. 피부와 근육 병변 모두 병변의 길이와 넓이를 곱하여 quantitated 있습니다. 불규칙 모양의 병변은 작은 대칭 조각으로 분류하고, 각 조각은 같은 방법으로 측정해야합니다. ; 병변 측정은 또한 컴퓨터를 이용한 histomorphometric 평가 프로그램 (에서 NIH에서 제공 오픈 소스 ImageJ 사용할 수 있습니다 http://rsb.info.nih.gov/ij/ 2).
- 자궁 경부 전위 다음 isoflurane의 흡입하여 3 일 후 감염에 동물을 희생.
- 관찰 및 피부에 병변을 기록합니다.
- 멸균 가위로 닉은 피부.
- 피부 껍질에서 신중하고 관찰하고 근육의 병변을 기록합니다.
- 엑사이스 병변과 약 2 - 주변 지역의 5mm.
- 비장과 신장을 수집합니다.
- 조직 균 질기를 사용하여 조직을 균질하거나 조직 및 DPBS 100 μL를 포함하는 microfuge 튜브에 1 ML의 주사기에서 플런저의 반복 응용 프로그램에 의해.
- 각각의 튜브에 DPBS 900 μL를 추가합니다.
- 5 분 소용돌이 샘플을.
- 순차적으로 10 6 DPBS 10 1과 현탁액을 희석.
- 플레이트 THA 접시에 희석 suspensions합니다.
5. 대표 결과 :
- 즉시 각 피하 주입 후 물집은 감염 (그림 1A) 제대로 때 피부 표면에 관찰됩니다. 아무 물집이 피부 표면에 관찰되지 않은 경우, 사출이 너무 깊이 될 수 있으며, 이것은 감염의 결과 (병변의 크기, CFU)를 영향을 미칠 수 있습니다.
- 세균 현탁액은 순차적으로 희석해야하며 CFU 각 실험에 대한 혈액 한천 플레이트에 검사해야합니다. inocula가 균질 표현형을 가지고 있는지 여부 1), 감염 2) 정확한 가능한 세균성 카운트 :이 단계는 중요한 정보를 얻을 수 있습니다.
- 병변과 박테리아 생존는 다양한 시간 지점 후 감염에서 평가 수 있습니다. 여기서 우리는 3 일 후 감염에 대한 감염을 조사. 병변 크기가 피부 표면 (1X 10 9, 그림 1D : 그림 1B 1 X 10 7 CFU)를 분석하고 근육의 표면 (그림 1C에서 : 1X 10 9 7 CFU). 병변 면적 (mm) × 폭 (mm)가 조직 손상 (Figs. 2 A와 B)을 평가하기위한 측정 수 길이를 같습니다. 이 결과는 주어진 독성 인자에 의한 조직 손상의 정도를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 병변이 excised과 DPBS에 균질하고, 감염 사이트에있는 박테리아의 생존을 나타내는 CFU 번호를 (그림 2C), quantitate로 비쳐지게 만들려합니다.
그림 1. 피부와 근육 병변. CD1 생쥐는 MRSA (LAC) 하나의 측면에 피하 주사를했다. 사진은 시간 0에서 3 일 이후의 감염에 찍은. (A) 시간 0 이후의 감염 (PI), (B) - (G) 3 일 PI, B, D 및 F : 피부 병변, C, E 및 G : 근육 병변, B 및 C : 1X 10 9 CFU 감염, D와 E : 1X 10 7 CFU 감염, F 및 G : 모의.
그림 2. 피부 병변의 크기와 가능한 박테리아 CD1 쥐를 감염 MRSA (LAC)에서 3 일 후 감염. 피부와 근육의 병변에 감염 사이트에 포함됩니다. (A) 피부 병변의 크기. (B) 근육 병변의 크기. (C) 총 조직 CFU. H : 1 X 10 9 CFU의 inocula, L : 1 X 10 7 CFU의 inocula. * : P <0.05, 만 - 휘트니 테스트.
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Discussion
- murine 피부와 부드러운 조직 감염 모델은 병원체의 생체내 독성 평가에 대한 강력한 도구입니다. S.의 pathogenicity 피부와 부드러운 조직 감염의 구균이 매개 변수의 수에 따라 달라질 수 있습니다. 이들은 inoculum 크기, 세균성 성장 단계 접종의 깊이, 마우스의 연령, 및 마우스 유전 배경에 7, 8을 포함합니다. 이 모델을 사용하여 독성 기능을 검사하면 결과가 일치하는지 확인하려면이 매개 변수에 대한 통제 중요합니다. 우리는 SKH1 (사나이 답게 마우스), C57Bl / 6, BALB / C 및 CD1 포함하여 생쥐의 몇 가지 계통에 피부의 MRSA 감염을 공부했습니다. 감염의 결과는 마우스의 유전자 구조는 MRSA 감염 1의 심각의 중요한 결정자임을 다른보고와 일치하는 다른 변종 7에 차이가 있습니다. 이 마우스 변형은 S. 연구에 적합해야 표시 되었기 때문에 본 실험에서 우리는 CD1 쥐를 활용 구균의 독성 요인 5 다른 종자보다 저렴합니다.
- 실험의 결과가 일관성이 있는지 확인하려면 감염 선택한 식민지하기 전에 각각의 실험은 용혈의 표현형 검사해야합니다. 쉽 혈액 한천 배지에서 β - 용혈성 표현형은 (식민지 주변 맑은 영역) α - 독소의 표현을 반영 S.에 의해 구균이 분리. 이 단계는 필수이기 때문에 S.의 자연 돌연변이 구균 글로벌 레귤레이터는 우울 α - 독소 표현 6 결과, 발생하는 것으로보고되었습니다. S.은 α - 독소의 표현 부족 구균은 isogenic 종자 그 표현 α - 독소 4에 비해 적은 악성 표현형을 전시하고 있습니다.
- 마우스의 뒷면에서 모피를 면도 후 면도 지역에 약 5mm 크기의 세 머리 제거 크림 (로컬 약국에서 구입)를 적용할 수 있습니다. 이 단계는 5 7 일 동안 머리에서 무료로 생쥐의 뒷면을 유지합니다. 헤어 리무버 크림 여러 종류의 효과가있을 수 있지만, 그것은 피부 자극의 최소 금액을 유도 하나를 선택하는 것이 중요합니다. 우리 아기 기름으로 머리 제거 크림을 추천합니다.
- 박테리아 현탁액을 주입하면 물집이 피부 표면 (그림 2A)에서 관찰됩니다. 주사는 (아무 물집은 관찰되지 않음) 너무 깊이하면 정지 때문에 잘못된 감염 사이트의 감염 결과에 영향을 미칠 수있는, 근육에 주사 수 있으며, 병변 그리고 마우스 피하 조직에서 CFU 복구 다를 수 있습니다.
- 병변의 크기와 CFU 카운트뿐만 아니라, 종속 변수는 독성을 평가하기 위해 검사 수 있습니다. 이들은 박테리아의 보급, 혈청 시토킨 수준, 감염 사이트 시토킨 및 케모카인 레벨, PMN 모집 및 조직학 3, 6을 포함합니다.
- 조직학 및 immunochemistry의 분석을 위해, 감염된 조직은 하룻밤 사이에 포르말린 10 % excised 및 고정 수 있습니다. 감염된 조직, 2을 절개하는 경우 - 병변을 들리는 5mm 건강한 조직의 병변과 함께 절단해야합니다. 이것은 깊은 pathologic 조직이 생략되지 않는 것이 보장됩니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 버로스 - 웰컴 경력 수상 및 GY 리우에 보건 부여 AI074832 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| THB | VWR international | 95025-314 | |
| DPBS | Invitrogen | 21-031-CV | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 27G1/2 needle | BD Biosciences | 305109 | |
| Sheep Blood Agar (TSA) | VWR international | 90004-328 |
References
- Ahn, J. Y., Song, J. Y., Yun, Y. S., Jeong, G., Choi, I. S. Protection of Staphylococcus aureus-infected septic mice by suppression of early acute inflammation and enhanced antimicrobial activity by ginsan. FEMS Immunol Med Microbiol. 46, 187-197 (2006).
- Girish, V., Vijayalakshmi, A. Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ. Indian J Cancer. 41, 47-47 (2004).
- Hahn, B. L., Onunkwo, C. C., Watts, C. J., Sohnle, P. G. Systemic dissemination and cutaneous damage in a mouse model of staphylococcal skin infections. Microb Pathog. 47, 16-23 (2009).
- Hruz, P., Zinkernagel, A. S., Jenikova, G., Botwin, G. J., Hugot, J. P., Karin, M., Nizet, V., Eckmann, L. NOD2 contributes to cutaneous defense against Staphylococcus aureus through alpha-toxin-dependent innate immune activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12873-12878 (2009).
- Ji, Y., Zhang, B., Van, S. F., Horn, P. W. arren, Woodnutt, G., Burnham, M. K., Rosenberg, M. Identification of critical staphylococcal genes using conditional phenotypes generated by antisense RNA. Science. 293, 2266-2269 (2001).
- Somerville, G. A., Beres, S. B., Fitzgerald, J. R., DeLeo, F. R., Cole, R. L., Hoff, J. S., Musser, J. M. In vitro serial passage of Staphylococcus aureus: changes in physiology, virulence factor production, and agr nucleotide sequence. J Bacteriol. 184, 1430-1437 (2002).
- Tseng, C. W., Kyme, P., Low, J., Rocha, M. A., Alsabeh, R., Miller, L. G., Otto, M., Arditi, M., Diep, B. A., Nizet, V., Doherty, T. M., Beenhouwer, D. O., Liu, G. Y. Staphylococcus aureus Panton-Valentine leukocidin contributes to inflammation and muscle tissue injury. PLoS One. 4, e6387-e6387 (2009).
- von Kockritz-Blickwede, M., Rohde, M., Oehmcke, S., Miller, L. S., Cheung, A. L., Herwald, H., Foster, S., Medina, E. Immunological mechanisms underlying the genetic predisposition to severe Staphylococcus aureus infection in the mouse model. Am J Pathol. 173, 1657-1668 (2008).
