Summary
Murina hud-och mjukdelsinfektioner Modellen används för bedömning av virulens funktion av meticillinresistent Staphylococcus aureus (MRSA) och den mottagande svar immunologiska. Här presenterade vi en subkutan infektion modell för hud-och mjukdelsinfektioner.
Abstract
MRSA är ett globalt hot mot folkhälsan, och MRSA hud-och mjukdelsinfektioner står nu för mer än hälften av alla mjukdelsinfektioner i USA. Bland mjukdelsinfektioner, har myosit, pyomyositis och nekrotiserande fasciit varit allt rapporterats i samband med MRSA som härrör från gemenskapen. För att förstå samspelet mellan MRSA och värd immunitet som leder till mer allvarlig infektion, är tillgången på djurmodeller kritiska, vilket möjliggör studier av värd och bakteriella faktorer. Flera infektion modeller har införts för att bedöma patogenes av S. aureus under ytlig hudinfektion. Här beskriver vi en subkutan infektion modell som undersöker huden, subkutan och sjukdomar muskler.
Protocol
1. Förbereda MRSA för Infection (två dagar före infektion)
- Inokulera en ögla med MRSA från ett bestånd kultur till en blodagar (trypticase soja-agar (TSA)) plattan.
- Kontrollera hemolys fenotyp (en klar zon runt varje koloni) på blodagar plattan.
- Välj en koloni som har en hemolytisk fenotyp som är förenlig med andra experiment.
- Inokulera kolonin i 3 ml Todd Hewitt buljong (THB), med beslag antibiotika vid behov, i ett 15 ml snap-begränsade rör.
- Inkubera vid 37 ° C över natten med skakning vid 220 rpm.
2. Förbereda Möss för Infection (en dag före infektion)
- Beroende på storleken på möss, raka pälsen av en 3 x 4 cm stort område på baksidan av möss.
- Applicera ~ 5 mm 3 grädde hårborttagare (köpt från en lokal apotek) för att det rakade området.
- Låt hårborttagare krämen att ruva på hudytan i ca 1 min.
- Blöt hushållspapper med DDH 2 O.
- Torka av krämen hårborttagare med blöt pappershandduk.
3. Förbereda MRSA för Infection (på dagen av infektion)
- Späd natten bakterieodling på 1:500 till 1:1000 med 10 ml förvärms THB, i en 50 ml rör med skruvkork.
- Inkubera vid 37 ° C i ca 2,5 timmar med skakningar vid 220 rpm, tills en 540 når 2,5.
- Samla MRSA genom centrifugering vid 3225 xgi 10 minuter vid 4 ° C.
- Kassera supernatanten.
- Resuspendera bakteriell pelleten i 10 ml Dulbecco är fosfatbuffrad saltlösning (DPBS).
- Upprepa steg 3 och 4.
- Resuspendera bakteriell pelleten i DPBS vid önskad koncentration.
- Seriellt späda bakteriesuspensionen från 10 januari - 10 AUGUSTI.
- Tavla den utspädda bakteriesuspension på tallrikar blodagar.
- Inkubera plattorna vid 37 ° C över natten.
- Observera och registrera hemolytisk fenotyp av inokulat.
- Räkna kolonibildande enheter (CFU) numret på plattan.
- Beräkna inokulat baserat på CFU numret på tallriken.
4. Subkutan infektion av MRSA (på dagen för infektion och 3 dagar efter infektion)
- Injicera subkutant 100 mikroliter bakteriesuspension i det rakade området.
- Observera djuren under 3 till 5 timmar efter injektion för att se till att mössen lever.
- Observera lesionen på baksidan av djurens dagliga och registrera lesionen området dagligen när det behövs. Lesionen observation bör omfatta registrering av lesion storlek och morfologi. Både hud och sår muskler är kvantifieras genom att multiplicera längd och bredd av lesionen. Oregelbundet formade lesioner måste delas upp i mindre symmetriska bitar och varje bit mätas med samma metod. Lesion mätningar kan också använda en datorstödd Histomorfometriska Assessment Program (ImageJ, öppen källkod tillgänglig från NIH på http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) 2.
- Offra djur på dag 3 efter infektion vid inandning av isofluran följt av halsdislokation.
- Observera och notera lesionen på huden.
- Nick huden med ett par steril sax.
- Dra skinnet av noggrant och observera och notera lesionen på muskeln.
- Excise lesionen och cirka 2 - 5 mm i det omgivande området.
- Samla mjälte och njurar.
- Homogenisera vävnaderna med hjälp av en vävnad homogeniseringsapparat eller av upprepade en kolv från en 1 ml spruta med en mikrofugrör innehåller vävnad och 100 mikroliter av DPBS.
- Tillsätt 900 mikroliter av DPBS till varje rör.
- Vortexa prover för 5 min.
- Seriellt Späd suspensionen med DPBS 1 oktober - 6 Oktober.
- Tavla den utspädda suspensioner på THA tallrikar.
5. Representativa resultat:
- Omedelbart efter varje subkutan injektion en Bleb observeras på ytan av huden när infektion görs korrekt (Figur 1A). Om ingen Bleb observeras på hudytan, kan injektionen för djupt, och detta kan påverka resultatet av infektion (lesion storlek, CFU).
- Bakteriesuspensionen måste serie spädas och CFU måste undersökas på blodagarplattorna för varje experiment. Detta steg kommer att ge viktig information: 1) om ympning har homogena fenotyp, 2) den exakta livskraftiga bakterier för infektionen.
- De skador och bakteriell överlevnad får bedömas vid olika tidpunkter efter infektion. Här har vi granskat infektionen på dag 3 efter infektion. Lesionen storlekar analyseras på hudytan (Figur 1B: 1x 10 9, Figur 1D: 1 x 10 7 CFU) och på muskeln ytan (Figur 1C: 1x 10 9 7 CFU). Det lesionsområdet lika längd (mm) x bredd (mm) kan mätas för att bedöma vävnadsskador (se diagram 2 A och B). Detta resultat kan bidra till att avgöra omfattningen av vävnadsskada orsakad av en viss virulensfaktorn. Dessutom är de lesioner censurerade och homogeniserade i DPBS, och klädd för att kvantifiera de CFU antalet (figur 2C), som anger lönsamheten av bakterier vid infektion platsen.
Figur 1. Huden och lesioner muskler. CD1 möss inokuleras subkutant på en flank med MRSA (LAC). Bilder togs vid tiden 0 och dag 3 efter infektion. (A) Tid 0 efter infektion (PI), (B) - (G) Dag 3 pi, B, D och F: hudskador, C, E och G: muskel organskador, B och C: 1x 10 9 CFU smittade, D och E: 1x 10 7 CFU smittade, F och G: håna.
Figur 2. Hudförändringar storleken och livskraftiga bakterier på infektionsplatsen på dag 3 efter infektion. Hud och skador muskel om MRSA (LAC) infekterade CD1 möss. (A) hudförändring storlek. (B) Muscle lesion storlek. (C) Totalt vävnad CFU. H: 1 x 10 9 CFU inokulat, L: 1 x 10 7 CFU inokulat. *: P <0,05, Mann-Whitney test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
- Den murina hud-och mjukdelsinfektioner modell är ett kraftfullt verktyg för in vivo virulens bedömning av en patogen. Den patogenicitet av S. aureus i hud och mjukdelar infektion kan variera beroende på ett antal parametrar. Dessa inkluderar inokulatets storlek, bakterietillväxt fas, djup inympning, ålder på möss, och musen genetisk bakgrund 7, 8. Vid undersökningen av virulens funktion med hjälp av denna modell är det viktigt att kontrollera för dessa parametrar för att säkerställa att resultaten kommer att vara konsekvent. Vi har studerat MRSA-infektion i huden i flera stammar av möss, inklusive SKH1 (hårlösa möss), C57BL / 6, BALB / c, och CD1. Infektion utfall varierar i de olika stammarna 7, i enlighet med andra rapporter att den genetiska makeup av musen är en viktig faktor för hur allvarlig MRSA-infektion 1. I detta experiment använder vi CD1 möss eftersom denna musstam har visat sig vara väl lämpad för studier av S. aureus virulensfaktorer 5 och är billigare än andra stammar.
- För att säkerställa att resultaten av experimenten är samstämmiga, måste koloni plockas för infektion kontrolleras för hemolys fenotyp före varje experiment. Β-hemolytiska fenotyp på fårblodagar (en klar zon runt kolonin) återspeglar uttrycket av α-toxin av S. aureus isolat. Detta steg är viktigt eftersom spontan mutation av ett S. aureus globala regulatorn har rapporterats förekomma, vilket resulterar i krisdrabbade α-toxin uttryck 6. S. aureus saknar α-toxin uttryck uppvisar ett mindre virulent fenotyp jämfört isogena stammar som uttrycker α-toxin 4.
- Efter rakning pälsen på baksidan av möss, gälla ca 5 mm 3 medelstora grädde hårborttagare (inköp från lokala apotek) för att det rakade området. Detta steg kommer att hålla baksidan av möss fri från hår i 5 till 7 dagar. Flera typer av hår Remover grädde fungerar, men det är det viktigt att välja ett som framkallar minsta hudirritation. Vi rekommenderar krämer hårborttagare med babyolja.
- Vid injektion av bakteriesuspensionen kommer en Bleb observeras på ytan av huden (Figur 2A). När en injektion är för djupt (ingen Bleb observerade), kan suspensionen inokuleras i muskeln, vilket kommer att påverka infektionen resultatet på grund av fel infektionen platsen och lesion och CFU återhämtning från den subkutana vävnaden för att musen kommer att vara annorlunda.
- Förutom att lesionen storlek och CFU räkna, kan beroende variabler också granskas för att bedöma virulens. Dessa inkluderar bakterier sprids, serumnivåer cytokin, infektion webbplats cytokin och nivåer kemokinreceptorantagonist, PMN rekrytering, och histologi 3, 6.
- För histologi och immunkemi analys kan infekterad vävnad vara utskurna och fixeras i 10% formalin natten. När excising den infekterade vävnader, 2 - 5 mm frisk vävnad klingande lesionen behöver sänkas med lesionen. Detta kommer att försäkra att inga djupa patologisk vävnad utelämnas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en Burroughs-Wellcome Karriär Award och av National Institutes of Health bidrag AI074832 till GY Liu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| THB | VWR international | 95025-314 | |
| DPBS | Invitrogen | 21-031-CV | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 27G1/2 needle | BD Biosciences | 305109 | |
| Sheep Blood Agar (TSA) | VWR international | 90004-328 |
References
- Ahn, J. Y., Song, J. Y., Yun, Y. S., Jeong, G., Choi, I. S. Protection of Staphylococcus aureus-infected septic mice by suppression of early acute inflammation and enhanced antimicrobial activity by ginsan. FEMS Immunol Med Microbiol. 46, 187-197 (2006).
- Girish, V., Vijayalakshmi, A. Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ. Indian J Cancer. 41, 47-47 (2004).
- Hahn, B. L., Onunkwo, C. C., Watts, C. J., Sohnle, P. G. Systemic dissemination and cutaneous damage in a mouse model of staphylococcal skin infections. Microb Pathog. 47, 16-23 (2009).
- Hruz, P., Zinkernagel, A. S., Jenikova, G., Botwin, G. J., Hugot, J. P., Karin, M., Nizet, V., Eckmann, L. NOD2 contributes to cutaneous defense against Staphylococcus aureus through alpha-toxin-dependent innate immune activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12873-12878 (2009).
- Ji, Y., Zhang, B., Van, S. F., Horn, P. W. arren, Woodnutt, G., Burnham, M. K., Rosenberg, M. Identification of critical staphylococcal genes using conditional phenotypes generated by antisense RNA. Science. 293, 2266-2269 (2001).
- Somerville, G. A., Beres, S. B., Fitzgerald, J. R., DeLeo, F. R., Cole, R. L., Hoff, J. S., Musser, J. M. In vitro serial passage of Staphylococcus aureus: changes in physiology, virulence factor production, and agr nucleotide sequence. J Bacteriol. 184, 1430-1437 (2002).
- Tseng, C. W., Kyme, P., Low, J., Rocha, M. A., Alsabeh, R., Miller, L. G., Otto, M., Arditi, M., Diep, B. A., Nizet, V., Doherty, T. M., Beenhouwer, D. O., Liu, G. Y. Staphylococcus aureus Panton-Valentine leukocidin contributes to inflammation and muscle tissue injury. PLoS One. 4, e6387-e6387 (2009).
- von Kockritz-Blickwede, M., Rohde, M., Oehmcke, S., Miller, L. S., Cheung, A. L., Herwald, H., Foster, S., Medina, E. Immunological mechanisms underlying the genetic predisposition to severe Staphylococcus aureus infection in the mouse model. Am J Pathol. 173, 1657-1668 (2008).
