זיהום תת עורי של סטפילוקוקוס אוראוס עמיד Methicillin (MRSA)

Summary

העור Murine מודל זיהום ברקמות רכות מנוצל להערכת תפקוד ארסיות של Staphylococcus aureus עמידים methicillin (MRSA) לבין התגובות החיסוניות המארח. כאן, הצגנו מודל זיהום תת עורי לעור זיהום ברקמות רכות.

Abstract

MRSA הוא איום עולמי לבריאות הציבור, עור MRSA ו ברקמות הרכות זיהומים עכשיו להסביר יותר ממחצית כל רקמות רכות זיהומים בארצות הברית. בין הרקמות הרכות זיהומים, שררת, pyomyositis ו fasciitis necrotizing דווחו יותר ויותר עם MRSA הנובעים הקהילה העמותה. כדי להבין את יחסי הגומלין בין MRSA ו חסינות המארחת מובילה לזיהום חמור יותר, הזמינות של מודלים של בעלי חיים הוא קריטי, המתיר את המחקר של המארח גורמים חיידקיים. מודלים זיהום מספר הוכנסו להעריך את בפתוגנזה של ס aureus במהלך דלקת עור שטחית. כאן אנו מתארים מודל דלקת תת עורית אשר בוחן את העור, תת עורית, ו פתולוגיות שריר.

Protocol

1. הכנת עבור זיהום MRSA (יומיים לפני הזיהום)

1. לחסן loopful של MRSA מתרבות המניות אגר דם (אגר Trypticase סויה (TSA)) צלחת.
2. בדוק את הפנוטיפ המוליזה (אזור המושבה ברור סביב כל אחת) בצלחת אגר דם.
3. פיק למושבה בעלת פנוטיפ המוליטית העולה בקנה אחד עם ניסויים אחרים.
4. לחסן את המושבה לתוך 3 מ"ל טוד יואיט מרק (THB), עם אנטיביוטיקה לעצמו, כאשר הצורך, צינור 15 מ"ל Snap-כתרים.
5. לדגור על 37 מעלות צלזיוס לילה עם רועד בסל"ד 220.

2. הכנת עכברים לזיהום (יום לפני הזיהום)

1. בהתאם לגודל של העכברים, לגלח את הפרווה מעל שטח 3 4 ס"מ בחלק האחורי של עכברים.
2. החל ~ 5 מ"מ ³ מסיר שיער שמנת (שנרכשו מרקחת מקומי) לאזור מגולח.
3. אפשר קרם להסרת שיער כדי לדגור על פני העור דקות בערך 1.
4. מגבות נייר רטוב עם DDH ₂ O.
5. נגבו את קרם להסרת השיער במגבת נייר רטוב.

3. הכנת עבור זיהום MRSA (ביום זיהום)

1. למהול את תרבית החיידקים לילה בשעה 1:500 ל 1:1000 עם 10 מ"ל של THB מראש התחמם, בתוך צינור 50 בורג הכתיר מ"ל.
2. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך כ 2.5 שעות עם רועד בסל"ד 220 עד ₅₄₀ מגיע ל 2.5.
3. איסוף MRSA ידי צנטריפוגה XG ב 3225 ב 10 דקות 4 ° C.
4. בטל supernatant.
5. Resuspend גלולה חיידקים פוספט 10 מ"ל של Dulbecco שנאגרו מלוחים (DPBS).
6. חזור על שלבים 3 ו -4.
7. Resuspend גלולה חיידקים DPBS בריכוז הרצוי.
8. סדרתי לדלל את ההשעיה של חיידקי ינואר ¹⁰ - אוגוסט 10.
9. פלייט ההשעיה חיידקי מדולל על צלחות אגר דם.
10. דגירה צלחות ב 37 ° C במשך הלילה.
11. לצפות ולהקליט את הפנוטיפ המוליטית של inocula.
12. הרוזן המושבה הקמת יחידות (CFU) מספר על הצלחת.
13. חישוב inocula מבוסס על מספר CFU על הצלחת.

4. זיהום תת עורי של MRSA (ביום זיהום ו 3 ימים לאחר ההדבקה)

1. להזריק תת עורי 100 ההשעיה חיידקי μL באזור מגולח.
2. שימו לב החיות במשך 3 עד 5 שעות לאחר ההזרקה כדי לוודא העכברים בחיים.
3. שים את הנגע על הגב של החיות יום ולהקליט את אזור הנגע יומי כאשר הוא נחוץ. תצפית הנגע צריך לכלול הקלטה בגודל הנגע מורפולוגיה ו. גם העור ונגעים שריר נבדקת ונרשמת על ידי הכפלת אורך ורוחב של הנגע. נגעים לא סדיר בצורת צריך להיות שבור למטה לתוך חלקים סימטריים קטנות יותר, כל חתיכה נמדד באותה שיטה. מדידות הנגע יכול גם להשתמש בתוכנית בסיוע מחשב הערכה histomorphometric (ImageJ, קוד פתוח זמין מ-NIH ב http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) ^2.
4. הקורבן חיות ביום 3 שלאחר זיהום על ידי שאיפה של isoflurane ואחריו נקע בצוואר הרחם.
5. לצפות ולהקליט את הנגע על פני העור.
6. ניק את העור עם זוג מספריים סטרילית.
7. מקלפים את עורו בזהירות לצפות ולהקליט את הנגע על השריר.
8. הנגע והבלו ו כ 2-5 מ"מ של האזור שמסביב.
9. איסוף הטחול והכליות.
10. Homogenize הרקמות באמצעות homogenizer רקמה או על ידי יישום חוזרות ונשנות של הבוכנה של מזרק 1 מ"ל לצינור microfuge המכיל את רקמות 100 μL של DPBS.
11. הוספת 900 μL של DPBS אל צינור אחד.
12. וורטקס דגימות דקות 5.
13. סדרתי לדלל את ההשעיה עם DPBS ינואר ¹⁰ - יוני 10.
14. פלייט השעיות מדולל על צלחות THA.

5. נציג תוצאות:

1. מיד לאחר כל הזרקה תת עורית, בועה יהיה שנצפה על פני העור כאשר הזיהום נעשה כראוי (איור 1 א). אם לא בועה הוא ציין על פני העור, הזרקה עלולה להיות עמוק מדי, זה עלול להשפיע על תוצאות הזיהום (בגודל הנגע, CFU).
2. השעיית חיידקי צריך להיות מדולל באופן סדרתי CFU את הצורך להיבדק על צלחות אגר דם עבור כל ניסוי. פעולה זו תניב מידע חשוב: 1) אם inocula יש פנוטיפ הומוגנית; 2) את הספירה המדויקת חיידקי קיימא עבור הזיהום.
3. הנגעים והישרדות חיידקי ניתן להעריך בנקודות זמן שונות לאחר הפגיעה. הנה, בחנו את זיהום ביום 3 שלאחר זיהום. גודל הנגע מנותחים על פני העור (1B איור: 1x 10 ^9; 1D איור: 1 x 10 ⁷ CFU) ועל פני השטח את השריר (תרשים 1C: 1x 10 ⁹ 7 CFU). אזור הנגע שווה אורך (מ"מ) x רוחב (מ"מ) ניתן למדוד להערכת נזק לרקמות (איורים 2 A ו-B). תוצאה זו יכולה לעזור לקבוע את מידת הנזק לרקמות שנגרם על ידי גורם ארסיות נתון. בנוסף, נגעים הם נכרת, ומעורים ב DPBS, ואת מצופה כדי לכמת את מספר CFU (איור 2 ג), אשר מציין את הכדאיות של החיידקים באתר זיהום.

באיור 1. העור ונגעים השריר. CD1 העכברים היו מחוסן תת עורית על צלע אחת עם MRSA (LAC). התמונות צולמו 0 זמן ביום 3 שלאחר זיהום. (א) זמן 0 שלאחר זיהום (PI), (ב) - (ז) 3 יום pi, ב ', ד' ו-F: נגעים בעור, C, E, ו-G: פצעים שריר, B ו-C: 1x 10 ⁹ CFU נגוע, D ו-E: 1x 10 ⁷ CFU נגוע, F ו-G: מדומה.

איור 2. הנגע בעור גודל וחיידקים קיימא לספור באתר זיהום ביום עור 3. שלאחר דלקת שריר נגעים על MRSA (LAC) CD1 עכברים נגועים. (א) גודל הנגע בעור. (ב) שריר גודל הנגע. (ג) סך CFU רקמות. H: 1 x 10 ⁹ CFU inocula: L: 1 x 10 ⁷ CFU inocula. * P <0.05, Mann-Whitney הבדיקה.

Discussion

1. העור Murine מודל זיהום ברקמות רכות הוא כלי רב עוצמה עבור בהערכת ארסיות vivo של הפתוגן. Pathogenicity ש aureus זיהום רקמת העור רך עשוי להשתנות בהתאם למספר פרמטרים. אלה כוללים את גודל inoculum, שלב התפתחות חיידקים, עומק של חיסון, גיל של עכברים, על רקע גנטי העכבר ^{7, 8.} כאשר בוחנים את תפקוד ארסיות באמצעות מודל זה, חשוב לשלוט על פרמטרים אלה על מנת להבטיח כי התוצאות יהיו עקביים. למדנו זיהום MRSA עורו של מספר זנים של עכברים, לרבות SKH1 (עכברים חסרי שיער), C57Bl / 6, BALB / C, ו - CD1. תוצאות זיהום להשתנות ב ⁷ זנים שונים, עולה בקנה אחד עם דיווחים אחרים את ההרכב הגנטי של העכבר הוא הקובע חשוב חומרת זיהום MRSA ^1. בניסוי זה, אנו מנצלים CD1 עכברים, כי זה זן עכבר הוכח להיות מותאם היטב מחקרים ש ארסיות aureus גורמים ⁵ והוא זול יותר מאשר זנים אחרים.
2. כדי להבטיח את התוצאות של הניסויים הן עקביות, המושבה הרים לזיהום יש לבדוק עבור פנוטיפ המוליזה שלה לפני כל ניסוי. פנוטיפ β-המוליטית על אגר דם כבש (אזור ברור סביב המושבה) משקף ביטוי הרעלן α ידי ס aureus לבודד. צעד זה חיוני כי מוטציה ספונטנית של ס הרגולטור aureus העולמי דווחה להתרחש, וכתוצאה מכך ביטוי α-רעלן מדוכא ^6. S. aureus חסר α-רעלן ביטוי תערוכות פנוטיפ ארסית פחות לעומת זנים isogenic המבטאים הרעלן ^α-4.
3. אחרי גילוח הפרווה מהגב של עכברים, להחיל כ -5 בגודל ³ מ"מ מסיר שיער שמנת (רכישה מהחנות סמים מקומי) לאזור מגולח. צעד זה ישמור את החלק האחורי של עכברים ללא שיער במשך 5 עד 7 ימים. מספר סוגים של קרם להסרת שיער יעבוד, אך חשוב לבחור אחד שגורם את הכמות המינימלית של גירוי בעור. אנו ממליצים על משחות להסרת שיער עם שמן תינוקות.
4. כאשר מזריקים את ההשעיה חיידקי, בועה יהיה שנצפה על פני העור (איור 2 א). כאשר זריקה הוא עמוק מדי (בועה לא נצפו), השעיה עשויה להיות מחוסן לתוך השריר, אשר ישפיעו על התוצאה זיהום בגלל באתר זיהום טועה, הנגע והתאוששות CFU מן הרקמה התת עורית של העכבר יהיה שונה.
5. בנוסף גודל הנגע ולספור CFU, המשתנים התלויים ניתן גם לבחון כדי להעריך ארסיות. אלו כוללות הפצת חיידקים, רמות ציטוקינים בדם, אתר זיהום ורמות ציטוקינים chemokine, גיוס PMN, היסטולוגיה ו ^{3, 6.}
6. עבור היסטולוגיה וניתוח immunochemistry, רקמות נגועים ניתן שנכרת קבוע ב -10% פורמלין לילה. כאשר מוציא רקמות נגועות, 2-5 מ"מ רקמה בריאה ונשמע את הנגע צריך לחתוך עם הנגע. זה יהיה להבטיח כי לא רקמות עמוק פתולוגיים מושמטים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
THB	VWR international	95025-314
DPBS	Invitrogen	21-031-CV
1 ml syringe	BD Biosciences	309602
27G1/2 needle	BD Biosciences	305109
Sheep Blood Agar (TSA)	VWR international	90004-328