Summary
La piel murina y el modelo de infección de los tejidos blandos se utiliza para evaluar la función de la virulencia de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) y la respuesta inmune de acogida. Aquí, presentamos un modelo de infección subcutánea de la piel y la infección de tejidos blandos.
Abstract
MRSA es una amenaza mundial para la salud pública, y la piel por SARM y las infecciones de tejidos blandos representan más de la mitad de todas las infecciones de tejidos blandos en los Estados Unidos. Entre las infecciones de tejidos blandos, miositis, piomiositis y fascitis necrotizante han sido cada vez más en asociación con MRSA que surgen de la comunidad. Para entender la interacción entre el SARM y la inmunidad del huésped que conduce a una infección más severa, la disponibilidad de modelos animales es fundamental, lo que permite el estudio de la huésped y los factores bacterianos. Varios modelos de infección se han introducido para evaluar la patogénesis de la S. aureus durante la infección superficial de la piel. Aquí se describe un modelo de infección subcutánea que examina la piel, subcutánea, y patologías musculares.
Protocol
1. Preparación del MRSA para la infección (dos días antes de la infección)
- Inocular un asa de MRSA de una cultura de valores a un agar sangre (agar tripticasa soja (TSA)) plato.
- Compruebe el fenotipo de hemólisis (una zona clara alrededor de cada colonia) en la placa de agar sangre.
- Elija una colonia que tiene un fenotipo hemolítico que es consistente con otros experimentos.
- Inocular la colonia en 3 ml de caldo de Todd Hewitt (THB), con el antibiótico apropiado cuando sea necesario, en un 15 ml con tapa del tubo.
- Se incuba a 37 ° C durante la noche con agitación a 220 rpm.
2. Preparación de los ratones de la infección (un día antes de la infección)
- Dependiendo del tamaño de los ratones, afeitarse la piel de un área de 3 x 4 cm en la parte posterior de los ratones.
- Aplicar ~ 5 mm 3 crema depilatoria (comprado en una tienda local de la droga) a la zona afeitada.
- Permitir que la crema depilatoria para incubar en la superficie de la piel durante aproximadamente 1 min.
- Toallas de papel mojadas con ddH 2 O.
- Limpie la crema depilatoria con la toalla de papel húmeda.
3. Preparación del MRSA para la infección (en el Día de la infección)
- Diluir el cultivo de bacterias durante la noche a 1:500 a 1:1000 con 10 ml de pre-calentado THB, en 50 ml con tapón de rosca del tubo.
- Se incuba a 37 ° C durante aproximadamente 2,5 horas con agitación a 220 rpm, hasta que alcanza un 540 2.5.
- Recoger MRSA por centrifugación a 3.225 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Eliminar el sobrenadante.
- Resuspender el sedimento bacteriano en 10 ml de Dulbecco buffer fosfato salino (DPBS).
- Repita los pasos 3 y 4.
- Resuspender el sedimento bacteriano en DPBS a una concentración deseada.
- Serie diluir la suspensión bacteriana de 01 10-8 10.
- Placa de la suspensión bacteriana diluida en placas de agar sangre.
- Las placas se incuban a 37 ° C durante la noche.
- Observar y registrar el fenotipo hemolítico de los inóculos.
- Contar con unidades formadoras de colonias (UFC) número de la placa.
- Calcular los inóculos en función del número UFC en la placa.
4. La infección de MRSA por vía subcutánea (en el Día de la infección y 3 días post-infección)
- Inyecta por vía subcutánea 100 l de suspensión de bacterias en la zona afeitada.
- Observar a los animales de 3 a 5 horas después de la inyección para asegurarse de que los ratones están vivos.
- Observar la lesión en la espalda de los animales diariamente y registrar el área de la lesión al día cuando sea necesario. Observación de la lesión debe incluir la grabación de tamaño de la lesión y la morfología. La piel y las lesiones musculares se cuantifican multiplicando la longitud y la anchura de la lesión. Las lesiones de forma irregular deben ser divididos en pequeños trozos simétricos, y cada pieza mide por el mismo método. Mediciones de lesiones también puede utilizar un programa asistido por ordenador evaluación histomorfométrico (ImageJ, de código abierto disponible en el NIH en http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) 2.
- Sacrificio de los animales en el día 3 después de la infección por inhalación de isoflurano seguido por dislocación cervical.
- Observar y registrar la lesión en la piel.
- Nick de la piel con un par de tijeras estériles.
- Pelar la piel de cuidado y observar y registrar la lesión en el músculo.
- Impuestos Especiales de la lesión y aproximadamente 2 - 5 mm de la zona circundante.
- Recoger el bazo y los riñones.
- Homogeneizar los tejidos usando un homogeneizador de tejidos o por la aplicación repetida de un émbolo de una jeringa de 1 ml a un tubo de microcentrífuga que contiene el tejido y 100 L de DPBS.
- Añadir 900 l de DPBS a cada tubo.
- Vortex las muestras durante 5 min.
- Serie diluir la suspensión con DPBS 01 10-junio 10.
- Placa de las suspensiones diluidas en las placas de la ATC.
5. Los resultados representativos:
- Inmediatamente después de cada inyección subcutánea, una ampolla se observa en la superficie de la piel cuando la infección se hace correctamente (fig. 1A). Si no la ampolla se observa en la superficie de la piel, la inyección puede ser demasiado profundo, y esto puede afectar el resultado de la infección (tamaño de la lesión, CFU).
- La suspensión bacteriana debe ser diluida en serie y el UFC es necesario examinar en placas de agar sangre para cada experimento. Este paso dará importante información: 1) si los inóculos tienen fenotipo homogéneo, 2) el número exacto de bacterias viables para la infección.
- Las lesiones y la supervivencia bacteriana pueden ser evaluados en distintos momentos después de la infección. Aquí, hemos examinado la infección en el día 3 post-infección. El tamaño de la lesión se analizan en la superficie de la piel (Figura 1 B: 1 x 10 9; Figura 1 D: 1 x 10 7 UFC) y en la superficie del músculo (Figura 1 C: 1 x 10 9 7 UFC). El área de la lesión es igual a la longitud (mm) x ancho (mm) se puede medir para evaluar el daño en los tejidos (Fig. 2 A y B). Este resultado puede ayudar a determinar el grado de daño tisular causado por un factor de virulencia dado. Además, las lesiones se extirpan y se homogeneizaron en DPBS y plateado para cuantificar el número de UFC (Figura 2 C), lo que indica la viabilidad de las bacterias en el sitio de la infección.
Figura 1. La piel y las lesiones musculares. CD1 ratones fueron inoculados por vía subcutánea en un flanco con MRSA (ALC). Fotos fueron tomadas en el instante 0 y el día 3 post-infección. (A) Hora 0 post-infección (pi), (B) - (G) el día 3 pi; B, D y F: lesiones de la piel, C, E y G: lesiones musculares, B y C: 1 x 10 9 UFC infectados; D y E: 1 x 10 7 UFC infectados, F y G: se burlan.
Figura 2. Tamaño de lesión de piel y las bacterias viables contar en el lugar de la infección en el día 3 post-infección. Piel y las lesiones musculares en el MRSA (ALC) infectados ratones CD1. (A) el tamaño de lesión de piel. (B) tamaño de la lesión muscular. (C) UFC tejido total. H: 1 x 10 9 UFC inóculos, L: 1 x 10 7 UFC inóculos. *: P <0,05, Mann-Whitney.
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Discussion
- La piel y el modelo murino de infección de tejidos blandos es una poderosa herramienta para la evaluación de la virulencia de un patógeno in vivo. La patogenicidad de S. aureus en infecciones de piel y tejidos blandos puede variar en función de una serie de parámetros. Estos incluyen el tamaño del inóculo, fase de crecimiento bacteriano, la profundidad de la inoculación, la edad de los ratones, y el fondo genético del ratón 7, 8. Al examinar la función de la virulencia con este modelo, es fundamental para el control de estos parámetros para asegurar que los resultados sean consistentes. Hemos estudiado la infección MRSA de la piel en varias cepas de ratones, incluyendo SKH1 (ratones sin pelo), C57BL / 6, BALB / c, y CD1. Los resultados de la infección varían en las diferentes cepas 7, de acuerdo con otros informes que la composición genética del ratón es un determinante importante de la gravedad de la infección por MRSA 1. En este experimento, utilizamos ratones CD1, porque esta cepa de ratones se ha demostrado que es muy apropiada para los estudios de S. factores de virulencia de Staphylococcus 5 y es menos costosa que otras cepas.
- Para asegurarse de que los resultados de los experimentos son consistentes, de la colonia elegido para la infección se debe comprobar por su fenotipo hemólisis antes de cada experimento. El fenotipo β-hemolítico en agar sangre de cordero (una zona clara alrededor de la colonia), refleja la expresión de α-toxina por el S. aureus aislado. Este paso es esencial, porque la mutación espontánea de un S. regulador aureus mundial se ha informado que se producen, lo que resulta en depresión α-toxina de expresión 6. S. aureus que carecen de α-toxina expresión exhibe un fenotipo menos virulento en comparación con cepas isogénicas que expresan α-toxina 4.
- Después de afeitarse la piel de la espalda de ratones, se aplican aproximadamente 5 mm de crema para el cabello removedor de tres dimensiones (la compra de la farmacia local) a la zona afeitada. Este paso será mantener la espalda de ratones sin pelo de 5 a 7 días. Existen varios tipos de crema para el cabello se quita el trabajo, sin embargo, es importante elegir uno que induce a la menor cantidad de irritación de la piel. Le recomendamos cremas Depiladora con aceite de bebé.
- Si la inyección de la suspensión bacteriana, una ampolla se observa en la superficie de la piel (Figura 2). Cuando la inyección es demasiado profunda (sin ampolla observado), la suspensión puede ser inoculada en el músculo, lo cual afectará el resultado de una infección a causa de la infección del sitio equivocado, y la lesión y la recuperación de UFC en el tejido subcutáneo para que el ratón sea diferente.
- Además de tamaño de la lesión y el recuento de UFC, variables dependientes también pueden ser examinados para evaluar la virulencia. Estos incluyen la difusión bacterias, los niveles séricos de citoquinas, citocinas infección del sitio y los niveles de quemoquinas, la contratación PMN, y la histología 3, 6.
- Para la histología y el análisis de la inmunoquímica, tejido infectado puede ser extirpado y fijado en formalina al 10% durante la noche. Al extirpar los tejidos infectados, 2 - 5 mm de tejido sano que suena la lesión debe ser cortado con la lesión. Esto asegurará que no los tejidos patológicos profunda se omiten.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una concesión de carrera Burroughs-Wellcome y por los Institutos Nacionales de Salud de subvención AI074832 a GY Liu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| THB | VWR international | 95025-314 | |
| DPBS | Invitrogen | 21-031-CV | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 27G1/2 needle | BD Biosciences | 305109 | |
| Sheep Blood Agar (TSA) | VWR international | 90004-328 |
References
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