Summary
एचआईवी tropism वायरल लिफाफा के V3 के क्षेत्र से inferred किया जा सकता है. V3 पीसीआर नेस्टेड RT-पीसीआर, अनुक्रम का उपयोग कर तीन प्रतियों में परिलक्षित है, और bioinformatic सॉफ्टवेयर का उपयोग कर व्याख्या. कम g2P स्कोर के साथ 1 या अधिक अनुक्रम (ओं) के साथ के साथ नमूने गैर-R5 वायरस के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं.
Abstract
पृष्ठभूमि: पहले एचआईवी के उपचार में CCR5-प्रतिपक्षी वर्ग से एक दवा प्राप्त करने के लिए, एक मरीज को एचआईवी tropism परीक्षण से गुजरना करने के लिए पुष्टि है कि उसके या उसके वायरल जनसंख्या CCR5 coreceptor सेलुलर प्रवेश के लिए उपयोग करता है, और नहीं एक वैकल्पिक coreceptor चाहिए. एक tropism परीक्षण करने के लिए दृष्टिकोण एचआईवी लिफाफा, जो coreceptor के साथ interacts के V3 क्षेत्र के अनुक्रम की जांच करने के लिए है.
तरीके: वायरल शाही सेना रक्त प्लाज्मा से निकाला जाता है. V3 के क्षेत्र में नेस्टेड रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस पीसीआर के साथ तीन प्रतियों में परिलक्षित होता है. amplifications तो अनुक्रम और सॉफ्टवेयर, RE_Call विश्लेषण का उपयोग कर. दृश्यों को फिर geno2pheno जैसे bioinformatic एल्गोरिथ्म V3 क्षेत्र से वायरल tropism अनुमान को प्रस्तुत कर रहे हैं. दृश्यों गैर-R5 हो सकता है अगर अपनी geno2pheno झूठी सकारात्मक दर नीचे 5.75% गिर inferred रहे हैं. यदि एक नमूना से तीन दृश्यों में से किसी एक गैर-R5 inferred किया है, रोगी एक CCR5-प्रतिपक्षी का जवाब की संभावना नहीं है.
Protocol
प्रक्रिया:
1. निकालना:
रक्त प्लाज्मा के कम से कम 500 μL इस genotypic tropism एचआईवी परीक्षण के लिए नमूना इनपुट के रूप में की जरूरत है.
- प्लाज्मा की easyMAG (bioMérieux) स्वचालित चिमटा, या अपनी प्रयोगशाला की पसंदीदा निष्कर्षण विधि का उपयोग 500μL से एचआईवी आरएनए निकालें.
Elute एक 60 μL विभाज्य में वायरल शाही सेना निकाली. -20 डिग्री सेल्सियस या निकालने के तुरंत बाद ट्रांसक्रिपटेस पीसीआर उल्टा शुरू में स्टोर.
2. RT-पीसीआर:
नमूना निकालने के 4μL नेस्टेड RT-पीसीआर के तरीके का उपयोग कर तीन प्रतियों में परिलक्षित हो जाएगा. RT-पीसीआर प्रतिक्रिया एक पीसीआर साफ कमरे में सेट करना होगा.
- परिलक्षित हो नमूनों की संख्या के लिए आवश्यक अभिकर्मक की राशि की गणना. 1 प्रतिक्रिया के लिए अभिकर्मक मात्रा का संकेत नीचे दी गई तालिका का पालन करें.
तालिका 1. अभिकर्मक एक कदम आरटी पीसीआर 1 प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक मात्रा .अभिकर्मक वॉल्यूम (μL)
(1X प्रतिक्रिया)DEPC पानी का इलाज 10.56 2x प्रतिक्रिया बफर 20 50% sucrose और 0.04% की bromophenol नीले मिश्रण 4 फॉरवर्ड एचआईवी V3 क्षेत्र लक्ष्यीकरण प्राइमर 0.32 रिवर्स प्राइमर 0.32 एनजाइम - सुपरस्क्रिप्ट III प्लेटिनम Taq डीएनए पोलीमरेज़ के साथ एक चरण प्रणाली RT-पीसीआर 0.8 कुल 36
हर एक कदम प्रतिक्रिया RT-पीसीआर निम्नलिखित नुस्खा की आवश्यकता:- 10.56 μL DEPC पानी का इलाज
- 2x प्रतिक्रिया बफर के 20 μL
- 4μL 50% sucrose और 0.04% की bromophenol नीले मिश्रण
- आगे एचआईवी V3 क्षेत्र लक्ष्यीकरण प्राइमर के 0.32 μL
- रिवर्स प्राइमर के 0.32 μL
- एंजाइम के 0.8 μL
- बगल में एक पंक्ति में एक खाली नमूना निकालने ट्यूबों अप लाइन, 96 में अच्छी तरह से पीसीआर थाली लेबल.
- एक पुनरावर्तक विंदुक का प्रयोग, पीसीआर थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए नमूना मिश्रण के 36 μL जोड़ने के लिए, जैसे कि वहाँ 3 कुओं प्रत्येक नमूने निकालने के लिए तैयार हैं.
* नोट: यह प्रक्रिया तीन प्रतियों में प्रदर्शन किया जाना चाहिए, कम से कम, वायरल जनसंख्या का पर्याप्त नमूने सुनिश्चित. - 8 चैनल एक multichannel विंदुक का प्रयोग अपने तीन कुओं में से प्रत्येक के लिए नमूना निकालने के 4μL जोड़ने. इसके अलावा एक के बीच युक्तियाँ बदलें.
- कुओं पीसीआर पट्टी टोपी के साथ कवर.
- जब हस्तांतरण comlete है, thermocycler में पीसीआर की थाली जगह है. निम्नलिखित प्रोग्राम के साथ चलाने के लिए thermocycler सेट 30 मिनट: 52 डिग्री सेल्सियस 94 पर 2 मिनट डिग्री सेल्सियस के 40 चक्रों (94 पर 15 सेकंड डिग्री सेल्सियस, 55 में 30seconds डिग्री सेल्सियस और 1.5 68 मिनट डिग्री सेल्सियस) 5 मिनट 68 पर डिग्री सेल्सियस
- Thermocycler से पीसीआर थाली निकालें. प्लेट कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है.
दूसरे दौर पीसीआर कदम के लिए आगे बढ़ें
3. दूसरा दौर पीसीआर:
- परिलक्षित हो नमूनों की संख्या के लिए आवश्यक अभिकर्मक की राशि की गणना. 1 प्रतिक्रिया के लिए अभिकर्मक मात्रा का संकेत नीचे दी गई तालिका का पालन करें.
टेबल 2 अभिकर्मक मात्रा 1 2 एन डी दौर पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक है .अभिकर्मक वॉल्यूम (μL)
(1X प्रतिक्रिया)DEPC पानी का इलाज 13.45 60% sucrose, 0.08% cresol लाल मिश्रण 2 Roche hifi प्रणाली बफर 2 2 2 MgCl 0.8 dNTP 0.16 अग्रेषित पीसीआर प्राइमर 0.15 रिवर्स पीसीआर प्राइमर 0.15 HiFi एंजाइम का विस्तार 0.29 कुल 19
प्रत्येक दूसरे दौर पीसीआर प्रतिक्रिया निम्नलिखित नुस्खा की आवश्यकता:- 13.45 μL DEPC पानी का इलाज
- 2 μL 60% sucrose, 0.08% cresol लाल मिश्रण
- Roche hifi प्रणाली बफर 2 के 2 μL
- 25 मिमी 2 MgCl के 0.8 μL
- 25 मिमी dNTP के 0.16 μL
- 0.15 μL आगे और रिवर्स पीसीआर प्राइमरों के दोनों
- 0.29 μL विस्तार HiFi एंजाइम
- एक के बाद प्रवर्धन कमरे में, 8 चैनल एक multichannel विंदुक का उपयोग कर टेम्पलेट RT-पीसीआर के दूसरे दौर पीसीआर बफर में 1 μL हस्तांतरण. इसके अलावा एक के बीच युक्तियाँ बदलें.
- कुओं पीसीआर पट्टी टोपी के साथ कवर और एक thermocycler दूसरे दौर पीसीआर थाली हस्तांतरण.
- निम्नलिखित प्रोग्राम के साथ चलाने के लिए thermocycler सेट: 94 पर 2 मिनट ° सी (94 पर 15 सेकंड के 35 चक्रों सी डिग्री सेल्सियस, 55 में 30 सेकंड, 72 पर 1 मिनट ° डिग्री सेल्सियस) 72 पर 7 मिनट डिग्री सेल्सियस
- Thermocycler से थाली निकालें बाद तापमान 25 से वापस आ गया है डिग्री सेल्सियस
4. जेल वैद्युतकणसंचलन:
आदेश में पुष्टि करने के लिए कि V3 क्षेत्र सफलतापूर्वक किया गया प्रवर्धित है, एक जेल वैद्युतकणसंचलन कदम प्रदर्शन किया है.
- 1X TAE बफर के 50 एमएल में 0.8 जी agarose पाउडर के साथ एक agarose जेल तैयार करें. हलचल और ~ 1 मिनट या के लिए माइक्रोवेव में पिघला जब तक agarose पूरी तरह भंग है.
- SYBR सुरक्षित दाग जेल और मिश्रण ज़ुल्फ़ के 6 μL जोड़ें.
- समाधान एक जेल ट्रे में डालो, और पर्याप्त जेल कंघी जोड़ने के लिए पीसीआर कुओं की संख्या को समायोजित.
- एक बार जेल सूखा है, कंघी को हटाने और जगह जेल जेल तंत्र में, यकीन है कि यह पूरी तरह से 1X TAE बफर में डूबे हुए है.
- 10 μL multichannel विंदुक का प्रयोग, जेल में अपनी अपनी अच्छी तरह से प्रत्येक पीसीआर नमूने के 8μL जोड़ने. पीसीआर थाली कवर के बाद amplifications जेल में जोड़ा गया है.
- डीएनए सीढ़ी के 6 μL प्रति कम से कम पंक्ति अच्छी तरह से एक जोड़ें.
- भागो ~ 100V ~ 10 मिनट के लिए जेल तंत्र, यकीन है कि बैंड बंद जेल नहीं चला.
- एक यूवी पार प्रकाशक पर जेल प्लेस और जेल की एक तस्वीर ले लो.
पीसीआर प्रवर्धित डीएनए के साथ वेल्स प्रकाश दिखाई देते हैं, एक सफल प्रवर्धन का संकेत होगा. - सभी नमूनों को जहां तीन amplifications सफलता थे नोट करें. यदि आवश्यक हो, उन नमूनों के लिए कम से कम 3 amplifications RT-पीसीआर के साथ दोहराने.
अनुक्रमण करने के लिए आगे बढ़ें
5. अनुक्रमण:
वायरल सीडीएनए प्रवर्धित करने के बाद, नमूने अनुक्रमण के लिए तैयार किया जा सकता है. अनुक्रमण प्रतिक्रिया - प्रवर्धन के बाद एक कमरे में जगह ले जाना चाहिए.
- फ्रीजर और रेफ्रिजरेटर से अनुक्रमण प्राइमरों से BigDye निकालें. 1 घंटे से भी अब नहीं के लिए कमरे के तापमान पर BigDye पिघलना, चलो.
- को चलाने के लिए नमूनों की संख्या के लिए आवश्यक अभिकर्मक की राशि की गणना. 1 प्रतिक्रिया के लिए अभिकर्मक मात्रा का संकेत नीचे दी गई तालिका का पालन करें.
टेबल 3. अभिकर्मक मात्रा अनुक्रमण की एक प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक हैं .अभिकर्मक वॉल्यूम (μL)
(1X प्रतिक्रिया)BigDye 0.3 BigDye बफर 2.1 भजन की पुस्तक 2.6 कुल 5.0
* नोट: प्रत्येक प्राइमर के लिए एक अलग मिश्रण तैयार है.
** नोट: BigDye अनुक्रमण प्रतिक्रिया में इस्तेमाल किया बफर के रूप में तैयार किया जा सकता है है: Trizma हाइड्रोक्लोराइड बफर समाधान (एम 1) (pH9.0) और मैग्नेशियम क्लोराइड के 0.125 एमएल (1 एम) के मिक्स 17.5 एमएल. अभिकर्मक ग्रेड पानी के साथ 100 एमएल के लिए अंतिम मात्रा लाओ. यह 2-8 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए - 3.3 से गणना का उपयोग करना, अनुक्रमण प्रतिक्रिया प्रत्येक और अधिक से अधिक 5 सेकंड के लिए प्राइमर भंवर के लिए घोला जा सकता है है तैयार. विभाज्य 0.2mL पट्टी ट्यूबों में.
- विभाज्य उपयुक्त एक multichannel विंदुक प्लेट का उपयोग कर कुओं में प्रतिक्रिया मिश्रण अनुक्रमण के 5 μL. कवर प्लेट (ओं) को एक Kimwipe साथ अनुक्रमण प्रतिक्रिया मिश्रण युक्त और अलग निर्धारित करें.
- प्रवर्धित पीसीआर उत्पाद के 1:15 कमजोर पड़ने शेष पीसीआर उत्पाद बैक्सटर बाँझ पानी के 180 μL जोड़कर तैयार करें.
- उपयुक्त प्लेट कुओं के नीचे पतला नमूने के एक μL पिपेट, विंदुक युक्तियाँ बदल जाते हैं.
- जब नमूना हस्तांतरण समाप्त पट्टी टोपियां और भंवर के साथ 1 सेकंड के लिए थाली सील
- एक अपकेंद्रित्र में थाली प्लेस. 145g, जब स्पिन गति 145g तक पहुँचता गति निर्धारित करें, स्पिन बंद करो.
- (ओं) thermocycler निम्नलिखित कार्यक्रम के लिए सेट में थाली प्लेस: के 25 चक्रों (10 सेकंड 96 @ ° सी, 5 सेकंड 50 @ डिग्री सेल्सियस, 55 सेकंड 60 @ डिग्री सेल्सियस.) मात्रा में होना चाहिए कम से कम 6μL . चक्र मोटे तौर पर 1.2 घंटे लग चाहिए.
वर्षा के लिए आगे बढ़ें
6. वर्षा:
करने के लिए "साफ" अनुक्रमण प्रतिक्रिया के बाद वायरल सीडीएनए, इथेनॉल वर्षा 95% इथेनॉल का उपयोग करते हैं.
- Thermocycler से थाली पुनर्प्राप्त और एक पोस्ट - ampli लानेदिखाएं कमरा.
- पट्टी टोपी निकालें और आदेश में उन्हें एक साफ कागज तौलिया या Kimwipe पर जगह है.
- कार्य EDTA - सोडियम एसीटेट अच्छी तरह से प्रत्येक नमूने के पक्ष समाधान के पिपेट 4μL. थाली धीरे इतना है कि EDTA - सोडियम समाधान अच्छी तरह से नीचे गिरता है ठोकर. उसी सुझावों इतने लंबे समय से इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में वे अच्छी तरह से नीचे नमूना संपर्क नहीं है.
* नोट: काम EDTA - सोडियम एसीटेट समाधान के रूप में तैयार किया जा सकता है है:- अभिकर्मक ग्रेड पानी का 1 एल में सोडियम एसीटेट के 246.1 छ भंग करके 3M सोडियम एसीटेट तैयार. 0.45 माइक्रो फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर और 50 एमएल aliquots तैयार.
- स्टॉक EDTA - सोडियम एसीटेट समाधान (1.5 एम NaOAc, 250 मिमी EDTA) सोडियम एसीटेट (एम 3) और EDTA के समाधान (500 मिमी) 8.0 पीएच के बराबर मात्रा के मिश्रण से तैयार करें.
- एक हिस्सा शेयर अभिकर्मक ग्रेड पानी (10 एमएल + 30 एमएल) के तीन भागों के साथ EDTA - सोडियम एसीटेट समाधान मिश्रण द्वारा EDTA - सोडियम एसीटेट समाधान काम तैयार करें.
- ठंडा 95% इथेनॉल का नमूना कुओं के विपरीत पक्ष पर और पिपेट 40μL पट्टी टोपी की जगह.
- टोपी और 10 सेकंड के लिए थाली भंवर सील. थाली ठोकर किसी भी बुलबुले बेदखल.
- -20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट और 2 घंटे की एक अधिकतम की एक न्यूनतम के लिए फ्रीजर में थाली प्लेस.
- एक बार वर्षा हुई है, और 3700 rpm पर 20 मिनट के लिए एक अपकेंद्रित्र में फ्रीजर जगह से थाली हटा दें.
- फ्रीजर से हाय - डि Formamide (एप्लाइड Biosystems) की उचित राशि निकालें विकृतीकरण पहले पिघलना करने के लिए अनुमति देते हैं.
- थाली कताई के बाद हटाने और पट्टी टोपियां त्यागें. बर्बाद कंटेनर (eg. कचरा बिन) और छानना सतह पर तैरनेवाला पर थाली उलटें. सोख्ता कागज तौलिया पर औंधा प्लेटों के द्वारा किसी भी शेष सतह पर तैरनेवाला से छुटकारा.
- थाली की सतह पर कागज तौलिया और जगह के 2 चादरें मोड़ो. 145g पर अपकेंद्रित्र और स्पिन में थाली facedown प्लेस, स्पिन रोक जब यह 145g तक पहुँचता है.
- अपकेंद्रित्र से थाली निकालें और यकीन है कि कुओं खाली कर रहे हैं जाँच. कुओं में ठंडा 95% इथेनॉल के पिपेट 155μL.
- बर्बाद कंटेनर और कागज तौलिया पर दाग में सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 4.10 में centrifugation दोहराने.
- अपकेंद्रित्र से थाली हटाने पर प्रयुक्त कागज तौलिया त्यागें और थाली चेहरा खड़े 2-5 मिनट के लिए किसी भी शेष इथेनॉल लुप्त हो जाना करने के लिए अनुमति देते हैं.
Denaturing करने के लिए आगे बढ़ें
7. Denaturing
- एक multichannel विंदुक के लिए काफी बड़े कंटेनर में thawed HiDi Formamide और छानना निकालें,
* नोट: यदि पूर्व aliquoted 6.7b में नोट उपायों का उपयोग, एक ट्यूब प्रत्येक 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए चलाए जा के लिए आवश्यक है. - एक multichannel विंदुक का प्रयोग, थाली पर सभी कुओं में HiDi Formamide के 10μL उन है कि खाली हैं सहित वितरित,.
- एक septa चटाई के साथ थाली कवर के लिए एक मुहर के रूप में.
- 90 ° C पर 2 मिनट के लिए एक thermocycler में थाली प्लेस.
- विकृतीकरण के बाद, एक थाली धारक में थाली तो जगह sequencer में लोड. तैयार अनुक्रमण लेआउट अपलोड. प्लेट्स -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है है, अनुक्रमण रन प्रदर्शन से पहले एक सप्ताह के लिए.
8. परिणामी बेस कॉलिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण.
- याद का प्रयोग स्वत: कोई मानवीय हस्तक्षेप के साथ बुला आधार प्रदर्शन, एक प्राइमर कवरेज स्वीकार्य है. याद करते हैं कि निम्न URL पर पाया जा सकता है है एक कस्टम बेस फोन सॉफ्टवेयर: http://pssm.cfenet.ubc.ca/
* ध्यान दें: एक खाते में प्रवेश करने के लिए आवश्यक है. एक खाता सेट करने के लिए, प्रवेश पृष्ठ पर "पंजीकरण" बटन पर क्लिक करें. एक बार एक खाता बना दिया गया है आप अपलोड पृष्ठ का उपयोग कर सकते हैं. - जब में लॉग इन, आप अपलोड करने के लिए नमूना फ़ाइलों का चयन कर सकते हैं. आप अपने कच्चे अनुक्रमण डेटा का पता लगाने के लिए 20MB की एक अधिकतम अपलोड के साथ अपलोड कर सकते हैं ब्राउज़ विकल्प का उपयोग करना.
* नोट:. वेब याद केवल एक ज़िप में अबी और SCF फ़ाइलों के रूप में डेटा फ़ाइलों को स्वीकार करेंगे, टार या tar.gz फ़ाइल - एक बार अपलोड करने के लिए फ़ाइलों का चयन किया गया है, आपके संदर्भ के अनुक्रम का चयन. इस मामले में, सुनिश्चित करें कि संदर्भ अनुक्रम करने के लिए सेट कर दिया जाता है 'V3. अब आप क्लिक करने के लिए तैयार "प्रक्रिया डेटा."
- संसाधित डेटा पृष्ठ के दाहिने हाथ की ओर पर शीर्षक के तहत दिखाई देगा "विगत के नमूने." प्रत्येक रन या नमूना संसाधित सेट एक तारीख के साथ लेबल फ़ोल्डर में रखा जाएगा. इन "नाम बदलें" बटन पर क्लिक करके किया जा सकता है लेबल.
- फ़ोल्डर पर क्लिक नमूनों की एक सूची लाएगा. उन है कि लाल कर रहे हैं विफल रहे हैं, उन है कि हरा कर रहे हैं पारित किया है. एक विशिष्ट नमूना और "देखें" बटन पर क्लिक करके, आप अनुक्रम की समीक्षा कर रहे हैं. पृष्ठ के दाईं ओर पर निर्देशों का पालन करने के लिए throu नेविगेटgh अनुक्रम.
* नोट: इस विधि के लिए, यह जो याद से गुजारें (हरे रंग में दिखाया गया है) स्वचालित रूप से मैनुअल हस्तक्षेप के बिना, दृश्यों का निर्यात करने के लिए स्वीकार्य है. - यदि आप परिणामों से संतुष्ट हैं आप क्लिक करके दृश्यों गुजर डाउनलोड करने के लिए चुन सकते हैं "डाउनलोड करें." फ़ाइलें एक ज़िपित फ़ोल्डर में डाउनलोड किया जाएगा.
* नोट: "सेटिंग्स" के तहत आप फ़ाइल प्रकार सहित डाउनलोड और ईमेल विकल्प, का चयन कर सकते हैं. - स्वच्छ तीन प्रतियों दृश्यों का उत्पादन करने में असफल रहने के नमूने निकालने से तीन प्रतियों में reamplified होना चाहिए. यदि RePCR एक साफ अनुक्रम प्रदान करने में विफल रहता है, 2 अनुक्रम की एक न्यूनतम tropism निष्कर्ष में उपयोग के लिए स्वीकार्य है.
9. जनसंख्या आधारित Geno2pheno एलगोरिदम सह रिसेप्टर का उपयोग अनुक्रमण द्वारा उत्पन्न अनुक्रम से वायरल tropism inferring.
- Http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php अनुक्रम: निम्न URL पर geno2pheno coreceptor सेवा के माध्यम से चलाया जा सकता है.
- अपलोड करने के लिए नमूने देखा फिट के रूप में लेबल किया जा सकता है. महत्व की स्थापना के मेनू ड्रॉप डाउन से "अनुकूलित cutoffs से नैदानिक डेटा के विश्लेषण के आधार पर प्रेरित (2% और 5.75% fpr)" का चयन करें
- अपलोड करने के लिए या विश्लेषण के लिए एक अनुक्रम चिपकाने के लिए चुनें, fasta फाइलें स्वीकार्य हैं.
- geno2pheno fpr निम्नानुसार व्याख्या किया जा सकता है: G2P fpr> 5.75 R5 उपयोग वायरल जनसंख्या का प्रतिनिधि है, CCR5 गरम जवाब की संभावना G2P fpr <5.75 गैर-R5 वायरल जनसंख्या का प्रतिनिधि है, CCR5 गरम का जवाब की संभावना नहीं है. G2P 2 <बहुत CCR5 विरोधी किसी भी प्रतिक्रिया की संभावना नहीं है. यदि एक नमूना से तीन दृश्यों में से किसी एक के लिए गैर-R5 inferred किया है, रोगी को एक CCR5-प्रतिपक्षी का जवाब की संभावना नहीं है.
10. प्रतिनिधि परिणाम
जब प्रोटोकॉल सही ढंग से किया जाता है एक 2 या 3 सफलतापूर्वक अनुक्रम प्रत्येक नमूना के लिए replicates उम्मीद करनी चाहिए. नमूने के बगल चलाने के नकारात्मक शाही सेना के कोई संकेत नहीं होना चाहिए. "पास" दृश्यों के बहुमत याद द्वारा basecalling चाहिए.
समुदाय वायरल आबादी के भीतर R5 और गैर-R5 के वितरण के आधार पर, बेतरतीब ढंग से चुनी रोगी के नमूने के बहुमत वायरस R5 उपयोग करने के लिए उम्मीद होगी. इसलिए जब तक इस परियोजना के डिजाइन अन्यथा सुझाव देना चाहूँगा, एक गैर-R5 नमूनों की तुलना में अधिक R5 उम्मीद करनी चाहिए.
तालिका 1.) अभिकर्मक एक कदम RT-पीसीआर और बी) thermocycler RT-पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए बाहर ले जाने के लिए आवश्यक कार्यक्रम की एक प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक मात्रा.
ए)
अभिकर्मक | वॉल्यूम (μL) (1X प्रतिक्रिया) |
| DEPC पानी का इलाज | 10.56 |
| 2x प्रतिक्रिया बफर | 20 |
| 50% sucrose और 0.04% की bromophenol नीले मिश्रण | 4 |
| अग्रेषित SQV3F1 प्राइमर | 0.32 |
| रिवर्स CO602 प्राइमर | 0.32 |
| एनजाइम - सुपरस्क्रिप्ट III प्लेटिनम Taq डीएनए पोलीमरेज़ के साथ एक चरण प्रणाली RT-पीसीआर | 0.8 |
| कुल | 36 |
* ध्यान दें:
SQV3F1 प्राइमर अनुक्रम: 5 'भूमिकाः सीसीए ATT सीसीसी एटीए कैट जैसे TGT 3'
CO602 प्राइमर अनुक्रम: 5 'जीसीसी कैट AGT GCT टीसीसी TGC TGC टीसीसी CAA GAA 3 सीसी'
बी)
| चक्रों की संख्या | समय | तापमान |
| 1 | 30minutes | 52 ° C |
| 1 | 2minutes | 94 ° C |
| 40 | 15seconds | 94 ° C |
| 30seconds | 55 ° C | |
| 1.5minutes | 68 ° C | |
| 1 | 5minutes | 68 ° C |
टेबल 2.) अभिकर्मक 1 दूसरे दौर पीसीआर की प्रतिक्रिया और बी) thermocycler आवश्यक कार्यक्रम के लिए बाहर ले दूसरे दौर पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक मात्रा .
ए)
अभिकर्मक | वॉल्यूम (μL) (1X प्रतिक्रिया) |
| DEPC पानी का इलाज | 13.45 |
| 60% sucrose, 0.08% cresol लाल मिश्रण | 2 |
| Roche hifi प्रणाली बफर 2 | 2 |
MgCl | 0.8 | |
| dNTP | 0.16 |
| अग्रेषित SQV3F2 प्राइमर | 0.15 |
| रिवर्स प्राइमर CD4R | 0.15 |
| HiFi एंजाइम का विस्तार | 0.29 |
| कुल | 19 |
* ध्यान दें:
SQV3F2 प्राइमर अनुक्रम: 5 'TGT जीसीसी सीसीए GCT 3 एटी GGT TTT GCG'
CD4R प्राइमर अनुक्रम: 5 'जैसे AAT TCA सीटीटी सीटीसी CAA TTG टीसीसी 3'
बी)
चक्रों की संख्या | समय | तापमान |
| 1 | 2minutes | 94 ° C |
| 35 | 15seconds | 94 ° C |
| 30seconds | 55 ° C | |
| 1minute | 72 ° C | |
| 1 | 7minutes | 72 ° C |
टेबल 3.) अभिकर्मक अनुक्रमण 1 की प्रतिक्रिया और बी) thermocycler आवश्यक कार्यक्रम अनुक्रमण प्रतिक्रिया के लिए बाहर ले जाने के लिए आवश्यक मात्रा.
ए)
| अभिकर्मक | वॉल्यूम (μL) (1X प्रतिक्रिया) |
| BigDye | 0.3 |
| BigDye बफर | 2.1 |
| भजन की पुस्तक फॉरवर्ड V3FO2F SQV3R1 रिवर्स | 2.6 |
| कुल | 5.0 |
* नोट: प्राइमरों गठबंधन नहीं, एक अलग मिश्रण प्रत्येक प्राइमर के लिए तैयार होना चाहिए
V3O2F प्राइमर अनुक्रम: 5 'AAT जीटीसी AGY एसीए GTA CAA TGT एसीए 3 सी'
SQV3R1 प्राइमर अनुक्रम: 5 'GAA एएए टीटीसी CCT टीसीसी एसीए ATT 3 एएए'
बी)
चक्रों की संख्या | समय | तापमान |
| 25 | 10seconds | 96 ° C |
| 5seconds | 50 ° C | |
| 55seconds | 60 डिग्री सेंटीग्रेड |
Discussion
यहाँ प्रस्तुत विधि एक मानक अनुक्रमण विधि tropism परीक्षण करने के लिए लागू है. एचआईवी लिफाफा V3 पाश वायरल tropism भविष्यवाणी अनुक्रमण के नैदानिक आवेदन किया है जब तक देर से सीमित किया गया है. इस विधि maraviroc (ViiV हेल्थकेयर) नैदानिक परीक्षणों के पूर्वव्यापी विश्लेषण में दिखाया गया है, कम से कम समान रूप से अन्य मान्य नैदानिक इस्तेमाल assays की तुलना में वायरल tropism भविष्यवाणी करने में सक्षम है.
Tropism भविष्यवाणी के लिए V3 पाश की genotypic विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए कई लाभ हैं. और सबसे पहले, इस कार्यविधि का परिचालन अनुक्रमण उपकरण के साथ किसी भी सुविधा पर प्रदर्शन किया जा सकता है, बहुत पहुंच बढ़ाने और tropism परीक्षण के बदलाव का समय कम करने के. इसकी तुलना में, प्ररूपी बढ़ी संवेदनशीलता Trofile (एस्टा) परख (गुंथे बायोसाइंसेज), जो tropism परीक्षण के लिए सोने के मानक के रूप में सेवा की है दक्षिणी कैलिफोर्निया में एक केंद्र पर किया जाता है. अतिरिक्त लाभ कम प्रारंभिक सामग्री और 500copies/mL की एक न्यूनतम आवश्यक प्लाज्मा वायरल लोड की आवश्यकता शामिल हैं. के रूप में अच्छी तरह से, genotypic परख चलाने की परिचालन लागत एक प्ररूपी परख के उन लोगों की तुलना में अपेक्षाकृत कम हैं. विशेष रूप में याद सॉफ्टवेयर का उपयोग पुस्तिका अनुक्रम समीक्षा, जो जीनोटाइप के विश्लेषण के एक श्रम गहन हिस्सा हो जाता है के लिए आवश्यकता eliminates.
यहाँ प्रस्तुत पद्धति काफी सरल है, कोई विशेष महत्व में एक और outweighing कदम के साथ, है. हम तीन प्रतियों में सुझाव है पीसीआर और अनुक्रमण चलाने के लिए एक नमूना वायरल जनसंख्या के भीतर अल्पसंख्यक प्रजातियों पर कब्जा करने की मुश्किलों में वृद्धि. Replicates तीन से अधिक से अधिक किया जा सकता है, लेकिन हमने पाया है दोनों कुशल और विश्वसनीय हो triplicates. हम भी एक चरण रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस पीसीआर (Qiagen) किट, जो जबकि उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता बनाए रखने के लिए एक ही प्रतिक्रिया में दोनों RT-पीसीआर और पहले दौर पीसीआर प्रदर्शन का उपयोग कर सुझाव देते हैं.
Disclosures
पी. रिचर्ड Harrigan ब्याज की ViiV हेल्थकेयर, Virco, मर्क, Abbott, और क्वेस्ट के साथ संघर्ष है. इस वीडियो लेख ViiV हेल्थकेयर द्वारा प्रायोजित है.
Acknowledgments
इस परख के विकास Viiv हेल्थकेयर और स्वास्थ्य अनुसंधान (CIHR) की कनाडा के संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया और डा. Harrigan के लिए नैदानिक विषाणु विज्ञान में एक कुर्सी / ग्लैक्सोस्मिथक्लाइन CIHR के माध्यम से.
फाइजर और ViiV हेल्थकेयर द्वारा प्रदान का समर्थन करें.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction using NucliSens easyMAG version 1.0 | |||
| NucliSens easyMAG Magnetic Silica | bioMerieux | cat. # 280133 | (48 x 0.6 ml) |
| NucliSens easyMAG Lysis Buffer | bioMerieux | cat. # 280134 | (4 x 1000 ml) |
| NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1 | bioMerieux | cat. # 280130 | (4 x 1000 ml) |
| NucliSens easyMAG Extraction Buffer 2 | bioMerieux | cat. # 280131 | (4 x 1000 ml) |
| NucliSens easyMAG Extraction Buffer 3 | bioMerieux | cat. # 280132 | (4 x 1000 ml) |
| NucliSens easyMAG version 1.0 | bioMerieux | ||
| Class II A2 biological safety cabinet | |||
| One-Step Reverse Transcriptase PCR and Second Round PCR | |||
| DEPC-treated water | Ambion | cat. # 9922 | |
| SuperScrip III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq High Fidelty | Invitrogen | cat#12574-035 | Kit components used: - SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelty Enzyme Mix - 2X Reaction Mix (a buffer containing 0.4mM of each dNTP, 2.4mM MgSO4) |
| Expand High Fidelity PCR System | Roche Group | cat. # 1 759 078 | Kit components used:- Expand High Fidelity Buffer 10X conc. with 15 mM MgCl2 (lids labelled 2)- Expand HF PCR Enzyme Mix (3.5U/μl)- MgCl2 Stock Solution (25mM) (lids labelled 4) |
| dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP | Roche Group | cat. # 11969064001 | (100 mM) |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | cat. # S0389-500G | |
| Bromophenol blue sodium salt | Sigma-Aldrich | cat.# B5525 | |
| Cresol Red | Sigma-Aldrich | cat.# 114472-5G | indicator grade |
| Thermocycler | |||
| Gel Electrophoresis | |||
| 50X TAE buffer | Invitrogen | cat. # 24710030 | (1000 ml) |
| SYBR Safe DNA gel stain | Invitrogen | cat. # S33102 | |
| Agarose (ultra pure) | Invitrogen | cat. # 15510-027 | |
| E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder | Invitrogen | cat. # 12373-031 | |
| Reagent Grade Type II water | |||
| Gel apparatus | |||
| Sequencing | |||
| ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit | Applied Biosciences | cat. # 4337458 | (25000 reactions) |
| Hi-Di Formamide | Applied Biosciences | cat. # 4311320 | |
| Sodium Acetate (NaOAc) | Sigma-Aldrich | cat. # S-2889 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | Cat.# 03690-100ML | 0.5M, pH=8.0 |
| TRIZMA Hydrochloride Buffer Solution | Sigma-Aldrich | cat. # T-2819 | 1 M, pH 9.0 |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | cat. # M-1028 | 1 M |
| 95% Ethanol | |||
| Running Buffer (10X) with EDTA | Applied Biosystems | cat. # 4335613 | 500 mL |
| Polymer Pop-7 (25mL) Or Polymer Pop-7 (10mL) | Applied Biosystems | cat. # 44363929 or cat. # 4352759 | |
| 3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Sequencing Standard Kit | Applied Biosciences | Cat# 4336943 | |
| Thermocycler | |||
| Centrifuge with plate holders | |||
| 3730xl DNA Analyzer | Applied Biosciences |
References
- Feng, Y., Broder, C. C., Kennedy, P. E. HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven transmembrane, G protein-coupled receptor. Science. 272, 872-877 (1996).
- Dragic, T., Litwin, V., Allaway, G. P. HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5. Nature. 381, 667-673 (1996).
- Dorr, P., Westby, M., Dobbs, S. Maraviroc (UK-427,857), a potent, orally bioavailable, and selective small-molecule inhibitor of chemokine receptor CCR5 with broad-spectrum anti-human immunodeficiency virus type 1 activity. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4721-4732 (2005).
- Gulick, R. M., Lalezari, J., Goodrich, J. Maraviroc for previously treated patients with R5 HIV-1 infection. N. Engl. J. Med. 359, 1429-1441 (2008).
- Cooper, D. A., Heera, J., Goodrich, J. Maraviroc versus efavirenz, both in combination with zidovudine/lamivudine, for the treatment of antiretroviral-naíve subjects with CCR5-tropic HIV-1. J. Infect. Dis. 201, 803-813 (2010).
- Low, A. J., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. Trofile HIV co-receptor usage assay. Expert Opin. Med. Diagnostics. 3, 181-191 (2000).
- Sing, T., Low, A. J., Beerenwinkel, N. Predicting HIV co-receptor usage based on genetic and clinical covariates. Antiviral Ther. 12, 1097-1106 (2007).
- Screening for HIV tropism using population-based V3 genotypic analysis: a retrospective virological outcome analysis using stored plasma screening samples from MOTIVATE-1. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 5th International AIDS Society Conference, 2009 19-22 July, Cape Town, South Africa, , (2009).
- Optimization of clinically relevant cut-points for the determination of HIV co-receptor usage to predict maraviroc responses in treatment experienced (TE) patients using population V3 genotyping. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 12th European AIDS Conference, 2009 11-14 Nov, Cologne, Germany, , (2009).
- Optimization of clinically relevant cutoffs for determining HIV co-receptor use by population and "deep" sequencing methods. Swenson, L. C., McGovern, R. A. 47th Annual Meeting of the Infectious Diseases Society of America, 2009 Oct 29 - Nov 1, Philadelphia, PA, USA, , (2009).
- Phenotypic screening for HIV tropism versus both population-based and "deep" sequencing. Swenson, L., McGovern, R., Dong, W. 49th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2009 12-15 Sept, San Francisco, CA, , (2009).
- Swenson, L. C., Moores, A., Low, A. J., Thielen, A., Dong, W., Woods, C., Jensen, M. A., Wynhoven, B., Chan, D., Glascock, C., Harrigan, P. R. Improved Detection of CXCR4-Using HIV by V3 Genotyping: Application of Population-based and 'Deep' Sequencing to Plasma RNA and Proviral DNA. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 54, 506-510 (2010).
- Swenson, L. C., Boehme, R., Thielen, A., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. Genotypic determination of HIV-1 tropism in the clinical setting. HIV Therapy. 4, 293-303 (2010).
