Summary
HIV tropism는 바이러스 봉투의 V3 지역에서 유추하실 수 있습니다. V3는 PCR은 RT - PCR 중첩, 합성을 사용하여 세중의에 증폭하고, bioinformatic 소프트웨어를 사용하여 해석됩니다. 낮은 g2P 점수 1 개 이상의 시퀀스 (S)와 함께 샘플이 아닌 R5 바이러스로 분류됩니다.
Abstract
배경 : 이전 HIV 치료에 CCR5 - 길항제 클래스에서 마약을받을하기 위해 환자 자신의 바이러스성 인구가 대안 coreceptor를 휴대 전화 항목에 대한 CCR5 coreceptor을 사용하지 않는 것 확인하는 HIV의 tropism 테스트를 받아야합니다. tropism 테스트하는 한 가지 방법은 coreceptor와 상호 작용하는 HIV 봉투의 V3 지역의 순서를 검사하는 것입니다.
방법 : 바이러스성 RNA는 혈장에서 추출한 것입니다. V3 지역은 중첩된 리버스 transcriptase - PCR로 증폭 세중의에있다. amplifications 그런 다음 합성 및 소프트웨어, RE_Call를 사용하여 분석하고 있습니다. 시퀀스는 다음 V3 지역에서 바이러스 tropism을 추론하기 위해 geno2pheno 같은 bioinformatic 알고리즘에 제출합니다. 시퀀스들은 geno2pheno 거짓 긍정적인 속도 아래 5.75 %를 일인 경우는 비 R5으로 유추됩니다. 샘플에서 세 시퀀스 중 하나가 아닌 R5로 유추하는 경우, 환자는 CCR5 - 길항제에 응답하지 않을 수 있습니다.
Protocol
절차 :
1. 추출 :
혈장 중 적어도 500 μL이 genotypic HIV의 tropism 시험 샘플 입력으로 필요합니다.
- easyMAG (bioMérieux) 자동 추출기 또는 실험실의 선호하는 추출 방법을 사용하여 플라즈마의 500μL에서 HIV RNA를 추출합니다.
60 μL 나누어지는에 압축을 푼 바이러스 RNA를 Elute. -20 섭씨도 또는 즉시 추출 후 Transcriptase - PCR 거꾸로 시작에 보관하십시오.
2. RT - PCR :
샘플 추출물의 4μL는 중첩된 RT - PCR 방법을 사용하여 세중의에서 증폭됩니다. RT - PCR 반응은 PCR - 깨끗한 방에 설정해야합니다.
- 증폭하는 샘플의 수를에 필요한 시약의 양을 계산합니다. 한 반응을위한 시약 볼륨을 나타내는 아래의 테이블을 따르십시오.
원 - 스텝 RT PCR의 1 반응에 필요한 표 1. 시약 볼륨.시약 볼륨 (μL)
(1X 반응)DEPC 물을 치료 10.56 2X 반응 버퍼 20 50 %의 자당과 0.04 % bromophenol 블루 믹스 4 HIV V3 지역을 대상으로 전달 입문서 0.32 역방향 프라이머 0.32 효소 - 어깨 III 플래티넘 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소와 함께 한 스텝 RT - PCR 시스템 0.8 합계 36
각 단계 RT - PCR 반응은 다음과 제조법이 필요합니다 :- 10.56 μL DEPC 처리된 물
- 2X 반응 완충액 20 μL
- 50 %의 자당과 0.04 % bromophenol 블루 믹스 4μL
- HIV V3 지역을 타겟팅 앞으로 뇌관의 0.32 μL
- 반대 뇌관의 0.32 μL
- 효소 0.8 μL
- 빈 옆에 연속 샘플 추출 튜브 최대 라인, 96 자 PCR 플레이트를 표시.
- 리피터의 피펫을 사용하여 각 샘플 추출을위한 준비 3 우물이있다는 것을 같은, PCR 플레이트의 각 웰 샘플 믹스 36 μL를 추가합니다.
* 참고 :이 절차는 바이러스 인구의 적절한 샘플링을 보장하기 위해, 최소한 세중의 수행되어야합니다. - 8 채널 멀티채널 피펫을 사용하여 자사의 세 우물의 각 샘플 추출물의 4μL를 추가합니다. 각 또한 사이의 조언을 변경합니다.
- PCR 스트립 모자와 우물을 커버.
- 전송 comlete되면 thermocycler에서 PCR 접시를 놓습니다. 다음 프로그램을 실행하는 thermocycler 설정 : 52시 30 분 ° 94에서 C 이분 °의 C - 40 사이클 (94에 15 초간 ° C, 55 30초 ° C와 68 1.5 분 ° C) 오분 68시 ° C
- thermocycler에서 PCR 플레이트를 제거합니다. 플레이트는 상온에서 저장할 수 있습니다.
두번째 라운드 PCR 단계로 진행
3. 두 번째 라운드 PCR :
- 증폭하는 샘플의 수를에 필요한 시약의 양을 계산합니다. 한 반응을위한 시약 볼륨을 나타내는 아래의 테이블을 따르십시오.
표 2. 시약 볼륨이 2 차 라운드 PCR 반응을 위해 1 필요합니다.시약 볼륨 (μL)
(1X 반응)DEPC 물을 치료 13.45 60 % 자당, 0.08 % 크레졸 레드 믹스 2 로체 고음질 시스템 버퍼 2 2 MgCl 2 0.8 dNTP 0.16 앞으로 PCR 프라이머 0.15 역방향 PCR 프라이머 0.15 고음질 효소를 확장 0.29 합계 19
각 두번째 라운드 PCR 반응은 다음과 제조법이 필요합니다- 13.45 μL DEPC 처리된 물
- 2 μL 60 % 자당, 0.08 % 크레졸 레드 믹스
- 로체 고음질 시스템 버퍼 2 개 중 2 μL
- 25 MM MgCl 2 0.8 μL
- 25 MM의 dNTP의 0.16 μL
- 0.15 μL 순방향 및 역방향 PCR primers 모두
- 0.29 μL 확장 고음질 효소
- 게시물 증폭 룸에서 8 채널 멀티채널 피펫 사용하여 두 번째 라운드 PCR 버퍼로 RT - PCR 템플릿 1 μL를 전송합니다. 각 또한 사이의 조언을 변경합니다.
- PCR 스트립 모자와 우물을 커버하고 thermocycler에 두 번째 라운드 PCR 플레이트를 전송할 수 있습니다.
- 다음 프로그램을 실행하는 thermocycler 설정 : 94시 2 분 ° C의 35주기 (94에 15 초간 ° C, 55 30초 ° C, 72시 일분 ° C) 72시 7분 ° C
- 온도가 25에 반환 후 thermocycler에서 플레이트를 제거 ° C.
4. 젤 전기 영동 :
V3 지역이 성공적으로 증폭되었는지 확인하기 위해 젤 전기 영동 단계가 수행됩니다.
- 1X 태 버퍼의 50 ML의 아가로 오스 분말 0.8 g와 아가로 오스 겔을 준비합니다. 휘저어와 아가로 오스가 완전히 해소 될 때까지 ~ 1 분 위해 전자 레인지에 녹기.
- SYBR 안전 얼룩 젤과 섞어 소용돌이 6 μL를 추가합니다.
- 겔 트레이에 솔루션을 붓고, 그리고 PCR 우물의 수를 수용하는 충분한 젤 빗를 추가합니다.
- 겔 건조되면, 빗을 제거하고 겔 장치에서 젤 배치, 그건 완전히 1X 태 버퍼에 빠져들되어 있는지 확인하고.
- 10 μL 멀티채널 피펫을 사용하여 겔에서 자체 물론 각 PCR 샘플의 8μL를 추가합니다. amplifications가 젤 추가되었습니다 후에 PCR 플레이트를 커버.
- 행 당 적어도 하나의 DNA 사다리 6 μL를 추가합니다.
- 밴드가 젤을 실행하지 않도록하고, ~ 10 분 ~ 100V에서 젤 장치를 실행합니다.
- UV 트랜스 - 조명기에 젤 놓고 젤의 사진을 찍을.
PCR - 증폭 DNA와 웰스는 성공적인 증폭을 나타내는, 빛이 나타납니다. - 세 amplifications 성공했다 모든 샘플을 적어 둡니다. 필요한 경우, 3 amplifications 미만 분들 샘플 RT - PCR을 반복합니다.
순서로 진행
5. 시퀀싱 :
cDNA 증폭 바이러스 발생 후, 샘플은 시퀀싱 준비하실 수 있습니다. 순서 반응은 이후 증폭 룸에서 자리를 차지할 것입니다.
- 냉장고에서 냉동고 및 시퀀싱 primers에서 BigDye를 제거합니다. 일시간보다 더 이상을 위해, 상온에서 해동 BigDye하자.
- 실행되도록 샘플의 숫자에 필요한 시약의 양을 계산합니다. 한 반응을위한 시약 볼륨을 나타내는 아래의 테이블을 따르십시오.
표 3. 시약 볼륨 시퀀싱 1 반응을 위해 필요합니다.시약 볼륨 (μL)
(1X 반응)BigDye 0.3 BigDye 버퍼 2.1 뇌관 2.6 합계 5.0
* 참고 : 각 입문서에 대해 별도의 믹스를 준비합니다.
** 참고 : 시퀀싱 반응에 사용되는 BigDye 버퍼는 다음과 같이 준비하실 수 있습니다 믹스 Trizma 염산염 버퍼 용액 (1 M) (pH9.0)과 마그네슘 염화물의 0.125 ML (1 M)의 17.5 ML. 시약 등급 물 100 ML에 최종 볼륨을 가져와. 이것은 2-8 ° C.에 보관해야 - 3.3 계산을 사용하여 시퀀싱 반응을 더 이상 5 이상의 초 각각의 프라이머와 소용돌이를위한 믹스를 준비합니다. 0.2mL 스트립 튜브로 나누어지는.
- 멀티채널 피펫을 사용하여 적절한 판 우물에 반응 믹스를 배열의 나누어지는 5 μL. Kimwipe로 시퀀싱 반응 믹스가 포함된 플레이트 (S) 커버와 따로 설정할 수 있습니다.
- 나머지 PCR 제품에 백스터 멸균 물 180 μL를 추가하여 증폭 PCR 제품의 1시 15분 희석을 준비합니다.
- 적절한 판 우물의 바닥에 희석 샘플 피펫 1 μL는 피펫 팁을 변경합니다.
- 샘플 전송이 완료되면, 1 초 동안 스트립 모자와 소용돌이와 함께 접시를 밀봉
- 원심 분리기에서 접시를 놓습니다. 회전 속도가 145g에 도달 145g에 속도를 설정 스핀을 중지합니다.
- 다음 프로그램으로 설정 thermocycler (S)에있는 접시를 장소 : 25주기 (10 초 @ 96 ° C, 5 초 @ 50 ° C, 55 초 @ 60 ° C...) 볼륨이 있어야 할 최소한 6μL . 주기는 약 1.2 시간 정도 소요됩니다.
석출로 이동
6. 강수량 :
에 "청소"시퀀싱 반응 다음과 같은 바이러스 cDNA가 95 %의 에탄올을 사용하여 에탄올 침전을 수행합니다.
- thermocycler에서 접시를 검색하고 이후 ampli 가져다fication 룸.
- 스트립 뚜껑을 제거하고 깨끗한 종이 타월이나 Kimwipe에 순서를 배치합니다.
- 물론 각 시료의 측면에 근무 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 아세트산 나트륨 솔루션 피펫 4μL. 부드럽게 때문에 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 나트륨 솔루션은 우물의 바닥에 떨어지는 것을 접시를 누릅니다. 그들은 잘 하단의 샘플을 접촉하지 않는 같은 팁을 너무 오래 사용할 수 있습니다.
* 참고 : 작업 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 아세트산 나트륨 솔루션은 다음과 같이 준비하실 수 있습니다- 시약 등급 물 1 L에 아세트산 나트륨의 246.1 g을 용해하여 3M의 아세트산 나트륨을 준비합니다. 0.45 마이크로 필터를 통해 솔루션을 필터 50 ML aliquots를 준비합니다.
- 아세트산 나트륨 (3 M)과 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션 (500 ㎜) 산도 8.0의 같은 볼륨을 혼합하여 주식 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 아세트산 나트륨 솔루션 (1.5 M NaOAc, 250 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))를 준비합니다.
- 시약 등급 물 (10 ML + 30 ML)의 세 부분과 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 아세트산 나트륨 솔루션 한개의 주식을 혼합하여 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 아세트산 나트륨 솔루션을 작업을 준비합니다.
- 샘플 우물의 반대편에로 및 냉장 95 % 에탄올의 피펫 40μL는 스트립 뚜껑을 교체하십시오.
- 뚜껑과 와동 10 초 동안 접시를 밀봉합니다. 모든 거품을 이동시키다하는 접시를 누릅니다.
- 30 분 2 시간 최대 최소 -20 ° C에서 냉동실에 접시를 놓습니다.
- 강수량이 발생되면, 3,700 rpm으로 20 분간 원심 분리기에 냉장고와 장소에서 접시를 제거합니다.
- 이 변성되기 전에 해동 수 있도록 냉장고에서 하이 디 포름 아미드 (응용 Biosystems)의 적절한 금액을 제거합니다.
- 접시를 회전 후 제거하고 스트립 모자를 폐기하십시오. 폐기물 컨테이너 (예 : 쓰레기 빈)와 가만히 따르다 뜨는 동안 접시 반전. 종이 타월에 거꾸로 접시 모래 바닥으로 남아 뜨는 제거.
- 접시의 표면에 종이 타월 및 장소 2 시트를 접으십시오. 그것이 145g에 도달하면 스핀을 중지, 145g에서 원심과 스핀의 플레이트 있는거야를 놓습니다.
- 원심 분리기에서 접시를 제거하고 우물이 비어 반드시 확인하십시오. 우물에 차게 95 % 에탄올의 피펫 155μL.
- 폐기물 컨테이너와 종이 타월에 얼룩에 뜨는를 버리고 4.10에 원심 분리를 반복합니다.
- 원심 분리기에서 플레이트를 제거시 사용하는 종이 타월을 버리고 접시에 남아있는 에탄올이 증발 수 있도록 2-5분 위해 얼굴을 일어하자.
denaturing로 이동
7. Denaturing
- 멀티채널 피펫 충분히 큰 용기에 해동 HiDi의 포름 아미드 및 가만히 따르다를 검색
* 참고 : 같은 6.7b에 명시된 바와 같이 사전 aliquoted 조치를 사용하는 경우 하나의 튜브가 실행되도록 각 96 - 웰 플레이트가 필요합니다. - 멀티채널 피펫을 사용하여 비어있는 것을 포함, 접시에있는 모든 우물에 HiDi의 포름 아미드의 10μL를 배포합니다.
- 인감 양식에 septa 매트와 접시를 커버.
- 2 분 동안 90 ° C에서 thermocycler에서 접시를 놓습니다.
- 변성 다음, 시퀀서에로드 다음 접시 홀더에서 접시를 놓습니다. 준비 순서 배치를 업로드합니다. 플레이트는 최대 시퀀스 실행을 수행하기 전에 일주일위한 -20 ° C에서 보관하실 수 있습니다.
8. 기본 전화 소프트웨어를 사용하여 결과 데이터를 분석.
- 회수를 사용하면 어떠한 인간의 개입과 전화 자동 기지를 수행, 하나의 뇌관 보험이 허용됩니다. 회수는 다음 URL에서 찾을 수있는 사용자 지정 기본 전화 소프트웨어 : http://pssm.cfenet.ubc.ca/
* 참고 : 계정에 로그인이 필요합니다. 계정을 설정하려면 로그인 페이지에서 "등록"버튼을 클릭하십시오. 일단 계정은 업로드 페이지에 액세스할 수 있습니다 만들었습니다. - 로그인하면 업로드에 대한 예제 파일을 선택할 수 있습니다. 최대 20MB의 업로드로 업로드하여 원시 시퀀스 데이터를 찾을 수있는 검색 옵션을 사용합니다.
* 참고 :... 웹 리콜은 우편으로 ABI와 SCF 파일과 같은 데이터 파일을 받아, 타르 또는 tar.gz 파일 - 업로드할 파일이 선택되고 나면, 참조 시퀀스를 선택합니다. 이 경우에는 참조 시퀀스로 설정해야합니다 'V3. 이제 클릭하여 준비 "프로세스 데이터를."
- 가공 데이터는 제목 아래에있는 페이지의 오른쪽에 나타납니다 "과거 샘플." 처리 각 실행하거나 샘플 세트가 날짜와 함께라는 폴더에 배치됩니다. 이들은 "이름 바꾸기"버튼을 클릭하여 다시 표시하실 수 있습니다.
- 폴더를 클릭하면 샘플의 목록을 나타납니다. 빨간색하는 사람들은 실패, 녹색으로 이들이 지났죠. 특정 샘플과 "보기"버튼을 클릭하면, 당신은 순서를 검토할 수 있습니다. throu로 이동 페이지의 오른쪽에있는 지침을 따르십시오GH 순서.
* 참고 :이 방법을 위해, 그것은 수동 개입없이 자동으로 (녹색 표시) 리콜을 전달 시퀀스를 수출하는 허용됩니다. - 당신이 결과에 만족하는 경우를 클릭하여 전달 시퀀스를 다운로드하도록 선택할 수 있습니다 "다운로드합니다." 파일은 압축 폴더에 다운로드됩니다.
* 참고 : "설정"아래 당신이 파일 형식을 포함하여 다운로드하고 이메일 옵션을 선택할 수 있습니다. - 깨끗한 세중의 시퀀스를 생성 실패 샘플 추출에서 세중의에 reamplified해야합니다. RePCR는 깨끗한 순서를 제공하지 못하면, 2 시퀀스의 최소 tropism의 추론에 사용하기 위해 허용됩니다.
9. Geno2pheno 공동 수용체 알고리즘을 사용하는 인구 기반 시퀀싱에 의해 생성된 시퀀스에서 바이러스성 Tropism을 Inferring.
- http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php : 시퀀스는 다음 URL에서 geno2pheno coreceptor 서비스를 통해 실행할 수 있습니다.
- 업로드 샘플 볼 적합으로 표시 수 있습니다. 중요한 설정의 드롭 다운 메뉴에서 '(2 %와 5.75 %의 FPR) 동기에서 임상 데이터의 분석을 바탕으로 최적의 단절 "을 선택합니다
- 분석을 위해 순서를 업로드하거나 붙여넣을 선택 fasta 파일은 가능합니다.
- geno2pheno FPR은 다음과 같이 해석될 수 있습니다 : G2P FPR은> 5.75는 R5 - 사용하는 바이러스 인구의 대표, CCR5의 antagonists에 응답할 가능성이 G2P FPR <5.75이 아닌 R5 바이러스 인구의 대표, CCR5의 antagonists에 응답하지 않을 수. G2P <2 CCR5의 antagonists 어떤 반응을 매우 않을 수 있습니다. 샘플에서 세 시퀀스 중 하나가 아닌 R5로 유추하는 경우, 환자는 CCR5 - 길항제에 응답할 가능성이 없습니다.
10. 대표 결과
프로토콜이 올바르게 수행되면 하나가 성공적으로 순서 2 또는 3 각 샘플에 대한 복제 기대한다. 샘플과 함께 실행 제외는 RNA의 징후가 없습니다. 시퀀스의 대부분은 회수하여 basecalling "통과"해야합니다.
지역 사회 내에서 바이러스 인구 R5 및 비 - R5의 분포에 따라 무작위로 선택된 환자 샘플의 대부분은 바이러스를 R5 - 이용 것으로 예상됩니다. 프로젝트 디자인은 별도로 제안 따라서 않는 한, 하나는 비 R5 샘플보다 R5를 기대한다.
표 1.) 한 걸음 더 RT - PCR 및 RT - PCR 반응을 수행하는 데 필요한 B) thermocycler 프로그램의 한 반응에 필요한 시약 볼륨.
A)
시약 | 볼륨 (μL) (1X 반응) |
| DEPC 물을 치료 | 10.56 |
| 2X 반응 버퍼 | 20 |
| 50 %의 자당과 0.04 % bromophenol 블루 믹스 | 4 |
| 앞으로 프라이머 SQV3F1 | 0.32 |
| 프라이머 CO602를 역방향 | 0.32 |
| 효소 - 어깨 III 플래티넘 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소와 함께 한 스텝 RT - PCR 시스템 | 0.8 |
| 합계 | 36 |
* 참고 :
SQV3F1 프라이머 순서 : 5 '개그 CCA ATT CCC ATA CAT TGT 두드리는 소리 3'
CO602 프라이머 순서 : 5 'CAT GCC AGT GCT TCC TGC TGC TCC CAA GAA CC 3'
B)
| 사이클 번호 | 시간 | 온도 |
| 1 | 삼십분 | 52 ° C |
| 1 | 이분 | 94 ° C |
| 40 | 15초 | 94 ° C |
| 30초 | 55 ° C | |
| 1.5minutes | 68 ° C | |
| 1 | 오분 | 68 ° C |
표 2.) 일초 라운드 PCR의 반응과 두 번째 라운드 PCR 반응을 수행하는 데 필요한 B) thermocycler 프로그램에 필요한 시약 볼륨.
A)
시약 | 볼륨 (μL) (1X 반응) |
| DEPC 물을 치료 | 13.45 |
| 60 % 자당, 0.08 % 크레졸 레드 믹스 | 2 |
| 로체 고음질 시스템 버퍼 2 | 2 |
MgCl | 0.8 | |
| dNTP | 0.16 |
| 앞으로 프라이머 SQV3F2 | 0.15 |
| 역방향 프라이머의 CD4R | 0.15 |
| 고음질 효소를 확장 | 0.29 |
| 합계 | 19 |
* 참고 :
SQV3F2 프라이머 순서 : 5 '3 TGT GCC CCA GCT GGT TTT GCG'
CD4R 프라이머 순서 : 5 '문신 AAT TCA CTT CTC CAA TTG TCC 3'
B)
사이클 번호 | 시간 | 온도 |
| 1 | 이분 | 94 ° C |
| 35 | 15초 | 94 ° C |
| 30초 | 55 ° C | |
| 일분 | 72 ° C | |
| 1 | 7분 | 72 ° C |
표 3.) 1 시퀀싱의 반응 및 시퀀싱 반응을 수행하는 데 필요한 B) thermocycler 프로그램에 필요한 시약 볼륨.
A)
| 시약 | 볼륨 (μL) (1X 반응) |
| BigDye | 0.3 |
| BigDye 버퍼 | 2.1 |
| 뇌관 앞으로 V3FO2F SQV3R1를 역방향 | 2.6 |
| 합계 | 5.0 |
* 참고 : primers를 결합하지 마십시오 별도의 혼합은 각 프라이머 대한 대비를하셔야 할 것입
V3O2F 프라이머 순서 : 5 'AAT GTC GTA CAA ACA AGY TGT ACA C 3'
SQV3R1 프라이머 순서 : 5 'GAA AAA TTC CCT TCC ACA ATT AAA 3'
B)
사이클 번호 | 시간 | 온도 |
| 25 | 10초 | 96 ° C |
| 오초 | 50 ° C | |
| 55초 | 60 ° C |
Discussion
여기서 제시하는 방법은 tropism 테스트에 적용되는 표준 시퀀싱 방식입니다. 늦은 시간까지 제한하고 바이러스 tropism을 예측하는 순서 HIV 봉투 V3 루프의 임상 응용 프로그램이 있습니다. 이 방법은 최소한 임상 사용하는 다른 검증 assays에 비해 바이러스 tropism을 예측하는 동등 수 있도록, maraviroc (바이브 의료) 임상 시험의 회고 분석에 표시하고 있습니다.
tropism 예측에 대한 V3 루프의 genotypic 분석을 수행하기 위해 많은 혜택이 있습니다. 첫번째로 제일 중요 한건,이 절차는 크게 접근을 증가하고 tropism 테스트의 처리 시간을 줄여, 운영 시퀀싱 장비와 모든 시설에서 수행할 수 있습니다. 비교에서, tropism 테스트를위한 황금 표준으로 재직했습니다 phenotypic 향상된 감도 Trofile 분석 (ESTA) (모노그램 Biosciences)는, 남부 캘리포니아에서 한 센터에서 수행됩니다. 추가 혜택이 적은 시작 물질 500copies/mL 최소 요구 플라즈마 바이러스 부하의 요구 사항을 포함합니다. 뿐만 아니라, genotypic 분석을 실행하는 운영 비용은 phenotypic 분석 분들에 비해 상대적으로 낮은 수 있습니다. 특히 리콜 소프트웨어의 사용은 유전자형 분석의 노동 집약적인 부분이 될 경향이 수동으로 순서대로 검토에 대한 요구 사항을 제거합니다.
여기서 제시하는 방법은 중요성에 또 다른 outweighing 특별한 단계로, 매우 간단합니다. 우리는 샘플의 바이러스 인구 내에서 캡처 소수 종족의 확률을 높일 세중의에 PCR 및 시퀀싱을 실행해야합니까. 세 이상의 복제 큰 수행할 수 있으며, 그러나 우리가 찾은이 효과적이고 신뢰할 수있는 모두 수 triplicates. 또한 고감도와 특이성을 유지하면서 같은 반응 RT - PCR과 PCR 첫 라운드를 모두 수행 한 단계 거꾸로 Transcriptase PCR 키트 (Qiagen)를 사용하는 것이 좋습니다.
Disclosures
P. 리차드 해리건은 바이브 의료, Virco, 머크, 애보트, 그리고 퀘스트와 관심의 충돌을했다. 이 동영상 문서는 바이브 의료 후원됩니다.
Acknowledgments
이 분석의 개발은 바이브 의료 및 건강 연구 (CIHR)의 캐나다 연구소에서 박사 해리건에 대한 임상 바이러스학의 GlaxoSmithKline / CIHR 의자 통해 지원되었다.
화이자와 바이브 건강에서 제공하는 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction using NucliSens easyMAG version 1.0 | |||
| NucliSens easyMAG Magnetic Silica | bioMerieux | cat. # 280133 | (48 x 0.6 ml) |
| NucliSens easyMAG Lysis Buffer | bioMerieux | cat. # 280134 | (4 x 1000 ml) |
| NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1 | bioMerieux | cat. # 280130 | (4 x 1000 ml) |
| NucliSens easyMAG Extraction Buffer 2 | bioMerieux | cat. # 280131 | (4 x 1000 ml) |
| NucliSens easyMAG Extraction Buffer 3 | bioMerieux | cat. # 280132 | (4 x 1000 ml) |
| NucliSens easyMAG version 1.0 | bioMerieux | ||
| Class II A2 biological safety cabinet | |||
| One-Step Reverse Transcriptase PCR and Second Round PCR | |||
| DEPC-treated water | Ambion | cat. # 9922 | |
| SuperScrip III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq High Fidelty | Invitrogen | cat#12574-035 | Kit components used: - SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelty Enzyme Mix - 2X Reaction Mix (a buffer containing 0.4mM of each dNTP, 2.4mM MgSO4) |
| Expand High Fidelity PCR System | Roche Group | cat. # 1 759 078 | Kit components used:- Expand High Fidelity Buffer 10X conc. with 15 mM MgCl2 (lids labelled 2)- Expand HF PCR Enzyme Mix (3.5U/μl)- MgCl2 Stock Solution (25mM) (lids labelled 4) |
| dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP | Roche Group | cat. # 11969064001 | (100 mM) |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | cat. # S0389-500G | |
| Bromophenol blue sodium salt | Sigma-Aldrich | cat.# B5525 | |
| Cresol Red | Sigma-Aldrich | cat.# 114472-5G | indicator grade |
| Thermocycler | |||
| Gel Electrophoresis | |||
| 50X TAE buffer | Invitrogen | cat. # 24710030 | (1000 ml) |
| SYBR Safe DNA gel stain | Invitrogen | cat. # S33102 | |
| Agarose (ultra pure) | Invitrogen | cat. # 15510-027 | |
| E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder | Invitrogen | cat. # 12373-031 | |
| Reagent Grade Type II water | |||
| Gel apparatus | |||
| Sequencing | |||
| ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit | Applied Biosciences | cat. # 4337458 | (25000 reactions) |
| Hi-Di Formamide | Applied Biosciences | cat. # 4311320 | |
| Sodium Acetate (NaOAc) | Sigma-Aldrich | cat. # S-2889 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | Cat.# 03690-100ML | 0.5M, pH=8.0 |
| TRIZMA Hydrochloride Buffer Solution | Sigma-Aldrich | cat. # T-2819 | 1 M, pH 9.0 |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | cat. # M-1028 | 1 M |
| 95% Ethanol | |||
| Running Buffer (10X) with EDTA | Applied Biosystems | cat. # 4335613 | 500 mL |
| Polymer Pop-7 (25mL) Or Polymer Pop-7 (10mL) | Applied Biosystems | cat. # 44363929 or cat. # 4352759 | |
| 3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Sequencing Standard Kit | Applied Biosciences | Cat# 4336943 | |
| Thermocycler | |||
| Centrifuge with plate holders | |||
| 3730xl DNA Analyzer | Applied Biosciences |
References
- Feng, Y., Broder, C. C., Kennedy, P. E. HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven transmembrane, G protein-coupled receptor. Science. 272, 872-877 (1996).
- Dragic, T., Litwin, V., Allaway, G. P. HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5. Nature. 381, 667-673 (1996).
- Dorr, P., Westby, M., Dobbs, S. Maraviroc (UK-427,857), a potent, orally bioavailable, and selective small-molecule inhibitor of chemokine receptor CCR5 with broad-spectrum anti-human immunodeficiency virus type 1 activity. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4721-4732 (2005).
- Gulick, R. M., Lalezari, J., Goodrich, J. Maraviroc for previously treated patients with R5 HIV-1 infection. N. Engl. J. Med. 359, 1429-1441 (2008).
- Cooper, D. A., Heera, J., Goodrich, J. Maraviroc versus efavirenz, both in combination with zidovudine/lamivudine, for the treatment of antiretroviral-naíve subjects with CCR5-tropic HIV-1. J. Infect. Dis. 201, 803-813 (2010).
- Low, A. J., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. Trofile HIV co-receptor usage assay. Expert Opin. Med. Diagnostics. 3, 181-191 (2000).
- Sing, T., Low, A. J., Beerenwinkel, N. Predicting HIV co-receptor usage based on genetic and clinical covariates. Antiviral Ther. 12, 1097-1106 (2007).
- Screening for HIV tropism using population-based V3 genotypic analysis: a retrospective virological outcome analysis using stored plasma screening samples from MOTIVATE-1. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 5th International AIDS Society Conference, 2009 19-22 July, Cape Town, South Africa, , (2009).
- Optimization of clinically relevant cut-points for the determination of HIV co-receptor usage to predict maraviroc responses in treatment experienced (TE) patients using population V3 genotyping. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 12th European AIDS Conference, 2009 11-14 Nov, Cologne, Germany, , (2009).
- Optimization of clinically relevant cutoffs for determining HIV co-receptor use by population and "deep" sequencing methods. Swenson, L. C., McGovern, R. A. 47th Annual Meeting of the Infectious Diseases Society of America, 2009 Oct 29 - Nov 1, Philadelphia, PA, USA, , (2009).
- Phenotypic screening for HIV tropism versus both population-based and "deep" sequencing. Swenson, L., McGovern, R., Dong, W. 49th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2009 12-15 Sept, San Francisco, CA, , (2009).
- Swenson, L. C., Moores, A., Low, A. J., Thielen, A., Dong, W., Woods, C., Jensen, M. A., Wynhoven, B., Chan, D., Glascock, C., Harrigan, P. R. Improved Detection of CXCR4-Using HIV by V3 Genotyping: Application of Population-based and 'Deep' Sequencing to Plasma RNA and Proviral DNA. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 54, 506-510 (2010).
- Swenson, L. C., Boehme, R., Thielen, A., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. Genotypic determination of HIV-1 tropism in the clinical setting. HIV Therapy. 4, 293-303 (2010).
