Summary
ВИЧ тропизм может быть выведено из V3 области вирусной оболочки. V3 является ПЦР усиливается в трех экземплярах с использованием вложенных RT-PCR, последовательность и интерпретируются с использованием биоинформатики программного обеспечения. Образцы с с 1 или более последовательности (ы) с низкими оценками G2P классифицируются как-R5 вируса.
Abstract
Справочная информация: До получения препарата из CCR5-антагонистов класса в области ВИЧ терапии, пациент должен пройти тест на ВИЧ тропизм, чтобы подтвердить, что его вирусным население использует CCR5 coreceptor для сотовых запись, а не альтернативные coreceptor. Один из подходов к тропизм тестирования является проверка последовательности V3 области ВИЧ конверт, который взаимодействует с coreceptor.
Методы: Вирусная РНК извлекается из плазмы крови. V3 регионе усиливается в трех экземплярах с вложенными обратной транскриптазы-PCR. Амплификации затем последовательно и проанализированы с помощью программного обеспечения, RE_Call. Последовательности затем представляются на биоинформатики алгоритм, как например geno2pheno сделать вывод о вирусной тропизм от V3 регионе. Последовательности выводятся быть не-R5, если их geno2pheno ложных срабатываний падает ниже 5,75%. Если какой-либо одной из трех последовательностей из образца выводится быть не-R5, пациент вряд ли будет реагировать на CCR5-антагонистов.
Protocol
Порядок действий:
1. Добыча:
По крайней мере, 500 мкл плазмы крови необходимо как образец ввода для этого генотипической тест тропизм ВИЧ.
- Извлечение РНК ВИЧ из 500 мкл плазмы использованием easyMAG (bioMérieux) автоматизированных экстрактор, или предпочтительный метод извлечения вашей лаборатории.
Элюировать извлеченные вирусной РНК в 60 мкл. Хранить при температуре -20 градусов по Цельсию или начать обратной транскриптазы-PCR сразу после извлечения.
2. RT-PCR:
4μL образца экстракт будет усиливаться в трех экземплярах с использованием вложенных RT-PCR методов. RT-PCR реакция должна быть создана в ПЦР-чистой комнате.
- Рассчитать количество реагентов, необходимых для числа образцов для усиливаются. Следуйте приведенной ниже таблице указывает объемы реагента на 1 реакции.
Таблица 1. Реагент объемах, необходимых для 1 реакция One-Step RT PCR.Реагент Объем (мкл)
(1X реакции)DEPC очищенной воды 10,56 2x буфера реакции 20 50 сахарозы% и 0,04% бромфенола синий смеси 4 Прямой праймер ориентации региона ВИЧ-V3 0,32 Обратный праймер 0,32 Фермент - Надстрочный III One-Step RT-PCR System с Платиновая ДНК-полимеразы Taq 0,8 Общий 36
Каждый шаг RT-PCR реакции требуется следующий рецепт:- 10,56 мкл DEPC очищенной воды
- 20 мкл 2х буфера реакции
- 4μL 50% сахарозы и 0,04% бромфенола синий смеси
- 0,32 мкл прямого праймера ориентации региона ВИЧ-V3
- 0,32 мкл обратный праймер
- 0,8 мкл фермента
- Выстроить пример извлечения труб в ряду рядом с пустым, помеченный 96-луночных ПЦР пластины.
- Использование ретранслятора пипетки внести 36 мкл образца смеси в каждую лунку пластины ПЦР, например, что Есть 3 скважины подготовлены для каждого образца экстракта.
* Примечание: Эта процедура должна быть выполнена в трех экземплярах, как минимум, для обеспечения адекватной выборки вирусной популяции. - Использование 8-канальный многоканальную пипетку, добавьте 4μL образца экстракт каждой из 3-х скважин. Изменение советы от каждого дополнения.
- Обложка скважин с ПЦР шапки полосы.
- Когда передача comlete, место пластину ПЦР в амплификаторе. Установить амплификаторе бежать со следующей программой: 30 минут при 52 ° С 2 минуты при 94 ° C 40 циклов (15 секунд при 94 ° C, 30 секунд при 55 ° С и 1,5 минут при 68 ° C) 5 минут при 68 ° C
- Удалить ПЦР пластины из амплификаторе. Пластины можно хранить при комнатной температуре.
Приступить к второй тур шаг ПЦР
3. Второй раунд ПЦР:
- Рассчитать количество реагентов, необходимых для числа образцов для усиливаются. Следуйте приведенной ниже таблице указывает объемы реагента на 1 реакции.
Таблица 2. Реагент объемах, необходимых для 1 реакция 2-го тура ПЦР.Реагент Объем (мкл)
(1X реакции)DEPC очищенной воды 13,45 60% сахарозы, 0,08% крезола красная смесь 2 Рош HiFi система буфер 2 2 MgCl 2 0,8 дНТФ 0,16 Форвард ПЦР праймера 0,15 Обратный праймер ПЦР 0,15 Развернуть HiFi фермента 0,29 Общий 19
Каждый второй раунд ПЦР требует следующий рецепт:- 13,45 мкл DEPC очищенной воды
- 2 мкл 60% сахарозы, 0,08% крезола красная смесь
- 2 мкл Рош Hifi системы буфер 2
- 0,8 мкл 25 мМ MgCl 2
- 0,16 мкл 25 мМ дНТФ
- 0,15 мкл обоих прямого и обратного праймеров ПЦР
- 0,29 мкл фермента Развернуть HiFi
- В комнате усиления сообщение, с помощью 8-канального многоканальной пипетки, передача 1 мкл ПЦР-шаблон на второй тур буфера ПЦР. Изменение советы от каждого дополнения.
- Обложка скважин с ПЦР шапки полосы и передачи втором раунде ПЦР пластины амплификаторе.
- Установить амплификаторе бежать со следующей программой: 2 минуты при 94 ° C 35 циклов (15 секунд при 94 ° C, 30 секунд при 55 ° С, 1 минута при 72 ° C) 7 минут при 72 ° C
- Удалите пластину от амплификаторе после того, как температура вернулась в 25 ° C.
4. Гель-электрофореза:
Для того, чтобы подтвердить, что V3 регионе успешно усиливается, шаг гель-электрофореза не выполняется.
- Подготовка агарозном геле с 0,8 г агарозы порошок в 50 мл буфера 1X TAE. Перемешать и расплава в микроволновой печи в течение ~ 1 минуты или до агарозном полностью не растворится.
- Добавить 6 мкл SYBR безопасной гель пятна и вихревые перемешать.
- Налейте раствор в гель лоток, и добавьте достаточно геля гребни для размещения числа ПЦР скважин.
- Как только гель высохнет, удалить гребни и место гель гель аппарата, убедившись, что он полностью погружен в буфер 1X TAE.
- Использование 10 мкл пипетки многоканальный, добавьте 8μL каждого образца ПЦР для его собственного благополучия в геле. Обложка ПЦР пластины после амплификации были добавлены в гель.
- Добавить 6 мкл ДНК лестницу, по крайней мере одну скважину на строку.
- Выполнить гель аппарата при температуре ~ 100 В в течение ~ 10 минут, убедившись, что группы не убежал геля.
- Место геля на УФ транс-осветителя и сфотографировать гель.
Уэллс с ПЦР-амплифицированной ДНК будет светло, что указывает на успешное усиления. - Обратите внимание на всех образцах, где три усилений были успеха. При необходимости повторите RT-PCR для тех образцов с менее 3 уточнениями.
Приступить к последовательности
5. Последовательность:
После того, как усиливается вирусной кДНК, образцы могут быть подготовлены для секвенирования. Секвенирование реакция должна происходить в пост-усилением комнате.
- Удалить BigDye из морозильника и последовательности праймеров из холодильника. Пусть BigDye оттаивают при комнатной температуре, не более чем на 1 час.
- Рассчитать количество реагентов, необходимых для количества образцов для выполнения. Следуйте приведенной ниже таблице указывает объемы реагента на 1 реакции.
Таблица 3. Объемы реагентов, необходимых для 1 реакции секвенирования.Реагент Объем (мкл)
(1X реакции)BigDye 0,3 BigDye буфера 2,1 Грунтовка 2,6 Общий 5,0
* Примечание: подготовить отдельный микс для каждого праймера.
** Примечание: BigDye Буфер используется в последовательности реакций могут быть получены следующим образом: смешать 17,5 мл Trizma гидрохлорид буферный раствор (1 М) (pH9.0) и 0,125 мл хлорид магния (1 М). Принесите конечный объем до 100 мл воды с реагентом класса. Это следует хранить при температуре 2-8 ° C. - Использование расчетов с 3,3, подготовить последовательности реакции смеси для каждого праймера и вихревые не более чем на 5 секунд. Алиготе в пробирок 0,2 мл полосы.
- Алиготе 5 мкл реакционной смеси последовательности в соответствующие лунки пластины с использованием многоканальной пипетки. Закройте планшет (ы), содержащий смесь последовательности реакции с Kimwipe и отложите.
- Подготовка 1:15 разведение усиливается ПЦР-продукта, добавив 180 мкл Бакстер стерильной водой, чтобы оставшийся продукт ПЦР.
- Внесите 1 мкл разведенного образца на дно лунки пластины, наконечники изменения.
- По окончании передачи образца, печать пластины с полосой колпачки и вихревые в течение 1 секунды
- Место пластины в центрифуге. Установить скорость до 145 г, когда скорость вращения достигает 145 г, остановить вращение.
- Место пластины в амплификаторе (ы) установлен в следующей программе: 25 циклов (10 сек @ 96 ° C, 5 сек при 50 ° С, 55 сек при 60 ° С...) Объем должен быть не менее 6μL . Цикл должен занять около 1,2 часов.
Приступить к осадков
6. Осадки:
Для «зачистки" вирусный кДНК следующие последовательности реакций, выполнить осаждения этанолом использовании 95% этанола.
- Получить пластины из амплификаторе и довести до пост-амплитудафикации комнате.
- Удалить полосу шапки и поместите их в порядок на чистое бумажное полотенце или Kimwipe.
- Внесите 4μL Рабочей ЭДТА-ацетата натрия Решение стороне каждого образца хорошо. Нажмите пластину осторожно, чтобы ЭДТА-натрия раствор падает на дно колодца. Же советы могут быть использованы, пока они не вступают в контакт образца на дне колодца.
* Примечание: рабочее ЭДТА-ацетата натрия, раствор можно приготовить следующим образом:- Подготовка 3М ацетата натрия, растворяя 246,1 г ацетата натрия в 1 л воды реагентом класса. Фильтр решение через 0,45 микрофильтр и подготовить 50 мл аликвоты.
- Подготовка сток ЭДТА-ацетата натрия раствора (1,5 М NaOAc, 250 мМ ЭДТА) путем смешивания равных объемов ацетата натрия (3 м) и раствора ЭДТА (500 мм) рН 8,0.
- Подготовить рабочий ЭДТА-ацетата натрия решения путем смешивания одной части фондового ЭДТА-ацетата натрия решение с тремя частями реагента класса воды (10 мл + 30 мл).
- Внесите 40μL охлажденной 95% этанола на противоположные стороны образца скважин и заменить полосу шапки.
- Печать шапки и вихревые пластине в течение 10 секунд. Нажмите пластину выбить любые пузыри.
- Место пластины в морозильнике при температуре -20 ° С в течение минимум 30 минут и не более 2 часов.
- После осадков произошло, удалить пластину из морозильника и поместить в центрифугу на 20 минут при 3700 оборотах в минуту.
- Снимите соответствующее количество Привет-Ди формамид (Applied Biosystems) из морозильника, чтобы позволить ему оттепели до денатурации.
- После вращающиеся пластины удалить и уничтожить полосу шапки. Обратить пластины за контейнер для отходов (например, бен мусора) и переливать супернатант. Избавиться от оставшихся супернатант промокательной перевернутой тарелки на бумажное полотенце.
- Сложите 2 листов бумажным полотенцем и поместить на поверхности пластины. Место пластины лицом вниз в центрифуге и вращаются на 145 г, останавливая вращение, когда он достигает 145 г.
- Удалите пластину из центрифуги и проверьте, чтобы убедиться скважин пусты. Внесите 155μL охлажденной 95% этанола в скважинах.
- Удалите надосадочную в контейнер отходы и пятном на бумажное полотенце и повторите центрифугирование в 4.10.
- После удаления пластины из центрифуги, отбросить использовать бумажное полотенце и дайте пластины стоять лицом вверх в течение 2-5 минут, чтобы все оставшиеся этанола испариться.
Приступить к денатурации
7. Денатурирование
- Получить талой формамид HiDi и перелить в контейнер, достаточно большой для многоканальной пипетки
* Примечание: При использовании предварительно аликвоты меры, как отмечается в 6.7b, одна трубка необходима для каждого 96-луночного планшета для выполнения. - Использование многоканальной пипетки, распространять 10 мкл формамида HiDi во все лунки на тарелку, в том числе те, которые являются пустыми.
- Обложка пластинки с мата перегородками для образования уплотнения.
- Место пластины в амплификаторе при 90 ° С в течение 2 минут.
- После денатурации, место пластину в пластине держателя затем загрузить в секвенсор. Добавить подготовленные расположение последовательности. Плиты можно хранить при температуре -20 ° С не более одной недели, прежде чем выполнять последовательность запуска.
8. Анализируя полученные данные использования программного обеспечения базы Calling.
- Использование ReCall выполнять автоматическую базу вызова, без вмешательства человека, одного покрытия грунтовки является приемлемым. Напомним, это заказного программного обеспечения вызова базы, которые можно найти по следующему адресу: http://pssm.cfenet.ubc.ca/
* Примечание: необходима учетная запись Войти. Для настройки учетной записи, нажмите кнопку «Регистрация» в Логин странице. Как только учетная запись была создана вы можете получить доступ к странице загрузки. - После входа в систему, вы можете выбрать образцы файлов для загрузки. Использование просматривать опции вы можете определить местонахождение вашего сырья последовательности данных для загрузки с максимальной загрузкой 20 Мб.
* Примечание:... Веб Напомним будет принимать только файлы данных, как ABI и SCF файлов в ZIP, смолы или tar.gz - Как только файлы для загрузки были выбраны, выберите ссылку последовательности. В этом случае, убедитесь, что ссылки последовательность имеет значение 'V3. Теперь вы готовы нажать кнопку "данных процесса".
- Обработанные данные появятся на правой стороне страницы под заголовком "Прошлое Образцы". Каждый запуск или выборочной совокупности обработанных будут помещены в папку помечены датой. Они могут быть повторно помечены, нажав кнопку "Переименовать" кнопку.
- Щелчок по папке появится список образцов. Те, что красные не смогли, а те, которые зеленые прошли. При нажатии на конкретный образец и "Вид" кнопку, вы сможете проанализировать последовательность. Следуйте инструкциям на правой стороне страницы, чтобы перейти throuGH последовательности.
* Примечание: Для этого метода, он приемлем для экспорта последовательностей, которые проходят Напомним (показаны зеленым цветом) автоматически, без ручного вмешательства. - Если вас устраивают результаты, которые вы можете выбрать для загрузки прохождение последовательности, нажав кнопку "Скачать". Файлы будут загружены в сжатом виде папки.
* Примечание: в разделе "Настройки" можно выбрать загрузку и параметры электронной почты, в том числе тип файла. - Образцы не в состоянии производить чистую последовательности трех экземплярах должны быть реамплифицировали в трех экземплярах, из экстракта. Если RePCR не в состоянии обеспечить чистой последовательности, минимум 2 последовательностей является приемлемым для использования в тропизм вывода.
9. Вывод Вирусный тропизм из последовательностей, порождаемых Популяционные Секвенирование использованием Geno2pheno корецептором алгоритма.
- Последовательности могут быть запущены с помощью сервиса geno2pheno coreceptor по следующему адресу: http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php.
- Образцы для загрузки могут быть помечены как счел нужным. Из выпадающего меню значение параметра, выберите "оптимизированный отключений на основе анализа клинических данных из MOTIVATE (2% и 5,75% ФПР)"
- Выберите для загрузки или вставки последовательности для анализа, FASTA файлы являются приемлемыми.
- Geno2pheno FPR можно интерпретировать следующим образом: G2P FPR> 5,75 является представителем R5-использованием вирусного населения; вероятно, ответят на антагонисты рецепторов CCR5 G2P FPR <5,75 является представителем не-R5 вирусного населения; вряд ли реагировать на CCR5 антагонистами. G2P <2 вряд ли есть какие-либо ответ на CCR5 антагонистами. Если какой-либо одной из трех последовательностей из образца выводится быть не-R5, пациент не может ответить на CCR5-антагонистов.
10. Представитель Результаты
Когда протокол выполняется правильно следует ожидать успешного последовательность 2 или 3 повторяет для каждого образца. Отрицательных бежать рядом образцы должны иметь никаких признаков РНК. Большинство последовательности должны "пройти" по basecalling ReCall.
На основании распределения R5 и не-R5 в сообществе вирусного населения, большинство из случайно выбранных образцов пациента можно было бы ожидать, чтобы R5-использованием вируса. Поэтому, если проект дизайна предложил бы в противном случае, следует ожидать, чтобы иметь больше R5, чем не-R5 образцов.
Таблица 1.) Объемы реагента, необходимые для 1 реакция One Step RT-PCR и В) амплификаторе программы, необходимой для проведения ПЦР-реакции.
А)
Реагент | Объем (мкл) (1X реакции) |
| DEPC очищенной воды | 10,56 |
| 2x буфера реакции | 20 |
| 50 сахарозы% и 0,04% бромфенола синий смеси | 4 |
| Прямой праймер SQV3F1 | 0,32 |
| Обратный праймер CO602 | 0,32 |
| Фермент - Надстрочный III One-Step RT-PCR System с Платиновая ДНК-полимеразы Taq | 0,8 |
| Общий | 36 |
* Примечание:
SQV3F1 грунтовки последовательность: 5 'GAG ОСО ATT CCC ATA CAT ТАТ TGT 3'
CO602 грунтовки последовательность: 5 'GCC CAT АГТ GCT TCC ТГК ТГК TCC CAA ГАА CC 3'
Б)
| Количество циклов | Время | Температура |
| 1 | 30minutes | 52 ° C |
| 1 | 2minutes | 94 ° C |
| 40 | 15seconds | 94 ° C |
| 30 секунд | 55 ° C | |
| 1.5minutes | 68 ° C | |
| 1 | 5 минут | 68 ° C |
Таблица 2.) Объемы реагента, необходимые для 1 Реакция второго раунда ПЦР и B) амплификаторе программы, необходимой для проведения второго раунда ПЦР.
А)
Реагент | Объем (мкл) (1X реакции) |
| DEPC очищенной воды | 13,45 |
| 60% сахарозы, 0,08% крезола красная смесь | 2 |
| Рош HiFi система буфер 2 | 2 |
MgCl | 0,8 | |
| дНТФ | 0,16 |
| Прямой праймер SQV3F2 | 0,15 |
| Обратный CD4R грунтовки | 0,15 |
| Развернуть HiFi фермента | 0,29 |
| Общий | 19 |
* Примечание:
SQV3F2 грунтовки последовательность: 5 'TGT GCC ОСО GCT ГГТ ТТТ GCG НА 3'
CD4R грунтовки последовательность: 5 'ТАТ ААТ TCA СТТ СТС CAA ТТГ TCC 3'
Б)
Количество циклов | Время | Температура |
| 1 | 2minutes | 94 ° C |
| 35 | 15seconds | 94 ° C |
| 30 секунд | 55 ° C | |
| 1 минуту | 72 ° C | |
| 1 | 7minutes | 72 ° C |
Таблица 3.) Объемы реагента, необходимые для 1 реакции секвенирования и B), программы амплификаторе необходимо проводить секвенирование реакции.
А)
| Реагент | Объем (мкл) (1X реакции) |
| BigDye | 0,3 |
| BigDye буфера | 2,1 |
| Грунтовка Форвард V3FO2F Обратный SQV3R1 | 2,6 |
| Общий | 5,0 |
* Примечание: Не смешивайте праймеров; отдельные смеси должны быть подготовлены для каждого праймера
V3O2F грунтовки последовательность: 5 'ААТ GTC AGY ACA GTA CAA TGT ACA C 3'
SQV3R1 грунтовки последовательность: 5 'ГАА ААА TTC ЦКТ TCC ACA ATT AAA 3'
Б)
Количество циклов | Время | Температура |
| 25 | 10 секунд | 96 ° C |
| 5 сек | 50 ° C | |
| 55seconds | 60 ° C |
Discussion
Метод, представленный здесь, стандартный метод секвенирования применяться к тропизм тестирования. Клинического применения ВИЧ конверт петли V3 секвенирования вирусной предсказать тропизм уже до конца был ограниченным. Этот метод был показан, в ретроспективном анализе маравирок (ViiV Healthcare) клинических испытаний, должны быть как минимум в равной степени в состоянии предсказать тропизм вирусных по сравнению с другими проверки анализов используется в клинике.
Есть много преимуществ для проведения анализа генотипической петли V3 для тропизм предсказания. Прежде всего, эта процедура может быть выполнена на любом объекте с оперативным оборудованием секвенирование, значительно увеличивая доступность и сокращение затрат времени на тропизм тестирования. Для сравнения, фенотипические Расширенные Пробирной Trofile Чувствительность (ESTA) (Monogram Biosciences), который служил золотым стандартом для тестирования тропизм, проводится в одном центре в Южной Калифорнии. Дополнительные преимущества включают требование меньше исходного материала и минимально необходимый вирусной нагрузки 500copies/mL. Кроме того, эксплуатационные расходы ведения генотипического анализа являются относительно низкими по сравнению с теми из фенотипического анализа. Использование ReCall программного обеспечения, в частности, устраняет потребность в ручной проверки последовательности, которая, как правило, трудоемкая часть генотипа анализа.
Метод, представленный здесь, довольно просто, без особых шаг перевешивает другое значение. Мы рекомендуем запустить ПЦР и секвенирования в трех экземплярах, чтобы увеличить вероятность захвата видов меньшинством в вирусной популяции образца. Репликация больше трех может быть выполнена, однако мы нашли трем образцам быть одновременно эффективной и надежной. Кроме того, мы предлагаем использовать One-Step обратной транскриптазы ПЦР Kit (Qiagen), которая выполняет как-ПЦР и ПЦР в первом раунде в этой же реакции при сохранении высокой чувствительности и специфичности.
Disclosures
П. Ричард Харриган имеет конфликт интересов с ViiV Healthcare, Virco, Merck, Abbott, и квест. Это видео-статью спонсируется ViiV Healthcare.
Acknowledgments
Развитие этого анализа была поддержана Viiv здравоохранения и канадских институтов здравоохранения (CIHR) и через GlaxoSmithKline / CIHR кафедра клинической вирусологии для доктора Харриган.
Поддержка, оказываемая Pfizer и ViiV Healthcare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction using NucliSens easyMAG version 1.0 | |||
| NucliSens easyMAG Magnetic Silica | bioMerieux | cat. # 280133 | (48 x 0.6 ml) |
| NucliSens easyMAG Lysis Buffer | bioMerieux | cat. # 280134 | (4 x 1000 ml) |
| NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1 | bioMerieux | cat. # 280130 | (4 x 1000 ml) |
| NucliSens easyMAG Extraction Buffer 2 | bioMerieux | cat. # 280131 | (4 x 1000 ml) |
| NucliSens easyMAG Extraction Buffer 3 | bioMerieux | cat. # 280132 | (4 x 1000 ml) |
| NucliSens easyMAG version 1.0 | bioMerieux | ||
| Class II A2 biological safety cabinet | |||
| One-Step Reverse Transcriptase PCR and Second Round PCR | |||
| DEPC-treated water | Ambion | cat. # 9922 | |
| SuperScrip III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq High Fidelty | Invitrogen | cat#12574-035 | Kit components used: - SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelty Enzyme Mix - 2X Reaction Mix (a buffer containing 0.4mM of each dNTP, 2.4mM MgSO4) |
| Expand High Fidelity PCR System | Roche Group | cat. # 1 759 078 | Kit components used:- Expand High Fidelity Buffer 10X conc. with 15 mM MgCl2 (lids labelled 2)- Expand HF PCR Enzyme Mix (3.5U/μl)- MgCl2 Stock Solution (25mM) (lids labelled 4) |
| dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP | Roche Group | cat. # 11969064001 | (100 mM) |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | cat. # S0389-500G | |
| Bromophenol blue sodium salt | Sigma-Aldrich | cat.# B5525 | |
| Cresol Red | Sigma-Aldrich | cat.# 114472-5G | indicator grade |
| Thermocycler | |||
| Gel Electrophoresis | |||
| 50X TAE buffer | Invitrogen | cat. # 24710030 | (1000 ml) |
| SYBR Safe DNA gel stain | Invitrogen | cat. # S33102 | |
| Agarose (ultra pure) | Invitrogen | cat. # 15510-027 | |
| E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder | Invitrogen | cat. # 12373-031 | |
| Reagent Grade Type II water | |||
| Gel apparatus | |||
| Sequencing | |||
| ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit | Applied Biosciences | cat. # 4337458 | (25000 reactions) |
| Hi-Di Formamide | Applied Biosciences | cat. # 4311320 | |
| Sodium Acetate (NaOAc) | Sigma-Aldrich | cat. # S-2889 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | Cat.# 03690-100ML | 0.5M, pH=8.0 |
| TRIZMA Hydrochloride Buffer Solution | Sigma-Aldrich | cat. # T-2819 | 1 M, pH 9.0 |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | cat. # M-1028 | 1 M |
| 95% Ethanol | |||
| Running Buffer (10X) with EDTA | Applied Biosystems | cat. # 4335613 | 500 mL |
| Polymer Pop-7 (25mL) Or Polymer Pop-7 (10mL) | Applied Biosystems | cat. # 44363929 or cat. # 4352759 | |
| 3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Sequencing Standard Kit | Applied Biosciences | Cat# 4336943 | |
| Thermocycler | |||
| Centrifuge with plate holders | |||
| 3730xl DNA Analyzer | Applied Biosciences |
References
- Feng, Y., Broder, C. C., Kennedy, P. E. HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven transmembrane, G protein-coupled receptor. Science. 272, 872-877 (1996).
- Dragic, T., Litwin, V., Allaway, G. P. HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5. Nature. 381, 667-673 (1996).
- Dorr, P., Westby, M., Dobbs, S. Maraviroc (UK-427,857), a potent, orally bioavailable, and selective small-molecule inhibitor of chemokine receptor CCR5 with broad-spectrum anti-human immunodeficiency virus type 1 activity. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4721-4732 (2005).
- Gulick, R. M., Lalezari, J., Goodrich, J. Maraviroc for previously treated patients with R5 HIV-1 infection. N. Engl. J. Med. 359, 1429-1441 (2008).
- Cooper, D. A., Heera, J., Goodrich, J. Maraviroc versus efavirenz, both in combination with zidovudine/lamivudine, for the treatment of antiretroviral-naíve subjects with CCR5-tropic HIV-1. J. Infect. Dis. 201, 803-813 (2010).
- Low, A. J., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. Trofile HIV co-receptor usage assay. Expert Opin. Med. Diagnostics. 3, 181-191 (2000).
- Sing, T., Low, A. J., Beerenwinkel, N. Predicting HIV co-receptor usage based on genetic and clinical covariates. Antiviral Ther. 12, 1097-1106 (2007).
- Screening for HIV tropism using population-based V3 genotypic analysis: a retrospective virological outcome analysis using stored plasma screening samples from MOTIVATE-1. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 5th International AIDS Society Conference, 2009 19-22 July, Cape Town, South Africa, , (2009).
- Optimization of clinically relevant cut-points for the determination of HIV co-receptor usage to predict maraviroc responses in treatment experienced (TE) patients using population V3 genotyping. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 12th European AIDS Conference, 2009 11-14 Nov, Cologne, Germany, , (2009).
- Optimization of clinically relevant cutoffs for determining HIV co-receptor use by population and "deep" sequencing methods. Swenson, L. C., McGovern, R. A. 47th Annual Meeting of the Infectious Diseases Society of America, 2009 Oct 29 - Nov 1, Philadelphia, PA, USA, , (2009).
- Phenotypic screening for HIV tropism versus both population-based and "deep" sequencing. Swenson, L., McGovern, R., Dong, W. 49th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2009 12-15 Sept, San Francisco, CA, , (2009).
- Swenson, L. C., Moores, A., Low, A. J., Thielen, A., Dong, W., Woods, C., Jensen, M. A., Wynhoven, B., Chan, D., Glascock, C., Harrigan, P. R. Improved Detection of CXCR4-Using HIV by V3 Genotyping: Application of Population-based and 'Deep' Sequencing to Plasma RNA and Proviral DNA. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 54, 506-510 (2010).
- Swenson, L. C., Boehme, R., Thielen, A., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. Genotypic determination of HIV-1 tropism in the clinical setting. HIV Therapy. 4, 293-303 (2010).
