Summary
دراسات بحثية لايم المرض غالبا ما تتطلب جيل من القراد المصابين burgdorferi البورلية الممرض ، وهي العملية التي عادة ما يستغرق عدة أسابيع. نحن هنا يبرهن على وجود عدوى قراد microinjection المستندة إلى الإجراء الذي يمكن أن ينجز في غضون ساعات. نظهر أيضا أسلوب المناعي للتوطين في الموقع من burgdorferi باء داخل القراد.
Abstract
ويتسبب مرض لايم عن طريق العدوى مع الممرض burgdorferi البورلية ملتوية ، وهو الحفاظ على الطبيعة من قبل في دورة العدوى القراد القوارض 1. وقد تم تطوير نموذج التجزئة التي تنقلها الفئران 2 لدراسة مرض لايم في المختبر. بينما يمكن أن يصاب القراد السذاجة مع B. burgdorferi بواسطة إطعامهم على الفئران المصابة ، وعملية طرح الريش يستغرق عدة أسابيع أو أشهر ليكتمل. ولذلك ، وتطوير أسرع وأكثر كفاءة تقنيات عدوى التجزئة ، مثل إجراء microinjection المستندة إلى أداة هامة لدراسة مرض لايم 3،4. الإجراء يتطلب ساعات فقط لتوليد القراد المصابة ويسمح بالسيطرة على تسليم كميات متساوية من اللولبيات في فوج من القراد. هذا مهم خصوصا وأن الجيل باء القراد burgdorferi المصابة بواسطة عملية التغذية الطبيعية باستخدام الفئران فشل لضمان 100 ٪ نسبة العدوى والنتائج المحتملة في الاختلاف من عبء الممرض بين القراد فدان. وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام microinjection تصيب القراد مع B. burgdorferi يعزل في الحالات التي يكون فيها سلالة موهنة غير قادر على إنشاء العدوى في الفئران ، وبالتالي لا يمكن الحصول عليها بشكل طبيعي عن طريق القراد 5. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لتقديم مجموعة متنوعة من المواد البيولوجية الأخرى في القراض ، على سبيل المثال ، الأجسام المضادة المحددة أو الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي مزدوج 6. في هذه المقالة ، سوف نظهر للmicroinjection من القراد مع nymphal في المختبر ، نمت B. burgdorferi. سوف نقوم أيضا تصف طريقة لتوطين مسببات مرض لايم في الأمعاء القراد باستخدام المجهر مبائر المناعي.
Protocol
1. Microinjection من القراد اللبود الكتفي Nymphal
1. إعداد الإبر
- افتعال الإبر microinjection عدة عن طريق التسخين وسحب أنابيب زجاجية 1 ملم الشعرية (الآلات الدقيقة الدولي) في جهاز الزجاج مجتذب micropipette (Narishige). إزالة بعناية الأنابيب الشعرية الهشة.
- سحبت تخزين الإبر (مع تلميح تواجه التصاعدي) على شريط لاصق في طبق بتري.
2. إعداد B. burgdorferi
- تنمو باء burgdorferi BSK في ثقافة الإعلام 7 حتى عند تركيز من حوالي 10 7 خلايا لكل مليلتر. تحسب اللولبيات تحت المجهر داكنة الحقل باستخدام غرفة عد Petroff - Hausser (Hausser العلمية).
- بيليه B. burgdorferi بواسطة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة وطاف بيليه resuspend تماما في وسائل الإعلام عن طريق تمرير BSK بلطف من خلال microtip 200 ميكرولتر العقيمة إلى التركيز النهائي للخلايا في 10 9 مل. لأن معلق الخلايا في خلية كثافة عالية ، ويمكن أن تتجمع معا ، ينبغي أن تستخدم لتعليق الخلية microinjection على الفور.
3. إعداد القراد
- مكان واضح ، وشريط لاصق على الوجهين على شريحة زجاجية.
- العمل على حصيرة لزجة ، وإزالة بعناية القراد nymphal من الحاوية باستخدام فرشاة صغيرة.
- وضع العدد المطلوب من القراد ليتم حقنه في شريط لاصق ، حتى الجانب البطني ، التي تواجه نفس الاتجاه.
4. القراد عن طريق الحقن
- تحميل 5 ميكرولتر من B. burgdorferi الثقافة في إبرة الشعرية سحبت باستخدام 20 ميكرولتر microloader ماصة الحافة (إيبندورف). تفقد إبرة لفقاعات الهواء المحبوس وتحديث الإبرة مع الثقافة البكتيرية ، وإذا لزم الأمر.
- عرض القراد تحت المجهر مجهر تشريح والتركيز على مجال التجزئة في فتحة الشرج. اللمس بلطف رأس الإبرة الشعرية من أجل كسر الأنبوب حيث قطرها أصغر قليلا من فتحة الشرج والقراد ، وتشكيل microinjection الإبرة. هذه الخطوة الحاسمة لأن أي محاولة لحقن القراد مع طرف الإبرة غير مناسبة يسبب الوفاة والاصابة المحتملة للحقن القراد.
- مكان القراد يجمد تحت المجهر مجهر تشريح والتركيز على فتحة الشرج ، والتي تغطيها الصفيحتين الشرج المنقولة. باستخدام الملقط غرامة ، وتلمس برفق والضغط الخفيف جدا إلى أي منطقة بالقرب من فتحة الشرج. هذا سيسمح لوحات فصل الشرج وفتح المسام الشرج الذي يتصل الأمعاء. بعناية إدراج رأس الإبرة قليلا في فتحة الشرج من خلال فتح القسري لوحات الشرج. يجب أن تبقى غرز الإبرة إلى الحد الأدنى كما يمكن ان يلحق الضرر طرف زجاج نصف شفاف والمعى المؤخر الذي يتصل المستقيم. باستخدام microinjector مجهزة التحكم الآلي القدم (إيبندورف) ، وضخ B. burgdorferi حل باستخدام المعلمات التالية : 1000 hectopascals (هكتوبسكال) ضغط الحقن ، الحقن مرة ثانية 0.2 و 8 هكتوبسكال ضغط التعويض. كل علامة يتلقى حقنة واحدة.
- microinjection التالية ، يجب أن تتصرف القراد مشابهة لحالة ما قبل الحقن. على سبيل المثال ، ينبغي أن القراد الزحف استجابة للمؤثرات.
- نسمح عادة القراد لاستعادة لمدة 48 ساعة في غرفة البيئية التي حددت في 24 درجة مئوية مع 16 ساعة / 8 ساعات الضوء / الظلام نظام الإضاءة والرطوبة 95 ٪. إذا كانت الغرفة غير متوفرة ، يمكن تخزين القراد حقن في درجة حرارة الغرفة في ظروف رطبة داخل حاوية محكمة الغلق ، مثل مجفف الغرفة العادية. إذا لزم الأمر ، يمكن أيضا الانتعاش مرة من القراد يمكن اختصارها لبضع ساعات قبل استخدامها لتتغذى على الفئران.
2. باء burgdorferi التعريب بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر المناعي
1. تشريح القراد
- مخزنة وضع قطرات من الفوسفات الملحي (PBS) على شريحة زجاجية نظيفة للتشريح ، وآخر على شريحة بولي - L - يسين المغلفة (سيجما) للفحص المجهري. إعداد شريحة أخرى من الزجاج مع شريط لاصق على الوجهين.
- إزالة القراد من الحاويات ومكان على شريط لاصق على الوجهين باستخدام فرشاة صغيرة.
- عرض والتركيز على وضع علامة في مجهر تشريح. مكان شفرة حلاقة حادة على القراد بين الأزواج الأول والثاني من الساقين. اضغط لأسفل بشدة قطاعات التجزئة في قطعتين السماح بالوصول إلى البطن. على الفور ، يغرق في البطن في قطيرة من برنامج تلفزيوني.
- باستخدام ملقط دقيق جدا ، والاستيلاء على ظهري وبطني الهيكل الخارجي حول موقع القطع. سحب بعناية الدرع الظهري وحتى بعيدا من القراد تعريض رتوج الأمعاء البني اللون. توخي الحذر للحفاظ على القراد في إطار برنامج تلفزيوني تشريح في جميع الأوقات.
- شبه شفافة بن الغدة اللعابيةوتقع dles على جانبي المنطقة الأمامية للامعاء ، ويمكن إزالتها عند هذه النقطة ، إذا رغبت في ذلك. عقد الهيكل الخارجي المتبقية في مكان بالملقط ، وسحب بعناية الأمعاء الخروج من البطن.
- بلطف تنظيف القناة الهضمية من خلال إزالة أي أنسجة المحاصرين (على سبيل المثال ، القصبة الهوائية).
- باستخدام الملقط غيض من الغرامة ، ونقل بسرعة في الأمعاء القراد بقطرة من برنامج تلفزيوني على شريحة زجاجية بولي - L - يسين. فصل الأمعاء إلى قطع صغيرة باستخدام شفرات غرامة أو الضغط برفق مع ملقط غيض من الغرامة. نضح بعناية PBS الزائدة حول أنسجة الأمعاء.
- السماح للأنسجة الأمعاء في الهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة.
- إصلاح الأمعاء القراد التي غمرت في الأسيتون لمدة 10 دقيقة. تسمح للهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة. ويمكن تخزين الشرائح في هذه الخطوة لعدة أشهر في -20 درجة مئوية في وعاء محكم الهواء.
2. تلطيخ
- استخدام المناديل الورقية ، وإزالة الرطوبة الزائدة حول الأنسجة ورسم دائرة حول الأمعاء القراد المجففة بواسطة القلم حلمة الثدي أو أي بطانة جدار الجهاز مسعور. وهذا سوف يساعد على الاحتفاظ الحلول تلطيخ خلال الخطوات اللاحقة الحضانة.
- تغطية القناة الهضمية التجزئة مع واحدة أو بضع قطرات من حجب العازلة (0.05 ٪ توين - 20 ، مصل الماعز 5 ٪ في PBS) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. المصل المستخدمة لحجب يعتمد على مصدر الحيوان المضيف للجسم. لا تسمح الشريحة لتجف من هذه النقطة إلى الأمام.
- نضح ببطء العازلة حظر. احتضان الأمعاء مع الأولية المناسبة و / أو حلول الضد الثانوية. نستخدم فلوريسئين ثيوسيانات (FITC) -- المسمى مكافحة باء burgdorferi الأضداد (Kirkegaard ومختبرات بيري) في التخفيف 1:100 في عرقلة العازلة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تغطية الحاويات برقائق الألومنيوم للحد من التعرض للضوء.
- الحل إزالة الأجسام المضادة التي تطلع لطيف. احتضان الأمعاء مع صبغة الفلورسنت لأنسجة القراد التسمية ، مثل 4 "،6 - diamidino - 2 - phenylindole (دابي) أو يوديد propidium. نستخدم عادة 20 ميكروغرام / مل يوديد propidium (سيغما) في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. في درجة حرارة الغرفة.
- تغسل 3 مرات مع 0.05 ٪ توين - 20 في برنامج تلفزيوني.
- تركيب شريحة في الجلسرين مخزنة تحتوي على كاشف antifade مثل Slowfade (Invitrogen) والغطاء بعناية مع ساترة الزجاج. ويمكن تخزين الشرائح في هذه الخطوة لبضعة أشهر في 4 درجات مئوية داخل حاوية محكمة الغلق. صورة وباء توطين burgdorferi تحت المجهر مبائر.
3. ممثل النتائج
موقف لوضع علامة nymphal microinjection وصورة تمثل B. ويرد burgdorferi التعريب في الأمعاء التجزئة في الشكل 1.
الشكل 1. Microinjection وتوطين B. burgdorferi في الأمعاء القراد.
(A) لعرض بطني أولا nymphal قراد الكتفي وضعه لmicroinjection. فتحة الشرج هو مبين (رأس السهم) مع إدخال إبرة microinjection (السهم) تحت التكبير في أقحم. ويستخدم forcep غرامة لتطبيق ضغط لطيف للجسم ، مما سمح لوحات فصل الشرج وفتح المسام لmicroinjection الشرج. يتم تعبئة الإبرة بمحلول الزرقاء Coomassie رائعة لتعزيز الرؤية. (B) عن نتائج الممثل التصوير المناعي مبائر باء burgdorferi داخل أمعاء القراد. يظهر المنطقة الأمامية من رتج الأمعاء. نوى الأمعاء واللولبيات (السهم) وصفت مع يوديد propidium (اللون الأحمر) أو FITC - مترافق المضادة B. - burgdorferi (اللون الأخضر) ، على التوالي. بار = 20 ميكرومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا نظهر إجراء microinjection المستندة للعدوى سريعة وفعالة من القراد اللبود nymphal مع الممرض البكتيرية B. burgdorferi. وصفنا أيضا إجراء مبائر المناعي للكشف عن B. burgdorferi في الأمعاء التجزئة في الموقع. على الرغم من أن المظاهرة ينطوي على القناة الهضمية لدينا nymphal ، وإجراءات مماثلة تنطبق أيضا على مراحل النمو الأخرى من القراد ، مثل يرقة أو البالغين 8،9. ومع ذلك ، نظرا لحجم أصغر منها ، قد تكون هذه التقنية صعبة نسبيا للاستخدام في اليرقات ، ولكن ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق بشكل جيد للاستخدام في القراد الكبار. طرق أخرى للعدوى اصطناعية من القراد مع B. وقد وضعت burgdorferi ، مثل التغذية عن طريق أنابيب زجاجية 10 الشعرية أو عن طريق الغمر في مستنبت 11. هذه الأساليب كفاءة وأبسط وغير مكلفة نسبيا. بيد أن هذه الإجراءات تعتمد على النقل غير المنضبط نسبيا باء burgdorferi القراد في الفردي ، وبالتالي يحتمل أن تكون محدودة في توليد أفواج من القراد تعج أعباء الممرض على قدم المساواة. ويمكن التغلب على النقص الأخير بشكل كبير عن طريق المزيد من الإجراءات التسليم المراقب ، مثل microinjection. في المختبر لدينا ، ونحن توظيف عادة هذا الإجراء لنقل B. burgdorferi في القراد مع معدلات إصابة ما يقرب من 100 ٪ ، ومعظم القراد البقاء على قيد الحياة العملية. يمكن الاحتفاظ القراد حقنه في المختبر لعدة أسابيع أو شهور ، أو السماح على الفور التهم التي أجريت على الفئران وأحيل B. burgdorferi العدوى. كفاءة وحركية B. burgdorferi انتقال من القراد microinjected مماثلة لتلك التي القراد المصابة بشكل طبيعي ، وبالتالي العدوى الاصطناعية إجراءات التجزئة من المرجح أن تساعد في الجهود التي نبذلها للدراسة التي ينقلها القراد مرض لايم. بالإضافة إلى ذلك ، كما تم تطبيق تقنيات مشابهة microinjection لأغراض تجريبية ذات الصلة ، على سبيل المثال ، تدخل الحمض النووي الريبي التي تتوسط فيها التلاعب الجيني للالقراد 6،9،12.
Microinjection مراحل غير ناضجة من القراد هو إجراء حساسة نسبيا. وبالتالي فمن المهم للتحقق من أن القراد حقنوا B. burgdorferi يتمتعون بصحة جيدة قبل الانتقال إلى المجموعة التالية من التجارب. بعد حقن القراد التي تراجعت الساقين ولا تستجيب لمحفزات ، مثل زفير أو لمس بفرشاة ، لا ينبغي أن تستخدم لمزيد من التجارب. هذه هي على الأرجح ميتا أو على وشك الموت من جراء الصدمة الحقن. لقد وجدنا أن حجم رأس إبرة الحقن والمعلمات هما العاملان حاسما في هذا الإجراء ، ونصائح وأحجام أكبر إبرة الحقن قد يؤدي إلى تمزق جدار الأمعاء المحتمل في معدل الوفيات الناجمة التجزئة عالية. من المهم أيضا أن نلاحظ أن أمثل في المقام الأول على ضبط microinjection الموصوفة هنا لحقن B. burgdorferi علقت في وسائل الإعلام BSK. مواد بيولوجية أخرى ، مثل الأجسام المضادة أو الحلول تتركز RNA ، يمكن أن تختلف في اللزوجة السوائل. بالنسبة للمواد الأخرى ، وضبط microinjection الأمثل ، في المقام الأول على ضغط الحقن والحقن الوقت ، يجب أن يتم تحديد تجريبيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر بإخلاص أعضاء مختبر بال للمساعدة في إعداد هذه التظاهرة. وأيد هذه الدراسة PHS المنح AI076684 من المعاهد الوطنية للصحة وAI080615 / المعدية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| Vertical glass puller | Narishige International | PC-10 | |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser Scientific | 3900 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Femtojet microinjector | Eppendorf | 920010504 | |
| Foot control FemtJet | Eppendorf | 920005098 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP665-1 | Filter-sterilized |
References
- Steere, A. C., Coburn, J., Glickstein, L. The emergence of Lyme disease. J Clin Invest. 113, 1093-1101 (2004).
- Barthold, S. W., Diego, C., Philipp, M. T. Borrelia, Molecular Biology, Host Interaction and Pathogenesis. Samuels, D. S., Radolf, J. D. , Caister Academic Press. Chapter 14 353-405 (2010).
- Pal, U. OspC facilitates Borrelia burgdorferi invasion of Ixodes scapularis salivary glands. J Clin Invest. 113, 220-230 (2004).
- Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete. J Exp Med. 199, 641-648 (2004).
- Zhang, X., Yang, X., Kumar, M., Pal, U. BB0323 function is essential for Borrelia burgdorferi virulence and persistence through tick-rodent transmission cycle. J Infect Dis. 200, 1318-1330 (2009).
- Pal, U. TROSPA, an Ixodes scapularis receptor for Borrelia burgdorferi. Cell. 119, 457-468 (2004).
- Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale J Biol Med. 57, 521-525 (1984).
- Narasimhan, S. Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 1141-1146 (2004).
- Narasimhan, S. A tick antioxidant facilitates the Lyme disease agent's successful migration from the mammalian host to the arthropod vector. Cell Host Microbe. 2, 7-18 (2007).
- Broadwater, A. H., Sonenshine, D. E., Hynes, W. L., Ceraul, S., DeSilva, A. Glass capillary tube feeding: a method for infecting nymphal Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) with the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. J Med Entomol. 39, 285-292 (2002).
- Policastro, P. F., Schwan, T. G. Experimental infection of Ixodes scapularis larvae (Acari: Ixodidae) by immersion in low passage cultures of Borrelia burgdorferi. J Med Entomol. 40, 364-370 (2003).
- Fuente, dela, Kocan, J., M, K., Almazan, C., Blouin, E. F. RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks. Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).
