Summary
Lyme-Borreliose Studien erfordern oft Generation von Zecken mit dem Erreger Borrelia burgdorferi, ein Prozess, der dauert in der Regel mehrere Wochen infiziert. Hier zeigen wir eine Mikroinjektion-basierte Zecken Infektion Verfahren, das innerhalb weniger Stunden erreicht werden kann. Wir zeigen auch einer Immunfluoreszenz-Methode zur in situ-Lokalisation von B. burgdorferi in Zecken.
Abstract
Lyme-Borreliose wird durch eine Infektion mit dem Erreger Borrelia burgdorferi Spirochäten, die in der Natur von einer Zecke-Nagetier Infektionszyklus 1 beibehalten verursacht. Eine durch Zecken übertragene murine Modell 2 wurde entwickelt, um Lyme-Borreliose im Labor zu untersuchen. Während naive Zecken mit B. infiziert sein burgdorferi, indem man sie auf infizierten Mäusen, so erfolgt die Häutung Prozess mehrere Wochen bis Monate in Anspruch nehmen. Daher ist die Entwicklung von schnelleren und effizienteren Zecken Infektion Techniken, wie eine Mikroinjektion-basiertes Verfahren, ein wichtiges Instrument für die Erforschung der Lyme-Borreliose 3,4. Das Verfahren erfordert nur wenige Stunden, um infizierte Zecken zu generieren und ermöglicht die Kontrolle über die Lieferung von gleichen Mengen von Spirochäten in einer Kohorte von Zecken. Dies ist besonders wichtig, da die Erzeugung von B. burgdorferi infizierten Zecken durch die natürliche Fütterung Prozess mit Mäusen nicht zu 100% Infektionsrate und potenziell Ergebnisse in Variation der Erreger Belastung unter zugeführt Zecken zu gewährleisten. Darüber hinaus kann die Mikroinjektion verwendet werden, um Zecken mit B. zu infizieren burgdorferi-Isolate in Fällen, in denen eine abgeschwächte Stamm ist nicht auf eine Infektion in Mäusen zu etablieren und damit kann natürlich nicht durch Zecken 5 Erwerb werden. Diese Technik kann auch verwendet werden, um eine Vielzahl von anderen biologischen Materialien in Zecken zu liefern, z. B. spezifische Antikörper oder Doppel-RNA 6 gestrandet. In diesem Artikel werden wir die Mikroinjektion von Nymphen mit in vitro-grown B. zeigen, burgdorferi. Wir werden auch eine Methode zur Lokalisierung von Lyme-Borreliose Erreger in der Zecke gut mit Hilfe der konfokalen Immunfluoreszenz-Mikroskopie.
Protocol
1. Mikroinjektion von Nymphen Ixodes scapularis Ticks
1. Vorbereitung Nadeln
- Fertigen Sie mehrere Mikroinjektion Nadeln durch Erhitzen und Ziehen 1 mm Glaskapillaren (World Precision Instruments) in einem Glasmikropipette Abziehvorrichtung (Narishige). Entfernen Sie vorsichtig das fragile Kapillaren.
- Shop gezogen Nadeln (mit der Spitze nach oben) auf Klebeband in einer Petrischale.
2. Vorbereitung B. burgdorferi
- Wachsen B. burgdorferi in BSK Kulturmedien 7 bis zu einer Konzentration von etwa 10 7 Zellen pro mL. Spirochäten sind unter einem Dunkelfeld-Mikroskop mit Hilfe einer Petroff-Hausser Zählkammer (Hausser wissenschaftlichen) gezählt.
- Pellet B. burgdorferi durch Zentrifugation bei 3.000 xg für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
- Überstand entfernen und vollständig das Pellet in BSK Medien durch sanft durch eine 200 ul sterilem Mikrospitze bis zu einer Endkonzentration von 10 9 Zellen pro mL. Da die Zellen bei hoher Zelldichte resuspendiert und konnte verklumpen, der Zellsuspension sollte für die Mikroinjektion sofort verwendet werden.
3. Vorbereitung Zecken
- Legen Sie klare, doppelseitigen Klebeband auf einem Glasträger.
- Working on a sticky mat, entfernen Sie vorsichtig Nymphen aus dem Behälter mit einer kleinen Bürste.
- Legen Sie die erforderliche Anzahl von Zecken auf dem Klebeband, Bauchseite injiziert verfasst werden, in die gleiche Richtung.
4. Injizieren Zecken
- Legen Sie 5 ul der B. burgdorferi Kultur in die gezogen Kapillarnadel mit einem 20 ul Microloader Pipettenspitze (Eppendorf). Überprüfen Sie die Nadel für die eingeschlossene Luftblasen und laden Sie die Nadel mit Bakterienkultur, falls erforderlich.
- Sehen Sie sich die Zecke unter dem Sezieren Binokular und konzentrieren sich auf die Zecke Afteröffnung Bereich. Sanft berühren die Spitze der Kapillare Nadel, um die Röhre, wo der Durchmesser ist etwas kleiner als die von der Zecke Afteröffnung bilden die Mikroinjektionsnadel brechen. Dieser Schritt ist wichtig, da jeder Versuch, Zecken mit einem nicht geeigneten Nadelspitze injizieren Ursachen Verletzung und möglichen Tod des injizierten ticken.
- Legen Sie die immobilisierten Ticks unter dem Sezieren Binokular und konzentrieren sich auf die Afteröffnung, die durch zwei bewegliche Analplatten bedeckt ist. Mit feinen Pinzette vorsichtig anfassen und gelten sehr milden Druck auf jedem Gebiet in der Nähe Afteröffnung. Dies ermöglicht Trennung der Analplatten und Eröffnung der anal Pore, die den Darm verbindet. Schieben Sie die Spitze der Nadel leicht in die Afteröffnung durch die erzwungene Öffnung der Analplatten. Einführen der Nadel sollte auf ein Minimum reduziert werden, da das Glas Spitze der semitransparenten Enddarm, dass bis zum Rektum verbindet beschädigen könnten. Mit einem Mikroinjektor mit automatisierten Fußschalter (Eppendorf) ausgestattet, injizieren B. burgdorferi-Lösung mit folgenden Parametern: 1.000 Hektopascal (hPa) Einspritzdruck, 0,2 Sekunden Einspritzzeit und 8 hPa Kompensationsdruck. Jeder Tick erhält eine einmalige Injektion.
- Nach Mikroinjektion, sollten die Zecken verhalten sich ähnlich wie die Voreinspritzung Zustand. Zum Beispiel sollte die Zecke in Reaktion auf Reize zu kriechen.
- Wir erlauben in der Regel die Zecken zu 48 Stunden lang in einer Klimakammer bei 24 ° C eingestellt erholen mit 16 Stunden / 8 Stunden Licht / Dunkel Photoperiode Therapie und 95% Luftfeuchtigkeit. Wenn eine Kammer nicht verfügbar ist, könnte injiziert Zecken bei Raumtemperatur in feuchten Bedingungen innerhalb einer luftdichten Behälter, wie zum Beispiel eine regelmäßige Exsikkator Kammer gelagert werden. Falls erforderlich, könnten Erholungszeit der Zecken auch um ein paar Stunden verkürzt werden, bevor für die Fütterung an Mäuse verwendet.
2. B. burgdorferi Lokalisierung von Konfokale Immunfluoreszenz-Mikroskopie
1. Dissecting Zecken
- Legen Sie einen Tropfen Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf einen sauberen Glasobjektträger für die Präparation und eine weitere auf einer Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger (Sigma) für die Mikroskopie. Bereiten Sie eine andere Glasträger mit doppelseitigem Klebeband.
- Entfernen Sie das Häkchen aus dem Behälter nehmen und auf doppelseitigen Klebeband mit einer kleinen Bürste.
- Anzeigen und sich die Zecke in der Dissektionsmikroskop. Platzieren einer scharfen Rasierklinge auf die Zecke zwischen dem ersten und zweiten Beinpaare. Drücken Sie fest Schneiden Sie das Häkchen in zwei Stücke für den Zugang zu den Unterleib. Sofort tauchen den Bauch in einem Tropfen PBS.
- Mit sehr feinen Pinzette greifen die dorsalen und ventralen Exoskelett rund um den Ort des Schnittes. Ziehen Sie die dorsalen Schild oben und weg von der Zecke Freilegung der bräunlich gefärbten Darm Divertikel. Achten Sie darauf, das Sezieren Ticks unter dem PBS zu jeder Zeit zu halten.
- Die semi-transluzente Speicheldrüse bundles sind auf beiden Seiten des vorderen Bereich des Darms entfernt und kann an dieser Stelle entfernt werden, falls gewünscht. Halten Sie die verbleibenden Exoskelett statt mit einer Pinzette, ziehen Sie vorsichtig den Darm aus dem Bauch.
- Reinigen Sie den Darm durch das Entfernen eventuell eingeschlossene Gewebe (zum Beispiel, Luftröhre).
- Mit der Spitze der feinen Pinzette, schnelle Übertragung der Zecke gut in einem Tropfen PBS auf einem Poly-L-Lysin Objektträger aus Glas. Trennen Sie die gut in kleinere Stücke mit feinen Klingen oder leichtes Drücken mit der Spitze des feinen Pinzette. Vorsichtig absaugen überschüssigen PBS um den Bauch herum Gewebe.
- Lassen Sie das gut Gewebe an der Luft bei Raumtemperatur trocknen.
- Fix die Zecke gut durch Eintauchen in Aceton für 10 Minuten. An der Luft bei Raumtemperatur trocknen. Slides können Sie diesen Schritt für Monate bei -20 ° C gelagert in einem luftdichten Behälter.
2. Die Färbung
- Mit Seidenpapier, entfernen Sie die überschüssige Feuchtigkeit in das Gewebe und ziehen Sie einen Kreis um die getrockneten Tick gut durch einen Pap-pen oder hydrophoben Barriere Futter Gerät. Dies wird helfen, die Färbelösungen bei der anschließenden Inkubationsschritte behalten.
- Decken Sie die Zecke gut mit einem oder ein paar Tropfen Blockierungspuffer (0,05% Tween-20, 5% Ziegenserum in PBS) für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Das Serum für die Sperrung hängt von der Quelle der Wirtstier für den Antikörper. Lassen Sie die Folie, um von diesem Punkt an zu trocknen.
- Langsam absaugen Blockierungspuffer. Inkubieren Sie die gut mit den entsprechenden Primär-und / oder sekundären Antikörper-Lösungen. Wir verwenden (FITC) - markierten Anti-B burgdorferi-Antikörper (Kirkegaard & Perry Laboratories) bei einer Verdünnung 1:100 in Blocking-Puffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Bedecken Sie den Container mit Alu-Folie, um Lichteinwirkung zu begrenzen.
- Entfernen der Antikörper-Lösung durch leichtes Ansaugen. Inkubieren Sie die gut mit einem fluoreszierenden Farbstoff zu markieren Tick Geweben, wie z. B. 4 ',6-Diamino-2-phenylindole (DAPI) oder Propidiumiodid. Wir benutzen normalerweise 20 pg / mL Propidiumiodid (Sigma) in PBS für 5 min. bei Raumtemperatur.
- 3 x waschen mit 0,05% Tween-20 in PBS.
- Montieren Sie die Folie in Glyzerin, die einen Antifade Reagens wie Slowfade (Invitrogen) und vorsichtig mit einem Deckglas abdecken. Dias können in diesem Schritt für ein paar Monate bei 4 ° C in einem luftdichten Behälter aufbewahrt werden. Bild und lokalisieren B. burgdorferi unter einem konfokalen Mikroskop.
3. Repräsentative Ergebnisse
Position eines nymphal Tick für die Mikroinjektion und ein Bild darstellt B. burgdorferi-Lokalisierung in der Zecke Darm ist in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1. Mikroinjektion und Lokalisierung von B. burgdorferi in der Zecke gut.
(A) Ventrale Ansicht eines nymphal I. scapularis Tick für die Mikroinjektion positioniert. Anal Öffnung (Pfeilspitze) mit eingelegtem Mikroinjektionsnadel (Pfeil) ist unter Vergrößerung im Einschub gezeigt. Eine feine ForceP wird verwendet, um sanften Druck auf den Körper, die Trennung der Analplatten und Eröffnung des analen Pore für die Mikroinjektion erlaubt gelten. Die Nadel wird mit einer Lösung von Coomassie brilliant blue zur Verbesserung der Sichtbarkeit gefüllt. (B) Repräsentative Ergebnisse der konfokalen Immunfluoreszenz Abbildung von B. burgdorferi in Zecken gut. Frontzahnbereich einer gut Divertikel wird angezeigt. Gut Kerne und Spirochäten (Pfeil) mit Propidiumiodid (rot) oder FITC-konjugierten Anti-B gekennzeichnet burgdorferi (grün), jeweils. Bar = 20 um.
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Discussion
Hier zeigen wir eine Mikroinjektion-basiertes Verfahren zur schnellen und effizienten Infektion nymphal Ixodes-Zecken mit dem bakteriellen Erreger B. burgdorferi. Wir beschreiben auch eine konfokale Immunfluoreszenz Verfahren für den Nachweis von B. burgdorferi in der Zecke gut in situ. Obwohl unsere Demonstration beinhaltet nymphal gut, sind ähnliche Verfahren auch für andere Entwicklungsstadien der Zecken, wie Larven oder Erwachsene 8,9. Aufgrund ihrer geringen Größe kann die Technik relativ schwierig für den Einsatz in Larven, sollte aber gut geeignet für den Einsatz in adulte Zecken. Andere Methoden der künstlichen Infektion der Zecken mit B. burgdorferi entwickelt worden, wie die Zuführung durch Glaskapillaren 10 oder durch Eintauchen in das Kulturmedium 11. Diese Methoden sind effizienter, einfacher und relativ preiswert. Allerdings beruhen diese Verfahren auf relativ unkontrollierte Übertragung von B. burgdorferi in einzelne Zecken und damit potenziell in Erzeugung Kohorten von befallenen Zecken mit dem gleichen Erreger Belastungen begrenzt. Letzteres Manko könnte durch weitere kontrollierte Abgabe Verfahren, wie z. B. Mikroinjektion überwunden werden. In unserem Labor haben wir routinemäßig einzusetzen dieses Verfahren zu übertragen B. burgdorferi in Zecken mit Infektionsraten von fast 100%, und die meisten Zecken überleben die Prozedur. Injected Zecken können im Labor für mehrere Wochen bis Monate aufbewahrt werden, oder sofort dürfen an Mäusen engorge und übermitteln B. burgdorferi-Infektion. Die Effizienz und die Kinetik der B. burgdorferi Übertragung von mikroinjiziert Zecken sind ähnlich zu der von natürlich-infizierten Zecken, und deshalb sind künstliche Tick Infektion Verfahren dürfte in unseren Bemühungen, durch Zecken übertragene Lyme-Borreliose-Studie zu unterstützen. Darüber hinaus haben ähnliche Mikroinjektion Techniken auch für verwandte experimentelle Zwecke angewendet worden, z. B. RNA-Interferenz-vermittelte genetische Manipulation von Zecken 6,9,12.
Mikroinjektion der unreifen Stadien der Zecken ist eine relativ heikle Prozedur. Es ist daher wichtig, um sicherzustellen, dass die Zecken mit B. injiziert burgdorferi sind, bevor Sie den nächsten Satz von Experimenten gesund. Post-injiziert Zecken, die Beine eingezogen haben und reagieren nicht auf Reize, wie ausgeatmeten Luft oder Berührung mit einem Pinsel, sollte nicht für weitere Experimente verwendet werden. Diese sind am ehesten tot oder am Rande des Sterbens von der Injektion Trauma. Wir haben festgestellt, dass die Größe der Nadelspitze und Einspritzparameter die beiden kritischen Faktoren in der Prozedur, wie größere Nadelspitzen und Injektionsvolumina werden könnte Ruptur der Darmwand was zu einer hohen Sterblichkeit ankreuzen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Mikroinjektion hier beschriebenen Einstellungen in erster Linie für die Injektion B. optimierte burgdorferi in BSK Medien ausgesetzt. Andere biologische Materialien, wie z. B. Antikörper oder konzentrierte RNA-Lösungen, konnte in der Viskosität der Flüssigkeit unterscheiden. Für andere Materialien, müssen die optimalen Einstellungen für die Mikroinjektion, in erster Linie den Einspritzdruck und Einspritzzeitpunkt, empirisch ermittelt werden.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir bedanken uns herzlich die Mitglieder des Pal-Labor für die Unterstützung bei der Vorbereitung dieser Demonstration. Diese Studie wurde von PHS gewährt AI076684 und AI080615 von NIH / NIAID unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| Vertical glass puller | Narishige International | PC-10 | |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser Scientific | 3900 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Femtojet microinjector | Eppendorf | 920010504 | |
| Foot control FemtJet | Eppendorf | 920005098 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP665-1 | Filter-sterilized |
References
- Steere, A. C., Coburn, J., Glickstein, L. The emergence of Lyme disease. J Clin Invest. 113, 1093-1101 (2004).
- Barthold, S. W., Diego, C., Philipp, M. T. Borrelia, Molecular Biology, Host Interaction and Pathogenesis. Samuels, D. S., Radolf, J. D. , Caister Academic Press. Chapter 14 353-405 (2010).
- Pal, U. OspC facilitates Borrelia burgdorferi invasion of Ixodes scapularis salivary glands. J Clin Invest. 113, 220-230 (2004).
- Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete. J Exp Med. 199, 641-648 (2004).
- Zhang, X., Yang, X., Kumar, M., Pal, U. BB0323 function is essential for Borrelia burgdorferi virulence and persistence through tick-rodent transmission cycle. J Infect Dis. 200, 1318-1330 (2009).
- Pal, U. TROSPA, an Ixodes scapularis receptor for Borrelia burgdorferi. Cell. 119, 457-468 (2004).
- Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale J Biol Med. 57, 521-525 (1984).
- Narasimhan, S. Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 1141-1146 (2004).
- Narasimhan, S. A tick antioxidant facilitates the Lyme disease agent's successful migration from the mammalian host to the arthropod vector. Cell Host Microbe. 2, 7-18 (2007).
- Broadwater, A. H., Sonenshine, D. E., Hynes, W. L., Ceraul, S., DeSilva, A. Glass capillary tube feeding: a method for infecting nymphal Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) with the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. J Med Entomol. 39, 285-292 (2002).
- Policastro, P. F., Schwan, T. G. Experimental infection of Ixodes scapularis larvae (Acari: Ixodidae) by immersion in low passage cultures of Borrelia burgdorferi. J Med Entomol. 40, 364-370 (2003).
- Fuente, dela, Kocan, J., M, K., Almazan, C., Blouin, E. F. RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks. Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).
