Summary
莱姆病的研究往往需要一代感染的蜱与莱姆病螺旋体的病原体，这一过程通常需要几个星期的。在这里，我们展示了一个基于显微注射蜱感染过程，可在数小时内完成。我们也证明内蜱免疫荧光法在B的螺旋体原位本地化。
Abstract
莱姆病是由螺旋体的病原体伯氏疏螺旋体 ，保持它在本质上是由蜱灭鼠感染周期1感染引起的。蜱传播的小鼠模型已发展到在实验室中研究莱姆病。虽然天真蜱可感染与 B 螺旋体感染小鼠喂养，蜕皮过程需要几个星期到几个月才能完成。因此，发展更迅速，更高效的蜱感染技术，如显微注射为基础的程序，是为莱姆病3,4研究的重要工具。过程需要几个小时，以产生感染的蜱，并允许在同等数量的螺旋体的蜱队列交付的控制。这是B 的一代尤为重要螺旋体感染的蜱自然喂养利用老鼠进行的过程中失败，以确保100％的感染率和病原体的负担变化的潜在的结果除美联储蜱。此外，显微注射，可用于感染蜱与 B 螺旋体分离的情况下，弱毒株不能建立在小鼠体内的感染，并因此不能自然由蜱5收购。这种技术也可用于成蜱提供多种其他生物材料，例如，特异性抗体或双链RNA 6。在这篇文章中，我们将证明在体外生长B.若虫蜱显微注射螺旋体 。我们还将描述为莱姆病的病原体在蜱肠道使用共聚焦免疫荧光显微镜的本地化方法。
Protocol
1。微量注射若虫肩突硬蜱硬蜱
1。准备针
- 编造通过加热和1毫米的玻璃毛细管（世界精密仪器）拉在一个玻璃微管拉拔设备（Narishige）显微注射针。小心地取出毛细管脆弱。
- 商店在培养皿上胶带拉针（尖朝上）。
2。准备B。螺旋体
- 成长B。在BSK培养基7 螺旋体 ，直到浓度每毫升约10 7细胞。通过使用一个佩特罗夫Hausser计数室（Hausser科学）的螺旋体是一个暗视野显微镜下计数。
- 佩莱B。螺旋体 ，在室温为10分钟，在3000 XG离心。
- 去除上清液，并完全重新悬浮颗粒BSK媒体通过200μL无菌微尖 轻轻地传递到一个细胞每毫升10月9日的最后浓度。由于细胞重悬在高密度，可以聚集在一起，细胞悬液应当用于显微注射立即。
3。准备蜱
- 放置在玻片上明确，双面胶带。
- 在粘尘垫，小心取出若虫蜱，用小刷子的容器。
- 被注入胶带，腹侧，面临着同样的方向，将所需数量的滴答。
4。注射蜱
- 负载5μL的B.螺旋体进入拉毛细管针使用20μLmicroloader枪头（Eppendorf公司）的文化。检查气泡针和针头，如果有必要重新与细菌培养。
- 查看剔双目显微镜下解剖，并专注于打勾的肛门孔径面积。为了打破直径比打勾的肛门光圈稍微小一些，形成的显微注射针管，毛细管针的尖端轻轻触摸。这一步是至关重要的，因为任何试图与非适当的针头注入蜱造成伤害和死亡可能注入打勾。
- 双目显微镜下解剖固定蜱，并集中于肛门的光圈，这是由两个可移动的肛门板覆盖。用细镊子，轻轻触摸，非常温和的压力，适用于任何靠近肛门光圈的面积。这将使分离的肛门板和肛孔连接到肠道的开放。小心地插入肛门光圈针尖略，肛门板通过被迫开放。进针应保持在最低限度，玻璃尖可能会损坏半透明肠连接到直肠。使用配备有自动化控制脚（Eppendorf公司）一个微量，注入B。螺旋体的解决方案使用以下参数：1000百帕（HPA）注射压力，注射时间0.2秒和8百帕补偿压力。每个刻度接收单次注射。
- 蜱显微注射后，应做类似的预喷射状态。例如，剔爬在对刺激的反应。
- 我们通常允许蜱在24集的环境室，48小时内恢复16小时/ 8小时，光/暗光照疗法和95％湿度如果不可用，一腔注入蜱可在室温下保存在潮湿条件下，一个密封的容器内，如定期干燥器室，。如果有必要，蜱的恢复时间也可以缩短到几个小时前对小鼠喂养。
2。共聚焦免疫荧光显微镜的螺旋体本地化
1。解剖蜱
- 液滴放置的磷酸盐缓冲液（PBS）上一个干净的玻璃夹层和另一个幻灯片，在聚- L -赖氨酸涂层滑动显微镜（Sigma公司） 。准备另一载玻片双面胶带。
- 删除从容器中，并用一个小刷子双面胶带打勾。
- 查看和集中在解剖镜下打勾。将锋利的刀片上的第一和第二对腿之间的刻度。按下坚决削减两件允许访问的腹部剔。随即，淹没在腹部的PBS液滴。
- 用很细的镊子，切割现场周围抢背，腹的外骨骼。小心地拉出背盾，远离露出了褐色的彩色肠道憩室打勾。要小心，时刻保持下PBS解剖蜱。
- 半透明的唾液腺髻dles位于前的肠道地区的两侧，在这一点上，可以拆卸，如果需要的话。控股钳地方其余的外骨骼，小心地从腹部拉肠道。
- 轻轻地清洁肠道，消除任何被困的组织（例如，气管）。
- 用细镊子的尖端，迅速 转移的PBS液滴在聚- L -赖氨酸的载玻片上剔肠。分成较小的块用细刀片肠道，或用细镊子尖轻轻按下。小心吸肠组织周围多余的PBS。
- 允许肠道组织在室温空气干燥。
- 蜱肠道修复丙酮浸10分钟。允许在室温下干燥空气。幻灯片可以在-20 ° C储存在这一步几个月在一个密封的容器中。
2。染色
- 使用纸巾，周围的组织中删除多余的水分和子宫颈抹片钢笔或任何疏水屏障衬砌设备画一个圆圈围绕干剔肠。这将有助于保留在随后的孵化步骤染色解决方案。
- 封面与一个或几滴封闭液在室温为30分钟（0.05％Tween - 20的PBS中的5％山羊血清）打勾肠道。取决于阻塞血清抗体的宿主动物源。不要让幻灯片，从这个角度提出干。
- 慢慢吸封闭液。孵育肠道适当的小学和/或继发性的抗体解决方案。我们用异硫氰酸荧光素（FITC） -标记的抗- B。螺旋体抗体（Kirkegaard和佩里实验室）在1:100稀释阻塞在室温下1小时的缓冲。限制暴露在光线下用铝箔盖的容器。
- 卸下温柔的愿望抗体溶液。标签打勾组织，如4，“,6 - diamidino - 2 -苯基吲哚（DAPI）或碘化丙啶荧光染料孵育肠道。我们通常使用的PBS 20μg/ mL的碘化丙啶（Sigma公司），5分钟。在室温下。
- 0.05％吐温20的PBS洗3次。
- 山Slowfade（Invitrogen公司），如抗淬灭剂含有缓冲甘油的幻灯片，并仔细盖上玻璃盖玻片。幻灯片可以存储在一个密封的容器内一步几个月这4 ° C。图像和本地化B。共聚焦显微镜下一个螺旋体 。
3。代表性的成果
若虫蜱为显微注射的位置和图像代表 B。在蜱肠道螺旋体的定位是在图1 。
图1。显微注射法和B 的本地化螺旋体进入蜱肠道。
（一）一个若虫一，腹面观肩突硬蜱的位置进行显微注射。肛门光圈（箭头），用显微注射针插入（箭头）是根据插图的放大。罚款forcep使用，应用温和的压力身体，这使得肛门板块的分离和开放的显微注射肛门孔。针是充满了考马斯亮蓝的解决方案，以提高知名度。（二）代表B的免疫荧光共焦成像结果螺旋体内打勾肠道。肠道憩室前地区。标记与碘化丙啶（红色）或FITC标记的抗B.肠道原子核和螺旋体（箭头） 螺旋体 （绿色）。酒吧= 20微米。
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Discussion
在这里，我们展示一个基于显微注射过程快速，高效的蜱若虫硬蜱感染的细菌病原体B.螺旋体 。我们还描述了B 的检测共聚焦免疫程序螺旋体在蜱肠道原位 。虽然我们的演示涉及若虫肠道，类似的程序也适用其他蜱的发育阶段，如幼虫或成虫8,9 ，。然而，由于其较小的尺寸，该技术可能会比较具有挑战性的幼虫，但应在成年蜱适用。 与 B蜱人工感染其他方法螺旋体都得到发展，如通过玻璃毛细管10喂养或浸泡在培养基中11。这些方法是高效，简单和相对便宜的的。然而，这些程序依赖于B 的转移相对失控螺旋体成单个蜱，从而有可能被限制在与平等的病原体负担出没蜱的同伙。后者的缺点可能会显着更多的控制下交付程序，如显微注射，克服。在我们的实验室中，我们经常采用这种转移 B.程序成蜱的感染率近100％，而且大多数蜱螺旋体生存的过程。注入蜱可存放在实验室几个星期到几个月，或立即允许大吃对小鼠和传输B。螺旋体感染。 B 的效率和动力学螺旋体从显微注射蜱传播的类似自然感染的蜱，因此，人工蜱感染程序可能在我们努力学习蜱传播的莱姆borreliosis协助。此外，类似的显微注射技术也被应用于相关的实验目的，例如，RNA干扰介导的基因操纵蜱 6,9,12 。
微量注射蜱的不成熟阶段，是一个比较微妙的过程。因此，这是非常重要的验证，蜱与 B注入螺旋体是健康的，然后再继续下一组实验。注射后缩回腿蜱和刺激，如呼出的呼吸或用刷子触摸反应迟钝，不应该用于进一步的实验。这些都是最有可能死亡或注射创伤死亡的边缘。我们已经发现，针头和注射参数的大小的过程中的两个关键因素，较大的针尖和注射量，可能导致高打勾死亡率的肠壁破裂。同样重要的是要注意，这里描述的显微注射设置主要是注射 B.优化螺旋体悬浮在BSK媒体。其他生物材料，如抗体或集中的RNA解决方案，可能与流体的粘度。对于其他材料，最佳显微注射的设置，主要是注射压力和注射时间，需要凭经验确定。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
协助编制本示范的PAL实验室的成员，我们衷心感谢。这项研究是支持小灵通NIH / NIAID的赠款AI076684和AI080615。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| Vertical glass puller | Narishige International | PC-10 | |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser Scientific | 3900 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Femtojet microinjector | Eppendorf | 920010504 | |
| Foot control FemtJet | Eppendorf | 920005098 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP665-1 | Filter-sterilized |
References
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