Summary
ליים מחלות מחקר מחקרים לעיתים קרובות דורשים דור של קרציות נגוע הפתוגן Borrelia burgdorferi, תהליך זה לוקח בדרך כלל מספר שבועות. כאן אנו מדגימים microinjection מבוססי זיהום סמן הליך זה יכול להתבצע תוך שעות ספורות. אנחנו גם להדגים שיטה immunofluorescence עבור בלוקליזציה באתרו של B. burgdorferi בתוך קרציות.
Abstract
מחלת ליים נגרמת על ידי זיהום עם הפתוגן החיידק Borrelia burgdorferi, אשר נשמר בטבע על ידי מחזור קרציות מכרסם זיהום 1. מודל סמן נישאים Murine 2 פותחה ללמוד מחלת ליים במעבדה. בעוד קרציות נאיבי יכול להיות נגוע ב burgdorferi מאכילים אותם על עכברים נגועים, תהליך הנשירה לוקח מספר שבועות עד חודשים כדי להשלים. לכן, פיתוח מהיר ויעיל יותר זיהום טכניקות סמן, כגון הליך מבוסס microinjection-, הוא כלי חשוב לחקר מחלת ליים 3,4. ההליך דורש שעות רק כדי ליצור קרציות נגועות ומאפשר שליטה על אספקת כמויות שוות של שהחיידקים במדגם של קרציות. הדבר חשוב במיוחד כמו דור ב ' קרציות burgdorferi נגועים על ידי תהליך טבעי האכלה באמצעות עכברים נכשל כדי להבטיח שיעור זיהום 100% ואפשרות תוצאות וריאציה של הנטל בין הפתוגן קרציות נמאס. יתר על כן, microinjection ניתן להשתמש כדי להדביק קרציות עם B. burgdorferi מבודד במקרים בהם הלחץ נחלש אינו מסוגל להקים זיהום בעכברים ולכן לא ניתן לרכוש באופן טבעי על ידי קרציות 5. טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי לספק מגוון של חומרים ביולוגיים אחרים לתוך קרציות, למשל, נוגדנים ספציפיים או פעמיים תקועים RNA 6. במאמר זה נדגים את microinjection של קרציות nymphal עם במבחנה גדל ב burgdorferi. אנו גם מתארים שיטה לוקליזציה של פתוגנים מחלת ליים במעיים סמן באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence confocal.
Protocol
1. Microinjection של Nymphal קרציות קרצית scapularis
1. הכנת מחטים
- לפברק כמה מחטים microinjection ידי חימום ומושך 1 מ"מ צינורות זכוכית נימי (מכשירים העולם Precision) ב מכשיר micropipette חולץ זכוכית (Narishige). הסר בזהירות את צינורות נימי שביר.
- חנות משך מחטים (עם טיפ פונה כלפי מעלה) על דבק בצלחת פטרי.
2. הכנת B. burgdorferi
- לגדול ב burgdorferi ב BSK תרבות מדיה 7 עד בריכוז של כ -10 7 תאים לכל מ"ל. שהחיידקים נספרים תחת מיקרוסקופ כהה שדה על ידי שימוש Petroff-האוסר ספירת קאמרית (האוסר מדעית).
- גלולה B. burgdorferi ידי צנטריפוגה XG ב 3000 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר supernatant לחלוטין resuspend גלולה ב BSK מדיה ידי בעדינות עובר microtip 200 סטרילית μL לריכוז סופי של 10 9 תאים לכל מ"ל. מאז התאים resuspended על צפיפות התאים גבוהה, יכול גוש ביחד, על השעיית התא אמור לשמש microinjection מיד.
3. הכנת קרציות
- מקום ברור, דו צדדית דבק על זכוכית שקופית.
- עבודה על מחצלת דביק, להסיר בזהירות קרציות nymphal מן המיכל בעזרת מברשת קטנה.
- מניחים את המספר הנדרש של קרציות להיות מוזרק בקלטת דבק, בצד הגחוני למעלה, פונות לאותו כיוון.
4. הזרקת קרציות
- טען 5 μL של B. burgdorferi תרבות לתוך המחט נימי משך באמצעות 20 μL microloader פיפטה קצה (Eppendorf). בדוק את המחט על בועות אוויר שנלכדו וטען מחדש את המחט עם התרבות חיידקים, במידת הצורך.
- הצג את סמן תחת מיקרוסקופ המשקפת לנתח ולהתמקד באזור פתח פי הטבעת של סמן. לגעת בעדינות קצה המחט נימי כדי לשבור את הצינור שבו הקוטר הוא מעט קטן יותר מזה של הצמצם אנאלי של סמן, להרכיב את המחט microinjection. שלב זה הוא קריטי כמו כל ניסיון להזריק קרציות עם קצה שאינם מתאימים מחט גורמת למוות פגיעה אפשרית של סמן את מוזרק.
- מניחים את קרציות משותקת תחת מיקרוסקופ המשקפת לנתח ולהתמקד הצמצם אנאלי, אשר מכוסה על ידי שתי צלחות אנאלי מטלטלין. בעזרת מלקחיים בסדר, בעדינות לגעת להפעיל לחץ מתון מאוד לכל אזור ליד פתח פי הטבעת. זה יאפשר הפרדה של צלחות אנאלי ופתיחת נקבוביות אנאלי המתחבר במעיים. בזהירות להכניס את קצה המחט מעט לתוך הפתח אנאלי דרך הפתח הכפויה של צלחות אנאלי. החדרת המחט צריכה להיות מינימלית כמו קצה של כוס יכולה לגרום נזק במעי האחורי שקוף למחצה המתחבר פי הטבעת. שימוש microinjector מצויד בקרה אוטומטיות רגל (Eppendorf), להזריק B. burgdorferi פתרון באמצעות הפרמטרים הבאים: 1000 hectopascals (hPa) בלחץ הזרקה, 0.2 שניות זמן הזרקה בלחץ 8 hPa פיצויים. סמן מקבל זריקה אחת.
- בעקבות microinjection, קרציות צריך להתנהג בדומה למצב טרום הזריקה. לדוגמה, סמן את צריכה לזחול בתגובה לגירויים.
- אנחנו בדרך כלל מאפשרים קרציות כדי להתאושש במשך 48 שעות בחדר הסביבה נקבע על 24 מעלות צלזיוס עם 16 שעות / 8 שעות אור / חושך משטר photoperiod ולחות 95%. אם החדר אינו זמין, קרציות המוזרק יכול להיות מאוחסן בטמפרטורת החדר בתנאי לחות בתוך המיכל אוויר חזק, כגון חדר ייבוש רגיל. אם יש צורך, זמן ההחלמה של קרציות יכול גם להתקצר כמה שעות לפני המשמשת להזנת על עכברים.
2. B. burgdorferi לוקליזציה על ידי מיקרוסקופית immunofluorescence Confocal
1. הביתור קרציות
- המקום טיפה של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) בשקופית זכוכית נקי לנתיחה ועוד בשקופית poly-L-ליזין מצופה (Sigma) עבור מיקרוסקופ. הכן שקופית אחרת זכוכית עם קלטת דו צדדית דבק.
- יש להסיר אותה מן המיכל ומניחים על סרט דבק דו צדדית באמצעות מברשת קטנה.
- הצג למקד את סמן ב המיקרוסקופ לנתיחה. מקום סכין גילוח חד בהקפה בין זוגות הראשון והשני של הרגליים. ולחץ בחוזקה כלפי מטה חיתוך סמן בשני חלקים ומאפשר גישה הבטן. מיד להטביע את הבטן ב אגל של PBS.
- בעזרת מלקחיים יפה מאוד, לתפוס את שלד הגבי ו הגחון סביב האתר של החתך. משוך בזהירות את המגן הגבי מעלה הרחק סמן את חשיפת diverticula חום במעיים צבעוניים. הקפד לשמור על קרציות לנתח תחת PBS בכל עת.
- שקופה למחצה בלוטת הרוק לחמניהdles ממוקמים משני צדי באזור הקדמי של המעי, ניתן להסיר בשלב זה, אם תרצה בכך. החזקת שלד שנותרו במקום עם מלקחיים, שלוף בזהירות את המעיים החוצה מן הבטן.
- לנקות בעדינות את הבטן על ידי הסרת כל רקמות לכודים (למשל, קנה הנשימה).
- משתמש קצה של מלקחיים בסדר, במהירות העברת בטן סמן ב אגל של PBS בשקופית poly-L-ליזין זכוכית. הפרד את הבטן לחתיכות קטנות יותר באמצעות להבים קנס או ללחוץ בעדינות עם קצה מלקחיים בסדר. בזהירות לשאוב PBS עודף סביב רקמות הבטן.
- אפשר רקמות מעי לייבוש באוויר בטמפרטורת החדר.
- תקן את הבטן לתקתק על ידי הצללה של אצטון במשך 10 דקות. אפשר לייבוש באוויר בטמפרטורת החדר. שקופיות ניתן לאחסן בשלב הזה במשך חודשים -20 מעלות צלזיוס במיכל אוויר חזק.
2. הכתמה
- באמצעות נייר טישו, להסיר לחות עודפת סביב הרקמה ולצייר עיגול סביב במעיים סמן מיובש על ידי עט פאפ או כל מכשיר הידרופובי רירית המכשול. זה יעזור לשמור על פתרונות מכתים במהלך הדגירה הצעדים הבאים.
- מכסים את המעיים לתקתק עם אחד או כמה טיפות של חיץ חסימה (0.05% Tween-20, סרום עיזים 5% PBS) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסרום משמש חסימת תלויה במקורות של חיה המארח עבור הנוגדן. אין לאפשר שקופית להתייבש מרגע זה והלאה.
- לאט לאט לשאוב החיץ חסימה. דגירה המעיים עם ראשוני מתאים ו / או פתרונות נוגדנים משני. אנו משתמשים isothiocyanate והעמסת (FITC) - שכותרתו אנטי B. burgdorferi נוגדן (Kirkegaard & פרי מעבדות) בשעה דילול 1:100 ב חסימה חיץ במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. מכסים את מכולה עם רדיד אלומיניום להגביל את החשיפה לאור.
- הסר את הפתרון נוגדן ידי שאיפה עדינה. דגירה המעיים עם פלורסנט לצבוע לתקתק רקמות תווית, כגון 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) או יודיד propidium. בדרך כלל אנחנו משתמשים 20 מיקרוגרם / מ"ל יודיד propidium (Sigma) ב-PBS במשך 5 דקות. בטמפרטורת החדר.
- לשטוף 3 פעמים עם 0.05% Tween-20 ב-PBS.
- הר שקופית גליצרול שנאגרו המכיל מגיב antifade כגון Slowfade (Invitrogen) ובזהירות מכסים coverslip זכוכית. שקופיות יכול להיות מאוחסן בשלב זה במשך כמה חודשים על 4 מעלות צלזיוס בתוך מכולה אוויר חזק. תמונה בתרגום B. burgdorferi תחת מיקרוסקופ confocal.
3. נציג תוצאות
מיקום סמן nymphal עבור microinjection ותמונה המייצג B. לוקליזציה burgdorferi במעיים סמן מוצג באיור 1.
באיור 1. Microinjection ולוקליזציה של B. burgdorferi לתוך המעיים לתקתק.
(א) להציג הגחון של I. nymphal סמן scapularis ממוצבת עבור microinjection. אנאלי הצמצם (ראש חץ) עם מחט microinjection מוכנס (חץ) מוצג בהגדלה של הבלעה. המלקחיים קנס משמש להפעיל לחץ עדין על הגוף, אשר אפשרה הפרדת הצלחות אנאלי ופתיחת נקבוביות פי הטבעת עבור microinjection. המחט מלא בתמיסה של Coomassie כחול מבריק כדי לשפר את הראות. (ב) נציג תוצאות של הדמיה immunofluorescence confocal של B. burgdorferi בתוך הבטן לתקתק. באזור הקדמי של diverticulum מעי מוצג. גרעינים גוט ו שהחיידקים (חץ) מתויגים עם יודיד propidium (צבע אדום) או FITC-מצומדות אנטי B. burgdorferi (צבע ירוק), בהתאמה. בר = 20 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו להדגים הליך microinjection המבוסס על זיהום מהיר ויעיל של קרציות קרצית nymphal עם הפתוגן חיידקי B. burgdorferi. אנחנו גם לתאר הליך immunofluorescence confocal לצורך זיהוי של B. burgdorferi במעיים סמן באתרם. למרות ההפגנה שלנו כרוך בטן nymphal, נהלים דומים חלים גם על שלבי ההתפתחות השני של קרציות, כגון הזחל או מבוגרים 8,9. עם זאת, בשל גודל קטן שלהם, הטכניקה עשויה להיות מאתגרת יחסית לשימוש זחלים, אבל צריך להיות רלוונטי גם לשימוש קרציות מבוגר. שיטות אחרות של זיהום מלאכותי של קרציות עם B. burgdorferi פותחו, כגון האכלה דרך צינורות זכוכית נימי 10 או על ידי טבילה בינוני התרבות 11. שיטות אלה יעילות, פשוט וזול יחסית. ואולם, נהלים אלה מסתמכים על העברה לא מבוקרת יחסית של B. burgdorferi לתוך קרציות הפרט ולכן פוטנציאל מוגבלים ביצירת קבוצות של קרציות שורץ הנטל הפתוגן שווים. חיסרון האחרונים ניתן להתגבר באופן משמעותי יותר על ידי נהלים במסירה מבוקרת, כגון microinjection. במעבדה שלנו, אנחנו מעסיקים שגרתי בהליך זה כדי להעביר B. burgdorferi לתוך קרציות עם שיעורי זיהום של כמעט 100%, ורוב קרציות לשרוד את ההליך. קרציות המוזרק יכול להיות כל הזמן במעבדה במשך מספר שבועות עד חודשים, או מותר מיד להצטבר על עכברים ולהעביר B. burgdorferi זיהום. יעילות קינטיקה של B. שידור burgdorferi מ קרציות microinjected דומים של קרציות טבעי נגועים, ולכן מלאכותיים זיהום נהלים סמן צפויים לסייע מאמצינו ללמוד סמן נישאים borreliosis ליים. בנוסף, טכניקות microinjection דומה יש גם הוחל לצורך ניסויים הקשורים, למשל, התערבות RNA בתיווך מניפולציה גנטית של קרציות 6,9,12.
Microinjection של השלבים המוקדמים של קרציות היא הליך עדין יחסית. חשוב לכן לוודא כי קרציות הוזרקו ב burgdorferi בריאים לפני שתמשיך להגדיר הבא של הניסויים. פוסט מוזרק קרציות כי יש חזר רגליים מגיבים לגירויים, כגון נשיפה או נגיעה עם מברשת, לא אמור לשמש עבור ניסויים נוספים. אלה הם ככל הנראה מתים או על סף המוות מטראומה את הזריקה. מצאנו כי את הגודל של קצה המחט להזרקת הפרמטרים הם שני גורמים קריטיים ההליך, כמו טיפים מחט הזריקה כרכים גדולים שעלולים להיקרע בקיר הבטן וכתוצאה מכך סמן לתמותה גבוהה. חשוב גם לציין כי הגדרות microinjection שתוארו כאן הן מותאמות בעיקר הזרקת B. burgdorferi תלויה BSK התקשורת. חומרים ביולוגיים אחרים, כגון נוגדנים או מרוכז פתרונות RNA, יכול נבדלים צמיגות הנוזל. לגבי חומרים אחרים, את הגדרות microinjection אופטימלית, בעיקר את הלחץ הזרקת זמן הזרקה, צריך להיות נחוש אמפירית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנחנו מאוד מודים אנשי המעבדה פאל על הסיוע בהכנת ההפגנה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים PHS AI076684 ו AI080615 מ-NIH / NIAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| Vertical glass puller | Narishige International | PC-10 | |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser Scientific | 3900 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Femtojet microinjector | Eppendorf | 920010504 | |
| Foot control FemtJet | Eppendorf | 920005098 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP665-1 | Filter-sterilized |
References
- Steere, A. C., Coburn, J., Glickstein, L. The emergence of Lyme disease. J Clin Invest. 113, 1093-1101 (2004).
- Barthold, S. W., Diego, C., Philipp, M. T. Borrelia, Molecular Biology, Host Interaction and Pathogenesis. Samuels, D. S., Radolf, J. D. , Caister Academic Press. Chapter 14 353-405 (2010).
- Pal, U. OspC facilitates Borrelia burgdorferi invasion of Ixodes scapularis salivary glands. J Clin Invest. 113, 220-230 (2004).
- Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete. J Exp Med. 199, 641-648 (2004).
- Zhang, X., Yang, X., Kumar, M., Pal, U. BB0323 function is essential for Borrelia burgdorferi virulence and persistence through tick-rodent transmission cycle. J Infect Dis. 200, 1318-1330 (2009).
- Pal, U. TROSPA, an Ixodes scapularis receptor for Borrelia burgdorferi. Cell. 119, 457-468 (2004).
- Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale J Biol Med. 57, 521-525 (1984).
- Narasimhan, S. Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 1141-1146 (2004).
- Narasimhan, S. A tick antioxidant facilitates the Lyme disease agent's successful migration from the mammalian host to the arthropod vector. Cell Host Microbe. 2, 7-18 (2007).
- Broadwater, A. H., Sonenshine, D. E., Hynes, W. L., Ceraul, S., DeSilva, A. Glass capillary tube feeding: a method for infecting nymphal Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) with the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. J Med Entomol. 39, 285-292 (2002).
- Policastro, P. F., Schwan, T. G. Experimental infection of Ixodes scapularis larvae (Acari: Ixodidae) by immersion in low passage cultures of Borrelia burgdorferi. J Med Entomol. 40, 364-370 (2003).
- Fuente, dela, Kocan, J., M, K., Almazan, C., Blouin, E. F. RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks. Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).
