Summary
Des études de Lyme recherche sur les maladies nécessitent souvent de génération de tiques infectées par l'agent pathogène Borrelia burgdorferi, un processus qui prend généralement plusieurs semaines. Ici nous démontrons une procédure basée sur la microinjection tic infection qui peut être accompli en quelques heures. Nous démontrons également une méthode d'immunofluorescence pour la localisation in situ de B. burgdorferi dans les tiques.
Abstract
La maladie de Lyme est causée par une infection par le spirochète pathogène Borrelia burgdorferi, qui est maintenu dans la nature par un cycle d'infection chez les rongeurs tic-1. Un modèle murin tiques 2 a été développé pour étudier la maladie de Lyme dans le laboratoire. Alors que les tiques peuvent être naïfs infectés par B. burgdorferi en les nourrissant sur des souris infectées, le processus de mue prend plusieurs semaines à plusieurs mois à compléter. Par conséquent, le développement des plus rapides et plus efficaces les techniques infection des tiques, comme une procédure basée sur la micro-injection, est un outil important pour l'étude de la maladie de Lyme 3,4. La procédure nécessite quelques heures seulement de générer des tiques infectées et permet de contrôler la livraison des quantités égales de spirochètes dans une cohorte de tiques. Ceci est particulièrement important que la génération de B. tiques infectées burgdorferi par le processus d'alimentation naturelle en utilisant des souris ne parvient pas à assurer un taux d'infection de 100% et potentiellement entraîne une variation de la charge de pathogènes chez les tiques nourries. Par ailleurs, la microinjection peut être utilisé pour infecter les tiques avec B. burgdorferi des isolats dans les cas où une souche atténuée est incapable d'établir une infection chez les souris et donc ne peut pas être acquise naturellement par les tiques 5. Cette technique peut également être utilisé pour offrir une variété d'autres matériaux biologiques dans les tiques, par exemple, des anticorps spécifiques ou l'ARN double brin 6. Dans cet article, nous allons démontrer la microinjection de tiques nymphes aux in vitro grandi B. burgdorferi. Nous allons également décrire une méthode pour la localisation de la maladie de Lyme pathogènes dans l'intestin tic utilisant microscopie confocale à immunofluorescence.
Protocol
1. Microinjection de la tique Ixodes scapularis nymphes
1. Préparation des aiguilles
- Fabriquer des aiguilles de microinjection plusieurs reprises par le chauffage et en tirant une des tubes de verre mm capillaire (instruments de précision du monde) dans un dispositif en verre micropipette extracteur (Narishige). Retirer délicatement les tubes capillaires fragiles.
- Boutique tiré aiguilles (avec la pointe dirigée vers le haut) sur une bande adhésive dans une boîte de Pétri.
2. Préparation B. burgdorferi
- Cultivez B. burgdorferi dans les milieux de culture BSK 7 jusqu'à ce que, à une concentration d'environ 10 7 cellules par ml. Spirochètes sont comptés sous un microscope en champ sombre par l'utilisation d'un comptage Petroff-Hausser chambre (Hausser scientifique).
- Pellet B. burgdorferi par centrifugation à 3000 xg pendant 10 minutes à température ambiante.
- Retirer le surnageant et complètement resuspendre le culot dans BSK médias doucement en passant par une micropointe stériles 200 uL d'une concentration finale de 10 9 cellules par ml. Puisque les cellules sont remises en suspension à haute densité cellulaire, et pourrait s'agglomérer, la suspension cellulaire doit être utilisé pour la microinjection immédiatement.
3. Tiques Préparation
- Placez claire, ruban adhésif double-face sur une lame de verre.
- Travailler sur un tapis collant, retirez soigneusement les tiques nymphes du conteneur à l'aide d'une petite brosse.
- Placez le nombre requis de tiques pour être injecté sur le ruban adhésif, la face ventrale en place, dans la même direction.
4. Tiques par injection
- Charge 5 uL de la B. la culture burgdorferi dans l'aiguille tiré capillaire en utilisant un 20 uL microloader pointe de la pipette (Eppendorf). Inspectez l'aiguille des bulles d'air piégées et recharger l'aiguille avec une culture bactérienne, si nécessaire.
- Voir la tique sous le microscope binoculaire de dissection et de se concentrer sur la zone de la tique ouverture anale. Toucher doucement le bout de l'aiguille capillaire afin de briser le tube dont le diamètre est légèrement plus petit que celui de l'ouverture anale de la tique, formant l'aiguille de microinjection. Cette étape est essentielle car toute tentative d'injecter les tiques avec une pointe d'aiguille non appropriée entraîne la mort des blessures et possibles de la tique injecté.
- Placez les tiques immobilisé sous le microscope binoculaire de dissection et de se concentrer sur l'ouverture anale, qui est couvert par deux plaques anales mobiliers. En utilisant une pince fine, toucher doucement et appliquer une pression très légère à une zone près de l'ouverture anale. Cela permettra la séparation des plaques anales et l'ouverture des pores anaux qui se connecte à l'intestin. Insérez soigneusement la pointe de l'aiguille légèrement dans l'ouverture anale par l'ouverture forcée des plaques anales. Insertion de l'aiguille doit être maintenue à un minimum, car la pointe de verre peut endommager l'intestin postérieur semi qui se connecte au rectum. L'utilisation d'un microinjecteur équipé d'un contrôle automatisé du pied (Eppendorf), injecter B. solution burgdorferi utilisant les paramètres suivants: 1 000 hectopascals (hPa) la pression d'injection, temps d'injection 0,2 secondes et 8 compensation de pression hPa. Chaque graduation reçoit une injection unique.
- Après microinjection, les tiques doivent se comporter similaire à l'état pré-injection. Par exemple, la tique doit ramper dans la réponse aux stimuli.
- Nous accordons habituellement les tiques de récupérer pendant 48 heures dans une chambre environnementale fixée à 24 ° C avec 16 heures / 8 heures de lumière / obscurité régime de photopériode et de 95% d'humidité. Si une chambre n'est pas disponible, les tiques injectées pourraient être stockés à température ambiante dans des conditions humides dans un contenant hermétique, comme une chambre régulière dessicateur. Si nécessaire, le temps de récupération des tiques pourrait également être réduite à quelques heures avant utilisé pour l'alimentation sur des souris.
2. B. Localisation burgdorferi par immunofluorescence confocale
1. Tiques de dissection
- Placez une goutte de tampon phosphate salin (PBS) sur une lame de verre propre pour la dissection et l'autre sur une lame de poly-L-lysine couché (Sigma) pour la microscopie. Préparer une autre lame de verre avec du ruban adhésif double-face.
- Retirer la tique du récipient et le placer sur un ruban adhésif double-face en utilisant une petite brosse.
- Voir et se concentrer la tique dans le microscope de dissection. Placer une lame de rasoir sur la tique entre la première et seconde paires de pattes. Appuyez fermement couper la tique dans deux pièces permettant l'accès à l'abdomen. Immédiatement, submerger l'abdomen dans une goutte de PBS.
- En utilisant des pinces très fines, prenez l'exosquelette dorsale et ventrale autour du site de la coupe. Retirez soigneusement le bouclier dorsal haut et loin de la tique exposant les diverticules intestinales brunâtre. Veillez à garder les tiques dissection sous le PBS, à tout moment.
- Le chignon semi-translucide glande salivairedles sont situés de chaque côté de la région antérieure de l'intestin, et peut être retirée à ce stade, si désiré. Tenir l'exosquelette restant en place avec une pince, tirez délicatement sur le tube digestif à partir de l'abdomen.
- Nettoyez délicatement l'intestin en éliminant tous les tissus piégés (par exemple, la trachée).
- Avec la pointe d'une pince fine, transférer rapidement l'intestin cocher dans une goutte de PBS sur une lame de verre poly-L-lysine. Séparez les intestins en petits morceaux à l'aide de fines lames ou appuyant doucement avec le bout de pinces fines. Aspirer délicatement l'excès de PBS dans le tissus du tube digestif.
- Laisser le tissus du tube digestif à l'air sec à température ambiante.
- Fixer l'intestin tique par immersion dans l'acétone pendant 10 minutes. Laisser sécher à l'air à température ambiante. Les diapositives peuvent être conservés à cette étape pour les mois à -20 ° C dans un contenant hermétique.
2. Coloration
- Utiliser du papier de soie, enlever l'excès d'humidité autour du tissu et dessinez un cercle autour de l'intestin tic séchée par un pap-stylo ou tout autre dispositif de barrière hydrophobe doublure. Cela aidera à retenir les solutions de coloration au cours des étapes d'incubation ultérieures.
- Couverture de l'intestin tique avec un ou quelques gouttes de tampon de blocage (0,05% de Tween-20, du sérum de chèvre 5% dans du PBS) pendant 30 minutes à température ambiante. Le sérum utilisé pour le blocage dépend de la source de l'animal hôte pour l'anticorps. Ne pas laisser la lame sécher à partir de ce moment.
- Lentement aspirer le tampon de blocage. Incuber le tube digestif avec des primaires appropriés et / ou solutions d'anticorps secondaire. Nous utilisons l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) - anticorps anti-B burgdorferi anticorps (Kirkegaard & Perry Laboratories) à une dilution 1:100 dans du tampon de blocage pendant 1 heure à température ambiante. Couvrez le récipient avec du papier aluminium pour limiter l'exposition à la lumière.
- Retirer la solution d'anticorps par aspiration douce. Incuber le tube digestif avec un colorant fluorescent aux tissus cochez l'étiquette, tel que 4 ',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ou de l'iodure de propidium. Nous utilisons normalement 20 mg / ml d'iodure de propidium (Sigma) dans du PBS pendant 5 min. à température ambiante.
- Laver 3 fois avec 0,05% de Tween-20 dans du PBS.
- Montez le glisser dans le glycérol tamponnée contenant un réactif Antifade tels que Slowfade (Invitrogen) et soigneusement couvrir avec une lamelle de verre. Les diapositives peuvent être conservés à cette étape pour quelques mois à 4 ° C dans un contenant hermétique. Image et de localiser B. burgdorferi sous un microscope confocal.
3. Les résultats représentatifs
Position d'une tique nymphe pour la microinjection et une image représentant B. localisation burgdorferi dans l'intestin tique est présenté dans la Figure 1.
Figure 1. Microinjection et la localisation de B. burgdorferi dans l'intestin des tiques.
(A) Vue ventrale d'une nymphe I. Cochez scapularis positionné pour la microinjection. Anal ouverture (flèche) avec une aiguille insérée microinjection (flèche) est montré sous un grossissement de l'encart. Une pince fine est utilisé pour appliquer une légère pression sur le corps, ce qui a permis la séparation des plaques anales et l'ouverture de l'anus pour la microinjection. L'aiguille est remplie avec une solution de bleu de Coomassie pour améliorer la visibilité. (B) Les résultats représentatifs de l'imagerie confocale par immunofluorescence de B. burgdorferi dans les intestins de tiques. Région antérieure d'un diverticule intestinal est montré. Noyaux Gut et spirochètes (flèche) sont marqués avec de l'iodure de propidium (couleur rouge) ou FITC conjugué anti-B. burgdorferi (couleur verte), respectivement. Barre = 20 um.
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Discussion
Ici nous démontrons une procédure basée sur la micro-injection d'infection rapide et efficace de la tique Ixodes nymphes avec la bactérie pathogène B. burgdorferi. Nous décrivons également une procédure d'immunofluorescence confocale pour la détection de B. burgdorferi dans l'intestin tic in situ. Bien que notre démonstration implique l'intestin nymphes, des procédures similaires sont également applicables à d'autres stades de développement des tiques, comme la larve ou adulte 8,9. Toutefois, en raison de leur petite taille, la technique peut être relativement difficile à utiliser dans les larves, mais doivent être bien applicable pour une utilisation dans des tiques adultes. D'autres méthodes d'infection artificielle de tiques avec B. burgdorferi ont été développés, tels que l'alimentation à travers les tubes capillaires en verre 10 ou par immersion dans le milieu de culture 11. Ces méthodes sont efficaces, simples et relativement peu coûteux. Toutefois, ces procédures s'appuient sur le transfert relativement incontrôlée de B. burgdorferi dans les tiques individuelles et donc potentiellement sont limités en générant des cohortes de tiques infestées de charges égales pathogène. La lacune dernier pourrait être substantiellement surmontée par plusieurs procédures de livraison contrôlée, telles que la microinjection. Dans notre laboratoire, nous avons systématiquement employer cette procédure de transfert B. burgdorferi dans les tiques avec des taux d'infection de près de 100%, et la plupart des tiques survivre à la procédure. Tiques injectées peuvent être conservés dans le laboratoire pendant plusieurs semaines à plusieurs mois, ou immédiatement autorisés à engorger sur des souris et de transmettre B. l'infection burgdorferi. L'efficacité et la cinétique de B. la transmission des tiques microinjectés burgdorferi sont similaires à celles des tiques infectés naturellement, et par conséquent, des procédures artificielles infection des tiques sont susceptibles de nous aider dans nos efforts visant à étudier les tiques borréliose de Lyme. En outre, les techniques de microinjection similaires ont également été appliquée pour des fins expérimentales liées, par exemple, l'interférence ARN médiée par la manipulation génétique des tiques 6,9,12.
Microinjection des stades immatures de tiques est une procédure relativement délicate. Il est donc important de vérifier que les tiques injectées avec B. burgdorferi sont en bonne santé avant de procéder à la prochaine série d'expériences. Post-tiques qui ont injecté rétracté jambes et sont insensibles aux stimuli, tels que l'air expiré ou en touchant avec un pinceau, ne doit pas être utilisé pour d'autres expériences. Ces sont les plus susceptibles morts ou sur le point de mourir du traumatisme d'injection. Nous avons constaté que la taille de la pointe de l'aiguille et les paramètres d'injection sont les deux facteurs décisifs de la procédure, comme pointes d'aiguille et de grands volumes d'injection pourrait potentiellement une rupture de la paroi intestinale résultant de la mortalité tic élevé. Il est également important de noter que les paramètres microinjection décrites ici sont avant tout optimisé pour l'injection de B. burgdorferi en suspension dans BSK médias. D'autres matériaux biologiques, tels que des anticorps ou des solutions concentrées d'ARN, pourraient différer considérablement de la viscosité du fluide. Pour les autres matériaux, les paramètres optimaux de microinjection, principalement la pression d'injection et le temps d'injection, doivent être déterminées empiriquement.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions sincèrement les membres du laboratoire Pal pour l'aide à la préparation de cette manifestation. Cette étude a été soutenue par PHS subventions AI076684 et AI080615 de NIH / NIAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| Vertical glass puller | Narishige International | PC-10 | |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser Scientific | 3900 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Femtojet microinjector | Eppendorf | 920010504 | |
| Foot control FemtJet | Eppendorf | 920005098 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP665-1 | Filter-sterilized |
References
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