Summary
Malattia di Lyme studi di ricerca spesso richiedono la generazione di zecche infette dal patogeno Borrelia burgdorferi, un processo che richiede in genere diverse settimane. Qui si dimostrano una microiniezione procedura basata infezione zecca che può essere compiuto entro poche ore. Abbiamo anche dimostrare un metodo di immunofluorescenza per la localizzazione in situ di B. burgdorferi in zecche.
Abstract
La malattia di Lyme è causata da infezione con il patogeno spirocheta Borrelia burgdorferi, che è mantenuto in natura da una zecca-roditore ciclo di infezione 1. Un zecche modello murino 2 è stato sviluppato per studiare la malattia di Lyme in laboratorio. Mentre zecche ingenuo può essere infettato con B. burgdorferi nutrendole sui topi infetti, il processo di muta impiega diverse settimane o mesi per essere completata. Pertanto, lo sviluppo di tecniche di zecca più rapido ed efficace l'infezione, come una procedura di microiniezione-based, è uno strumento importante per lo studio della malattia di Lyme 3,4. La procedura richiede ore solo per generare zecche infette e consente di controllare l'erogazione di quantità uguali di spirochete in una coorte di zecche. Ciò è particolarmente importante come la generazione di B. burgdorferi zecche infette dal processo di alimentazione naturale usando topi non riesce a garantire tasso di infezione del 100% e, potenzialmente, si traduce in variazione di carico patogeno tra zecche nutriti. Inoltre, la microiniezione può essere usato per infettare le zecche con B. burgdorferi isola nei casi in cui un ceppo attenuato non è in grado di stabilire l'infezione nei topi e quindi non può essere acquisita naturalmente dalle zecche 5. Questa tecnica può essere utilizzata anche per fornire una varietà di altri materiali biologici in zecche, per esempio, gli anticorpi specifici o di RNA a doppio filamento 6. In questo articolo, ci dimostrerà la microiniezione di zecche ninfale con in vitro-grown B. burgdorferi. Ci sarà anche descrivere un metodo per la localizzazione di agenti patogeni della malattia di Lyme nell'intestino zecca con microscopia confocale immunofluorescenza.
Protocol
1. Microiniezione di ninfale zecche Ixodes scapularis
1. Aghi preparazione
- Fabbricare aghi microiniezione diversi dal riscaldamento e tirando 1 tubi di vetro capillari mm (Strumenti di precisione World) in un dispositivo di vetro micropipetta estrattore (Narishige). Rimuovere con attenzione i tubi capillari fragili.
- Conservare tirato aghi (con punta rivolta verso l'alto) sul nastro adesivo in una capsula di Petri.
2. Preparazione B. burgdorferi
- Crescere B. burgdorferi in BSK cultura mediatica 7 fino ad una concentrazione di circa 10 7 cellule per ml. Spirochete sono contati con un microscopio a campo oscuro con l'uso di una camera di conteggio Petroff-Hausser (Hausser scientifica).
- Pellet B. burgdorferi mediante centrifugazione a 3.000 xg per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere il surnatante e risospendere completamente il pellet in BSK mezzi delicatamente passando attraverso un microtip 200 ul sterile ad una concentrazione finale di 10 9 cellule per ml. Dal momento che le cellule sono risospese ad alta densità cellulare, e potrebbero raggrupparsi insieme, la sospensione cellulare deve essere utilizzato per microiniezione immediatamente.
3. Preparare le zecche
- Collocazione chiara, su due lati del nastro adesivo su un vetrino.
- Lavorare su un tappetino, rimuovere con attenzione le zecche ninfale dal contenitore con un pennello di piccole dimensioni.
- Collocare il numero di zecche da iniettare sul nastro adesivo, lato ventrale in su, verso la stessa direzione.
4. Zecche iniettando
- Di carico 5 microlitri della B. cultura burgdorferi in l'ago tirato capillare utilizzando un 20 l microloader puntale (Eppendorf). Controllare l'ago bolle d'aria intrappolate e ricaricare l'ago con coltura batterica, se necessario.
- Mostra il segno di spunta sotto il microscopio binoculare da dissezione e concentrarsi sulla zona anale apertura della zecca. Delicatamente toccare la punta dell'ago capillare al fine di rompere il tubo in cui il diametro è leggermente inferiore a quello di apertura anale della zecca, formando l'ago microiniezione. Questo passaggio è fondamentale, come ogni tentativo di iniettare le zecche con un non adeguato punta dell'ago provoca la morte e possibili lesioni della zecca iniettato.
- Posizionare le zecche immobilizzato sotto il microscopio binoculare da dissezione e mettere a fuoco l'apertura anale, che è coperto da due piastre mobili anale. Utilizzando una pinza sottile, toccare delicatamente e applicare una pressione molto lieve a qualsiasi area nei pressi di apertura anale. Questo permetterà la separazione delle placche anali e apertura del poro anale che si collega l'intestino. Inserire con attenzione la punta dell'ago leggermente in apertura anale attraverso l'apertura forzata delle piastre anale. L'inserimento dell'ago dovrebbe essere ridotto al minimo come la punta di vetro potrebbe danneggiare il hindgut semitrasparente che si connette al retto. Utilizzando un microinjector dotato di comando a pedale automatico (Eppendorf), iniettare B. burgdorferi soluzione utilizzando i seguenti parametri: 1.000 ettopascal (hPa) pressione di iniezione, iniezione di 0,2 secondi di tempo e 8 compensazione della pressione hPa. Ogni tick riceve una sola iniezione.
- In seguito a microiniezione, le zecche dovrebbero comportarsi simile a quello pre-iniezione di stato. Ad esempio, il segno di spunta dovrebbe strisciare in risposta agli stimoli.
- Noi di solito permettono di recuperare le zecche per 48 ore in una camera climatica impostata a 24 ° C con 16 ore / 8 ore di luce / buio regime di fotoperiodo e il 95% di umidità. Se una camera non è disponibile, zecche iniettato può essere conservato a temperatura ambiente in condizioni di umidità all'interno di un contenitore a tenuta stagna, come una camera di essiccatore regolare. Se necessario, i tempi di recupero delle zecche potrebbe anche essere ridotto a poche ore prima utilizzata per l'alimentazione sui topi.
2. B. Localizzazione burgdorferi da microscopia di immunofluorescenza confocale
1. Zecche dissezione
- Mettere una goccia di tampone fosfato (PBS) su un vetrino pulito per la dissezione e l'altro su una poli-L-lisina scivolo rivestito (Sigma) per microscopia. Preparare un altro vetrino con doppio nastro adesivo.
- Togliere il segno di spunta dal contenitore e luogo due lati del nastro adesivo con un pennello di piccole dimensioni.
- Visualizza e mettere a fuoco il segno di spunta al microscopio dissezione. Inserire una lama affilata rasoio sul segno di spunta tra le coppie prima e la seconda di gambe. Premere con decisione taglio il segno di spunta in due pezzi che permette l'accesso all'addome. Immediatamente, immergere l'addome in una goccia di PBS.
- Utilizzando pinze molto fine, afferrare l'esoscheletro dorsale e ventrale intorno al sito del taglio. Estrarre con cautela lo scudo dorsale alto e lontano dalla zecca di esporre il diverticoli intestinali bruno colore. Fare attenzione a tenere le zecche dissezione sotto il PBS in ogni momento.
- Il semi-trasparente panino ghiandole salivaridles si trovano su entrambi i lati della regione anteriore dell'intestino, e può essere rimosso, a questo punto, se lo si desidera. Tenendo l'esoscheletro rimanere al loro posto con una pinza, estrarre con cautela l'intestino fuori dall'addome.
- Pulire delicatamente l'intestino rimuovendo i tessuti intrappolati (ad esempio, trachea).
- Utilizzando la punta di una pinza sottile, trasferire rapidamente l'intestino zecca in una goccia di PBS su un poli-L-lisina vetrino. Separare l'intestino in pezzi più piccoli con lame fine o premendo delicatamente con la punta di una pinza sottile. Con attenzione aspirare l'eccesso di PBS in tutto il tessuto intestinale.
- Lasciare i tessuti dell'intestino di aria secca a temperatura ambiente.
- Fissare l'intestino tick immergendo in acetone per 10 minuti. Lasciare asciugare a temperatura ambiente. Le diapositive possono essere conservati a questo passaggio per mesi a -20 ° C in un contenitore a tenuta stagna.
2. Colorazione
- Utilizzando la carta velina, rimuovere l'umidità in eccesso in tutto il tessuto e disegna un cerchio intorno l'intestino tick secco da un pap-penna o un qualsiasi dispositivo di rivestimento idrofobo barriera. Ciò contribuirà a mantenere le soluzioni colorazione durante le fasi di incubazione successive.
- Coprire l'intestino barrare con una o poche gocce di tampone di bloccaggio (0,05% di Tween-20, siero di capra al 5% in PBS) per 30 minuti a temperatura ambiente. Il siero utilizzato per bloccare dipende dalla fonte di animale ospite per l'anticorpo. Non lasciare che il vetrino si asciughi da questo punto in avanti.
- Lentamente aspirare il tampone di bloccaggio. Incubare l'intestino con primario adeguato e / o soluzioni anticorpo secondario. Noi usiamo isotiocianato di fluoresceina (FITC) - marcato anti-B. burgdorferi anticorpi (Kirkegaard & Perry Laboratories) alla diluizione 1:100 in tampone bloccante per 1 ora a temperatura ambiente. Coprire il recipiente con un foglio di alluminio per limitare l'esposizione alla luce.
- Rimuovere la soluzione di anticorpi da aspirazione delicata. Incubare l'intestino con un colorante fluorescente ai tessuti zecca etichetta, ad esempio 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) o ioduro di propidio. Usiamo normalmente 20 mg / ml di ioduro di propidio (Sigma) in PBS per 5 min. a temperatura ambiente.
- Lavare 3 volte con 0,05% di Tween-20 in PBS.
- Montare il vetrino in glicerolo tamponata contenente un reagente Antifade come Slowfade (Invitrogen) e coprire accuratamente con coprioggetto di vetro. Le diapositive possono essere conservati a questo passaggio per qualche mese a 4 ° C all'interno di un contenitore a tenuta stagna. Immagine e localizzare B. burgdorferi al microscopio confocale.
3. Rappresentante Risultati
Posizione di un tick ninfale per microiniezione e un'immagine che rappresenta B. localizzazione burgdorferi nell'intestino zecca è presentato in Figura 1.
Figura 1. Microiniezione e localizzazione di B. burgdorferi nell'intestino zecca.
(A) Vista ventrale di una ninfa I. tick scapularis posizionato per microiniezione. Anal apertura (freccia) con ago microiniezione inserito (freccia) viene mostrata sotto ingrandimento nel riquadro. Una pinza fine è utilizzato per applicare una leggera pressione sul corpo, che ha permesso la separazione delle piastre anale e apertura del poro anale per microiniezione. L'ago viene riempito con una soluzione di Coomassie Brilliant Blue per migliorare la visibilità. (B) I risultati rappresentativi di immunofluorescenza confocale immagini di B. burgdorferi all'interno dell'intestino tick. Regione anteriore di un diverticolo intestinale viene mostrato. Nuclei Gut e spirochete (freccia) sono etichettati con ioduro di propidio (colore rosso) o FITC-coniugato anti-B. burgdorferi (colore verde), rispettivamente. Bar = 20 micron.
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Discussion
Qui si dimostrano una microiniezione procedura basata per l'infezione rapida ed efficiente dei ninfale zecche Ixodes con il batterio patogeno B. burgdorferi. Abbiamo anche descrivere una procedura di immunofluorescenza confocale per il rilevamento di B. burgdorferi nell'intestino zecca in situ. Anche se la nostra manifestazione coinvolge intestino ninfale, procedure simili sono applicabili anche per le altre fasi di sviluppo delle zecche, come larve o gli adulti 8,9. Tuttavia, a causa di dimensioni più ridotte, la tecnica può essere relativamente difficile per l'uso in larve, ma dovrebbe essere applicabile anche per l'uso in zecche adulte. Altri metodi di infezione artificiale di zecche con B. burgdorferi sono stati sviluppati, come l'alimentazione tramite tubi di vetro capillari 10 o per immersione nel terreno di coltura 11. Questi metodi sono efficaci, semplici e relativamente poco costoso. Tuttavia, queste procedure si basano sul trasferimento relativamente incontrollata di B. burgdorferi nelle zecche individuali e quindi potenzialmente sono limitati a generare coorti di zecche infestate da oneri pari patogeno. Il difetto ultimi potrebbero essere sostanzialmente superata da più procedure di consegna controllata, come la microiniezione. Nel nostro laboratorio, abbiamo regolarmente impiegano questa procedura per trasferire B. burgdorferi nelle zecche con tassi di infezione di circa il 100%, e la maggior parte zecche sopravvivere alla procedura. Zecche iniettato può essere conservato in laboratorio per diverse settimane o mesi, o immediatamente permesso di congestionare sui topi e trasmettere B. burgdorferi infezione. L'efficienza e la cinetica di B. trasmissione burgdorferi da zecche microiniettati sono simili a quelle di zecche naturalmente infetti e, quindi, le procedure di infezione artificiale tick sono elementi utili i nostri sforzi per studiare zecche borreliosi di Lyme. Inoltre, le tecniche di microiniezione simili sono anche stati richiesti relativi a fini sperimentali, per esempio, l'interferenza RNA-mediata manipolazione genetica di zecche 6,9,12.
Microiniezione degli stadi immaturi delle zecche è una procedura relativamente delicato. E 'quindi importante verificare che le zecche iniettato con B. burgdorferi sono sani prima di procedere con la prossima serie di esperimenti. Post-iniezione zecche che hanno ritrattato le gambe e sono insensibili agli stimoli, come espirata o toccando con un pennello, non deve essere utilizzato per ulteriori esperimenti. Questi sono probabilmente morti o sul punto di morire a causa del trauma di iniezione. Abbiamo scoperto che le dimensioni della punta dell'ago e parametri di iniezione sono i due fattori critici della procedura, come punte aghi più grandi e volumi di iniezione potrebbe rottura della parete intestinale con conseguente elevata mortalità tick. E 'anche importante notare che le impostazioni microiniezione qui descritte sono principalmente ottimizzati per l'iniezione B. burgdorferi sospeso in BSK media. Altri materiali biologici, come gli anticorpi o soluzioni concentrate di RNA potrebbero differire in viscosità del fluido. Per altri materiali, le impostazioni ottimali microiniezione, in primo luogo la pressione di iniezione e il tempo di iniezione, devono essere determinati empiricamente.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo sinceramente i membri del laboratorio Pal per l'assistenza con la preparazione di questa manifestazione. Questo studio è stato supportato da PHS concede AI076684 e AI080615 dal NIH / NIAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| Vertical glass puller | Narishige International | PC-10 | |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser Scientific | 3900 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Femtojet microinjector | Eppendorf | 920010504 | |
| Foot control FemtJet | Eppendorf | 920005098 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP665-1 | Filter-sterilized |
References
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