Summary
라임 질병 연구 조사는 종종 병원체 Borrelia burgdorferi, 일반적으로 몇 주 정도 소요 프로세스에 감염된 진드기의 생성을 필요로합니다. 여기 시간 이내에 수행할 수 있습니다 microinjection 기반 틱 감염 절차를 보여줍니다. 우리는 또한 진드기 이내 B. burgdorferi의 현장 지방화에 대한 immunofluorescence 방법을 보여줍니다.
Abstract
라임 병은 진드기 - 설치류 감염 사이클 1 자연 유지 spirochete 병원체 Borrelia burgdorferi와 감염에 의해 발생합니다. 틱 - 부담 murine 모델 2 실험실에서 라임 병을 연구하기 위해 개발되었습니다. 나이브 진드기는 B.에 감염 될 수 있지만 burgdorferi 감염 생쥐에서 그들을 먹이로, 털갈이 과정을 완료하는 데 개월 몇 주간 소요됩니다. 따라서, 이러한 microinjection 기반의 프로 시저로보다 신속하고 효율적인 틱 감염 기법의 개발 라임 질병 3,4의 연구를위한 중요한 도구입니다. 절차는 시간이 감염된 진드기를 생성하기 위해 필요하며 진드기의 코호트에서 spirochetes의 동일한 수량의 배달 제어할 수 있습니다. 이것은 B.의 세대로서 특히 중요합니다 마우스를 사용하여 자연적인 먹이 프로세스 burgdorferi 감염 진드기는 먹이 거려 사이에 병원균 부담의 변화 100 %의 감염 속도와 잠재적 결과를 보장하기 위해 실패합니다. 또한, microinjection은 B.와 진드기를 감염하는 데 사용할 수 있습니다 burgdorferi는 감쇠 변형 생쥐에 감염을 설정할 수 없습니다이며, 따라서 자연 진드기 5 인수 수없는 경우에는 분리합니다. 이 방법은 또한 진드기에 다른 생물 학적 재료의 다양한 제공하는 데 사용할 수있는 예를 들어, 특정 항체 또는 두 RNA 6 좌초. 이 문서에서는, 우리는 B를 체외에서 재배한에서 함께 nymphal 진드기의 microinjection을 설명합니다 burgdorferi. 우리는 또한 공촛점 immunofluorescence 현미경을 사용하여 체크 굿에서 라임 병의 병원균의 국산화에 대한 방법을 설명합니다.
Protocol
1. Nymphal Ixodes scapularis 진드기의 Microinjection
1. 준비 바늘
- 난방 및 유리 micropipette 끌어당기는 장치 (Narishige)에 1mm의 유리 모세관 튜브 (세계 정밀 계측기)를 당기는하여 여러 microinjection의 바늘을 조작. 조심스럽게 연약한 모세관 튜브를 제거합니다.
- 저장소는 배양 접시에 접착 테이프에 바늘 (끝 위를 향하게)를 뽑아.
2. B. 준비 burgdorferi
- B. 그로 ML 당 7 10 세포의 농도에까지 BSK 문화 미디어 7 burgdorferi. Spirochetes은 Petroff - Hausser 계산 실 (Hausser 과학)를 사용하여 어두운 현장 현미경으로 계산됩니다.
- 펠렛 B. 실온에서 10 분 3,000 XG에서 원심 분리하여 burgdorferi.
- 뜨는 제거하고 완전히 부드럽게 ML 당 10 9 세포의 최종 농도 200 μL 살균 microtip 통과하여 BSK 미디어 펠렛을 resuspend. 전지은 높은 세포 밀도에서 resuspended 있으며, 세포 현탁액은 즉시 microinjection 함께 클럼프 사용해야합니다 수 있기 때문에.
3. 준비 거려
- 유리 슬라이드에 대한 명확하고 양면 접착 테이프를 넣으십시오.
- 끈적끈적한 매트 작업을 신중하게 작은 브러시를 사용하여 컨테이너에서 nymphal 진드기를 제거합니다.
- 같은 방향, 최대 접착 테이프, 복부 측면에 주입하는 진드기의 필요한 숫자를 놓습니다.
4. 주입 거려
- B. 5 μL를 로드할 20 μL microloader 피펫 팁 (Eppendorf)를 사용하여 가져온 모세관 바늘로 burgdorferi 문화. 갇혀있는 공기 방울을 위해 바늘을 검사하고 필요한 경우, 세균성 문화와 바늘을 다시로드합니다.
- 해부 쌍안 현미경 진드기를 확인하고 체크의 항문 조리개 영역에 중점을두고 있습니다. 부드럽게 직경이 microinjection 바늘을 형성 틱의 항문 구멍보다 약간 작은 튜브를 휴식하기 위하여 모세관 바늘의 팁을 터치. 아닌 적절한 바늘 팁과 진드기를 삽입하는 모든 시도가 주입 틱의 부상 가능한 사망 원인으로이 단계는 중요합니다.
- 해부 쌍안 현미경 고정 진드기를 놓고 두 이동식 항문 플레이트에 의해 덮여있다 항문 구멍에 중점을두고 있습니다. 고급 집게를 사용하여 부드럽게 터치와 항문 구멍 근처에있는 지역으로 매우 가벼운 압력을 적용합니다. 이것은 항문 접시와 용기를 연결 항문 구멍의 오프닝의 분리를 허용합니다. 항문 접시의 강제 개방을 통해 항문 조리개에 약간 바늘의 팁을 조심스럽게를 삽입합니다. 유리 끝에서 항문에 연결 반투명 hindgut가 손상될 수로 바늘을 삽입은 최소로 보관해야합니다. 자동 발 제어 (Eppendorf)이 장착된 microinjector 사용하여 B를 주입 1000 hectopascals (고전력 증폭기) 사출 압력, 0.2 초 분사 시간과 8 고전력 증폭기 보상 압력 : 다음 매개 변수를 사용하여 burgdorferi 솔루션입니다. 각 틱은 단일 주사를 받게됩니다.
- microinjection에 따라, 진드기는 미리 분사 상태로 유사한 행동해야합니다. 예를 들어, 틱은 자극에 대한 응답으로 크롤 링해야합니다.
- 우리는 일반적으로 진드기가 24으로 설정 환경 챔버에서 48 시간 동안 복구할 수 있도록 ° 16시간 / 8시간 진한 / 라이트 photoperiod 처방과 95 %의 습도와 C. 챔버 사용할 수없는 경우, 주입 진드기는 이러한 일반 건조기 챔버로 공기 꽉 컨테이너 내의 습한 조건에서 상온에서 보관 수 있습니다. 필요한 경우 생쥐 먹이로 사용하기 전에, 진드기의 복구 시간도 몇 시간이 단축 될 수 있습니다.
2. B. 공촛점 Immunofluorescence 현미경으로 burgdorferi 현지화
1. 해부 거려
- 인산염의 비말을 장소 현미경을위한 폴리 - L - 라이신 코팅 슬라이드 (시그마)에 절개하여 다른을위한 깨끗한 유리 슬라이드에 호수 (PBS)를 버퍼. 양면 접착 테이프와 다른 유리 슬라이드를 준비합니다.
- 작은 브러시를 사용하여 양면 접착 테이프에 컨테이너와 장소에서 체크를 제거합니다.
- 해부 현미경으로 체크보기 및 중점을두고 있습니다. 다리의 첫 번째와 두 번째 쌍 사이의 체크에 날카로운 면도날을 넣으십시오. 단단히 복부에 액세스할 수 있도록 두 가지의 체크를 절단 아래 버튼을 누르십시오. 즉시 잠수함 PBS의 비말에서 복부합니다.
- 아주 좋은 집게를 사용하여, 상처의 위치 주변의 지느러미와 복부 외골격를 잡아. 조심스럽게 갈색 색깔 굿 diverticula를 노출 체크에서 지느러미 방패를 당겨 멀리. 항상 PBS에서 해부 진드기를 유지하기 위해주의하십시오.
- 세미 반투명 침샘 롤빵dles은 창자의 앞쪽에 지역의 양쪽에 위치하고 있으며, 원하는 경우이 시점에서 제거할 수 있습니다. 포셉과 장소에 남아있는 외골격을 잡고 조심스럽게 복부의 창자를 끄집어.
- (예를 들어, 기관)에 갇혀있는 조직을 제거하여 직감을 부드럽게 닦아주십시오.
- 좋은 포셉의 팁을 사용하면 신속하게 폴리 - L - 라이신 유리 슬라이드에 PBS의 비말에 체크 굿를 전송할 수 있습니다. 좋은 블레이드를 사용하여 작은 조각으로 창자를 분리하거나 부드럽게 잘 포셉의 끝과 함께 눌러. 조심스럽게 굿 조직 주위에 여분의 PBS를 대기음.
- 굿 조직은 상온에서 건조 공기 수 있습니다.
- 10 분 아세톤에 잠수함이 잠수하여 체크 굿을 수정. 상온에서 건조 공기 수 있습니다. 슬라이드는 공기 꽉 컨테이너에서 -20 ° C에서 몇 달 동안이 단계에서 저장할 수 있습니다.
2. 더럽히는 것
- 티슈를 사용하여 조직 주위에 여분의 수분을 제거하고 자궁 - 펜 또는 소수성 장벽 라이닝 장치에 의해 건조 틱 굿 주위에 원을 그립니다. 이것은 이후 부화 단계 동안 얼룩 솔루션을 유지하는 데 도움이 될 것입니다.
- 실온에서 30 분 하나 또는 차단 버퍼의 몇 방울 (0.05 % PBS에서 트윈 - 20, 5 % 염소 혈청)와 체크 굿 표지. 차단에 사용되는 혈청은 항체에 대한 호스트 동물의 소스에 따라 다릅니다. 슬라이드가이 시점에서 건조하는 것을 허용하지 않습니다.
- 천천히 차단 버퍼를 대기음. 적절한 기본 및 / 또는 보조 항체 솔루션의 용기를 품어. 안티 B. 라벨 - 우리는 플루오레신 isothiocyanate (FITC)를 사용 실온에서 1 시간 버퍼를 차단에서 1:100 희석에 burgdorferi 항체 (Kirkegaard & 페리 연구소). 조명에 노출을 제한하기 위해 알루미늄 호일로 용기를 커버.
- 부드러운 흡인하여 항체 솔루션을 제거합니다. 예 : 4로 레이블 틱 조직에 형광 염료 ', 6 diamidino - 2 - phenylindole (DAPI) 또는 propidium 요오드화물의와 창자를 품어. 우리는 일반적으로 5 분 PBS에 20 μg / ML의 propidium 요오드화물의 (시그마)를 사용합니다. 상온에서.
- 0.05 % PBS에서 트윈 - 20 3 번 씻으십시오.
- 이러한 Slowfade (Invitrogen)로 antifade 시약을 포함하는 버퍼 글리세롤에 슬라이드를 장착하고 신중하게 유리 coverslip로 커버. 슬라이드는 공기 꽉 컨테이너 내에 네에서 몇 달 동안이 단계 ° C에 저장할 수 있습니다. 이미지와 B를 집중 공촛점 현미경 burgdorferi.
3. 대표 결과
microinjection에 nymphal 진드기의 위치와 B를 대표 이미지 틱 용기 burgdorferi 로컬 라이제이션은 그림 1에 표시됩니다.
그림 1. Microinjection와 B의 현지화 틱 굿에 burgdorferi.
nymphal I.의 (A) 복부보기 scapularis 진드기는 microinjection을 위해 위치. 삽입 microinjection 니들 (화살표)로 아날 조리개 (화살촉)이 삽입된 페이지의 배율에 따라 표시됩니다. 좋은 forcep은 항문 접시와 microinjection을 위해 항문 구멍의 오프닝의 분리를 허용 신체에 부드러운 압력을 적용하는 데 사용됩니다. 바늘은 가시성을 향상시키기 위해 쿠매시 빛나는 파란색의 솔루션으로 가득 차 있습니다. (B) B.의 공촛점 immunofluorescence 이미징 대표 결과 틱 굿 이내 burgdorferi. 굿 diverticulum의 앞쪽에 지역은 표시됩니다. 굿 핵 및 spirochetes는 (화살표) propidium 요오드화물의 (붉은 색) 또는 FITC - 복합 방지 B.으로 표시 아르 각각 burgdorferi (녹색 색깔). 바 = 20 μm의.
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Discussion
여기서 우리는 세균성 병원체 B.와 nymphal Ixodes의 진드기의 신속하고 효율적인 감염 microinjection 기반의 절차를 입증 burgdorferi. 우리는 또한 B.의 검색을위한 공촛점 immunofluorescence 절차를 설명 현장에서 틱 용기 burgdorferi. 우리의 시위는 nymphal 직감을 포함하지만, 이와 유사한 절차 또한 유충이나 성인 8,9 등 진드기의 다른 발달 단계에 대해 적용됩니다. 그러나, 그들의 작은 크기로 인해, 기술은 애벌레에 사용하기 위해 상대적으로 도전 수도 있지만 성인 진드기에 사용하기 위해 잘 적용해야합니다. B.와 진드기의 인공 감염의 다른 방법 burgdorferi는 유리 모세관 튜브 10까지 먹이 또는 문화 매체 11 침수에 의해 개발되었습니다. 이러한 방법은 효율적인 간단하고 상대적으로 저렴한 있습니다. 그러나 이러한 절차는 B. 비교적 통제 전송에 의존 따라서 개별 진드기에 burgdorferi하며 잠재적으로 동등한 부담 병원체와 감염 진드기의 동료을 생성 제한됩니다. 후자의 단점은 대폭 등 microinjection와 같은 관리 배달 절차에 의해 극복할 수 있습니다. 저희 연구실에서는, 우리는 정기적으로 전송 B.이 절차를 쓰다 거의 100 %의 감염률과 진드기, 대부분의 진드기에 burgdorferi의 절차를 생존. 주입 진드기는 몇 개월까지 주 동안 실험실에 보관하거나 즉시 생쥐에 충혈시키다와 B를 전송할 수 있습니다 burgdorferi 감염. B.의 효율성과 속도론 microinjected 진드기에서 burgdorferi 전송 자연에 감염된 진드기의와 유사하며, 따라서 인공 틱 감염 절차는 틱 성 라임 borreliosis를 공부하기 위해 우리의 노력에 도움을 가능성이 높습니다. 또한, 유사한 microinjection 기술은 또한 예를 들어, 관련 실험을 위해 적용 진드기 6,9,12의 RNA 간섭 - 중재 유전자 조작되었습니다.
진드기의 미숙 단계의 Microinjection은 비교적 섬세한 절차입니다. 진드기는 B.와 함께 주입되는지 확인 때문에 중요하다 burgdorferi 실험의 다음 설정하기 전에 건강 있습니다. 다리를 철회와 같은 호흡이나 브러시로 감동을 exhaled 같은 자극에 응답 아르가 포스트 주입 진드기는 추가 실험을 위해 사용하지 않아야합니다. 이들은 대부분 죽은 가능성이나 사출 외상에서 죽음의 직전에 있습니다. 우리는 바늘 끝 및 사출 매개 변수의 크기가 큰 바늘 도움말 및 사출 볼륨으로 프로 시저에서 두 중요한 요소는 것을 발견 가능성이 높은 파열 틱 사망률의 결과 창자 벽을 수 있습니다. 여기에서 설명한 microinjection 설정이 주로 B를 주사에 최적화된 유의하는 것도 중요합니다 burgdorferi은 BSK 매체 정지. 이러한 항체 또는 집중 RNA 솔루션과 같은 다른 생물 학적 재료, 유체 점도에 차이가 수 있습니다. 기타 자료의 경우 최적의 microinjection 설정, 주로 사출 압력 및 사출 시간, 경험적으로 결정해야합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 진심으로이 예제의 준비와 지원을 팔 실험실의 구성원 감사합니다. 이 연구는 NIH / NIAID에서 PHS 부여 AI076684 및 AI080615 지원했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| Vertical glass puller | Narishige International | PC-10 | |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser Scientific | 3900 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Femtojet microinjector | Eppendorf | 920010504 | |
| Foot control FemtJet | Eppendorf | 920005098 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP665-1 | Filter-sterilized |
References
- Steere, A. C., Coburn, J., Glickstein, L. The emergence of Lyme disease. J Clin Invest. 113, 1093-1101 (2004).
- Barthold, S. W., Diego, C., Philipp, M. T. Borrelia, Molecular Biology, Host Interaction and Pathogenesis. Samuels, D. S., Radolf, J. D. , Caister Academic Press. Chapter 14 353-405 (2010).
- Pal, U. OspC facilitates Borrelia burgdorferi invasion of Ixodes scapularis salivary glands. J Clin Invest. 113, 220-230 (2004).
- Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete. J Exp Med. 199, 641-648 (2004).
- Zhang, X., Yang, X., Kumar, M., Pal, U. BB0323 function is essential for Borrelia burgdorferi virulence and persistence through tick-rodent transmission cycle. J Infect Dis. 200, 1318-1330 (2009).
- Pal, U. TROSPA, an Ixodes scapularis receptor for Borrelia burgdorferi. Cell. 119, 457-468 (2004).
- Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale J Biol Med. 57, 521-525 (1984).
- Narasimhan, S. Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 1141-1146 (2004).
- Narasimhan, S. A tick antioxidant facilitates the Lyme disease agent's successful migration from the mammalian host to the arthropod vector. Cell Host Microbe. 2, 7-18 (2007).
- Broadwater, A. H., Sonenshine, D. E., Hynes, W. L., Ceraul, S., DeSilva, A. Glass capillary tube feeding: a method for infecting nymphal Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) with the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. J Med Entomol. 39, 285-292 (2002).
- Policastro, P. F., Schwan, T. G. Experimental infection of Ixodes scapularis larvae (Acari: Ixodidae) by immersion in low passage cultures of Borrelia burgdorferi. J Med Entomol. 40, 364-370 (2003).
- Fuente, dela, Kocan, J., M, K., Almazan, C., Blouin, E. F. RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks. Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).
