פליטת אור הדמיה עבור הערכת התגובה החיסונית לאחר השתלת רקמת לב הנדסי (EHT)

Summary

וידאו זה מדגים את השימוש

Abstract

טכניקות שונות של הנדסת רקמות לב כבר רדף בעשורים האחרונים, כולל אסטרטגיות פיגומים או באמצעות דובר או bioartificial חומרי הפיגום, המלכוד של myocytes לב ב הידרוג כגון הפיברין או קולגן הערמה של monolayers myocyte ^1. מושגים אלה מכוונים שיקום תפקוד הלב נפגע (למשל לאחר אוטם שריר הלב) או כמודל ניסויי (טוקסיקולוגיה חזוי למשל וסינון חומר דוגמנות או מחלה). ניטור מדויק של הישרדות התא לאחר השתלת רקמת לב מהונדסים (EHT) הפכה כעת ניתן להשתמש ב-vivo הדמיה פליטת אור (BLI) טכניקות ^2. כאן אנו מתארים את הדור של EHT מבוסס הפיברין מהלחץ עכבר מהונדס עם הביטוי הנפוץ של גחלילית בלוציפראז (רוזה / בלוציפראז-Lew Tg: ^3). השרשה מתבצעת לתוך omentum גדול יותר של זני עכברים שונים כדי להעריך את התגובה החיסונית של גוף המקבל הבאים ההשתלה EHT. השוואה של תוצאות שנוצר על ידי BLI לבין אנזימים מקושרים טכניקה חיסונית ספוט (ELISPOT) לאשר את השימושיות של BLI להערכת התגובה החיסונית.

Protocol

1. EHT הדור ותרבות תנאי

ייצור של EHT מבוסס הפיברין בוצע כפי שתואר במקום אחר ^4. בקיצור, לייצר מבוסס הפיברין EHT למטרות השתלה, לערבב מאסטר הוכן המכיל תאים מבודדים ROSA בילוד / בלוציפראז-Lew הלבבות מהונדס עכברוש, שור Matrigel פיברינוגן ו. Agarose תבניות יציקה הוכנו באמצעות מפרידי טפלון להציב 6-היטב מנות התרבות. לאחר התמצקות של agarose, מפרידי הוסרו הודעה מתלים סיליקון הונחו על מאכלים עם התרבות שנכתבו להגיע לתוך תבניות. כדי ליצור EHT, mastermix היה מעורב לזמן קצר עם כמות מחושבת של תרומבין ו pipetted לתוך התבנית. לאחר polymerisation של פיברינוגן, מתלים סיליקון עם EHTs דבקות ההודעות הוסרו בעדינות את תבניות יציקה agarose, הועבר חדש 6-היטב בתרבות מנות התא נשמר 37 ° C, 7% CO ₂ תאים תרבות חממה באמצעות מחוייט תרבית תאים בינוניים.

EHT הוחזקו בתנאי תרבית תאים עד היום בעשר. במהלך פרק הזמן הזה, בילוד לב תאים עכברוש החל הקישוריות, מאורכים ליישר קווים כוח בין ההודעות סיליקון. בזמן ההשתלה, התכווצויות קוהרנטית ספונטנית נצפו, להסיט ההודעות סיליקון.

2. EHT השרשה

EHT ההשתלה בוצעה או immunocompetent בראון נורווגיה (BN) חולדות או עכברים בעירום immunodeficient לחקור את התגובה החיסונית allogeneic. BN ו בעירום חולדות במשקל 100-150 גרם נרכשו מ צ'ארלס ריבר גרמניה (Sandhofer מאייתים 7, D-97633 Sulzfeld) ושוכנו בתנאים רגילים, נמאס תקן עכברוש ושולחת libidum מים המודעה. חולדות Immunodeficient שוכנות מצעים, כלובים סטרילי, מעוקר מים משמש. הוועדה הגרמנית ביקורת אתית נבדקה ואושרה הנהלים בעלי חיים. כל המכשירים כירורגית הם מעוקרים לפני השימוש.

הליך ההשתלה מתבצעת כדלקמן:

עכברוש הם anesthesized עם isoflurane (2.5-3%) באמצעות תא אינדוקציה. החשיפה האנושית isoflurane יכול להיות מופחת על ידי עבודה בטבלה משב רוח נשא או מכסה המנוע הלא הסירקולציה המחודשת. טמפרטורת הגוף נשמרת במהלך ההליך הכירורגי.

1. גילוח באזור הבטן להחיל משחה העין כדי למנוע את העיניים מהתייבשות במהלך ההרדמה.
2. מניחים את חולדה על הגב שלה במקום facemask על האף והפה שלה כדי לשמור על הרדמה.
3. לחטא את אזור הבטן באמצעות בבטאדין ואז אתנול 80%. ספוגית מן נקי ומלוכלך, ממרכז האזור מגולח נע החוצה לעבר האזור שיער.
4. בדוק רפלקסים צובט את הרגליים האחוריות כדי להיות בטוח כי החולדה הוא הרדים מספיק.
5. לכסות את בעלי החיים לבצע חתך בבטן קו האמצע המפריד בין העור והשרירים בשני שלבים כדי לפתוח את הבטן. חם עיקור חרוז משמש בין העור ופתיחת השריר.
6. מניחים את המעיים כפפה אבקת מלח חימם לחות ללא תשלום. מקפלים את הכפפה סביב המעיים כדי למנוע אובדן לחות.
7. הסרה של רקמת שומן ולחשוף את הטחול.
8. המחש להפיץ omentum יותר עם מלקחיים.
9. בזהירות לחתוך EHT מ השעיית ההודעות סיליקון ולהעביר אל omentum יותר.
10. עטפו את omentus גדול סביב EHT ולתקן באמצעות שני יחיד 7-0 תפרים prolene (Ethicon, Norderstedt, גרמניה)
11. הבא להעביר את המעיים בחזרה לתוך הבטן.
12. רוקן את הבטן עם מי מלח סטרילית prewarmed.
13. סגור את שכבת השרירים של דופן הבטן באמצעות תפרים ריצה 6-0 prolene (Ethicon, Norderstedt, גרמניה).
14. השתמש 5-0 prolene (Ethicon, Norderstedt, גרמניה) פועל תפרים כדי לסגור את העור.
15. בעוד העכברוש עדיין הרדמה, להזריק 5 מ"ג / ק"ג Carprofen תת עורי.
16. כדי לספק שיכוך כאבים מספיק עבור סוג זה של ההליך, משכך כאבים (כגון Metamizol) מתווסף מי השתייה (50 מ"ג Metamizol 100 מ"ל) עבור משככי כאבים להשתלה 3 ימים הודעה.

3. פליטת אור הדמיה של השרשה בעקבות EHT

הפלטפורמה bioimaging IVIS (Xenogen, Alameda, קליפורניה, ארה"ב) משמש עבור הדמיה בלתי פולשנית פליטת אור ב-vivo ואת התוצאות מנותחות באמצעות תמונה Living IVIS (Xenogen) חבילת תוכנה. ההדמיה מתבצעת מדי יום החל 2 שעות לאחר הניתוח.

הרדימי עכברוש עם isoflurane (2.5-3%) באמצעות תא אינדוקציה.

1. לחטא את אזור הבטן החזה נרחב באמצעות Provo-יוד, השתמש הבא אתנול 80%, לחזור על פעולה זו שלוש פעמים.
2. הזרק d-Luciferin (Xenogen: 375 מ"ג / ק"ג משקל גוף) ip
3. מניחים חולדות מורדמים לתוך הדמיה IVIS קאמרית (עד 4 חולדות ניתן לנתח באותו זמן).
4. העריכו את עוצמת האות של lUC + תאים בתוך EHT ביחידות של פוטונים / sec / cm ² / steridianin האזור של עניין (ROI) בתחילת המחקר (120 דקות לאחר ההשתלה) ו ב 1 ימים, 2, 3, 5, 7, 10, ובאותו שבועות 2, 3 ו 4. הערה האות השיא (מופיע סביב 20 דקות לאחר ההזרקה d-Luciferin).

יצירת גרף (Excel) מראה את עוצמת האות לאורך זמן.

4. קורלציה של תוצאות BLI ו ELISPOT

הסלולר ב-vivo התגובות החיסוניות ב BN immunocompetent וחולדות בעירום immunodeficient נחקרו EHT לאחר ההשתלה. הטחול בעלי חיים שנקטפו הנמען היה 5 ימים לאחר השתלת EHT לבודד splenocytes הנמען. מבחני Elispot באמצעות mitomycin-עכבות EHTs (סיגמא אולדריץ', בסנט לואיס, מיזורי, ארה"ב), כמו ממריץ x10 ו 5 ⁶ splenocytes הנמען כמו תאים המגיב בוצעו על פי פרוטוקול של יצרן (BD Biosciences) באמצעות IFN-γ ו-IL-4 מצופה צלחות לחקור-TH1, ותגובה Th2, בהתאמה. IFN-γ ו-IL-4 נקודות היו גבוהים יותר משמעותית במודל, immunocompetent לעומת המודל immunodeficient (IFN-γ: p = 0.001, IL-4: p = 0.023; של סטודנטים מבחן t).

5. נציג תוצאות:

באיור 1. קורלציה של תוצאות BLI ו ELISPOT א) הסלולר בתגובות המערכת החיסונית vivo ב immunocompetent בראון נורבגיה חולדות בעירום immunodeficient נחקרו לאחר ההשתלה EHT. Splenocytes מקבל נבצרו 5 ימים לאחר ההשתלה EHT. IFN? ו IL-4 ביטוי הוערך על ידי מבחני ELISpot באמצעות mitomycin-עכבות EHT כמו לגירוי ו 5x106 splenocytes הנמען כמו תאים המגיב. Th1 Th2 והתגובות היו גבוהים יותר משמעותית במודל immunocompetent לעומת המודל immunodeficient כפי שמעידים IL-4 ו IFNγ הייצור בהתאמה. ב) לוק EHTs + הושתלו omentus יותר של חולדות או עכברים או BN immunocompetent בעירום immunodeficient. הישרדות התא אחריו longitudinally ידי BLI. שיעור חיות דחו את EHTs המושתלים מוצג. כל חולדות BN במהירות דחה את ההשתלות EHT, ואילו התאים ששרדו בחולדות T תא לקוי.

Discussion

לפני יישום קליני של הטכנולוגיה EHT לתיקון לב, שאלות בסיסיות כגון immunogenicity של שני המרכיבים הסלולר מטריצה ​​או הישרדות השתל לאחר ההשתלה צריך להעריך במודלים ניסיוניים. In-vivo הדמיה פליטת אור מייצג שיטה חדשה שימושי להישרדות התא ניטור לאחר ההשתלה . אנחנו שנוצר בהצלחה מבוסס הפיברין EHT המכיל בלוציפראז חיובי (לוק +) לתאי לב על ידי עיבוד של פרוטוקול מבוסס ^4. EHT אלו מושתלים לתוך omentum גדולה יותר של חולדות הנמען. הזרקת intraperitoneal של המצע ספציפי (d-Luciferin) יוצרת אותות שהיו לזיהוי באמצעות פלטפורמת bioimaging IVIS (Xenogen). עוצמת האות בתחילת המחקר (120 דקות לאחר ההשתלה) נמדד פוטונים / sec / cm ² / steridian שימש פרמטר פונדקאית עבור מספר תאים בתוך EHTs מורכבים. מדידות היומי המותר עבור assessement פולשני האורך של הישרדות השתל. במודל דחייה, ירידה של עוצמת האות לאורך זמן היתה בקורלציה עם עוצמת ו קינטיקה של דחייה חריפה זני עכברים שונים.

Materials

LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor-luc)11Jmsk rats (NBPR rat number 0299, http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/) Bovine fibrinogen (stock solution: 200 mg/ml plus aprotinin 5 μg/ml fibrinogen in NaCl 0.9%, Sigma F4753) Matrigel (BD Bioscience 356235) DMEM (Biochrome F0415) Horse serum (Gibco 26050) Penicillin/streptomycin (Gibco 15140) Insulin (Sigma-Aldrich I9278) Aprotinin (Sigma Aldrich A1153) d-Luciferin (Biosynth L-8220) Enzyme-linked immunosorbent spot (ELISpot) assay plates (Hassa Laborbedarf, S2EM004M99)