Bioluminiscencia de imágenes para la evaluación de la respuesta inmune después de la implantación de tejido cardiaco de Ingeniería (EHT)

Summary

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Abstract

Diversas técnicas de la ingeniería de tejidos cardíacos han llevado a cabo en las últimas décadas, incluidas las estrategias de andamios utilizando materiales de andamiaje o nativo o bioartificiales, el atrapamiento de los miocitos cardíacos en los hidrogeles, como la fibrina o el colágeno y el apilamiento de las monocapas miocitos ^1. Estos conceptos tienen por objeto la restauración de compromiso de la función cardíaca (por ejemplo después de un infarto de miocardio) o como modelos experimentales (por ejemplo, toxicología predictiva y la detección de sustancias o modelos de enfermedad). Un control preciso de la supervivencia celular después de la implantación del tejido del corazón de ingeniería (EHT) se ha convertido en posible con in-vivo de imágenes de bioluminiscencia (BLI) técnicas ^2. A continuación se describe la generación de fibrina, basado en EHT a partir de una cepa de rata transgénicos con expresión ubicua de la luciferasa de luciérnaga (ROSA / Tg luciferasa-ASE, ^3). La implantación se realiza en el epiplón mayor de cepas de ratas diferentes para evaluar la respuesta inmune del organismo receptor después de la implantación EHT. Comparación de los resultados generados por BLI y la enzima técnica vinculada al contado Inmuno (ELISPOT) confirman la utilidad de BLI para la evaluación de la respuesta inmune.

Protocol

1. EHT Generación y condiciones de cultivo

Fabricación de fibrina basado en EHT se realizó como se describe en otro lugar ^4. En resumen, la generación de fibrina, basado en EHT para fines de implantación, una mezcla maestra se prepara con células aisladas de neonatos ROSA / luciferasa ASE corazones de ratas transgénicas, fibrinógeno bovino y Matrigel. Agarosa moldes de fundición se prepararon utilizando separadores de teflón colocados en placas de cultivo de 6 pocillos. Después de la solidificación de la agarosa, separadores fueron retirados y bastidores de silicona después se colocaron en placas de cultivo con los mensajes de llegar en los moldes. Para generar altas tensiones, la mastermix se mezcló brevemente con una cantidad calculada de la trombina y la pipeta en el molde. Después de la polimerización del fibrinógeno, bastidores de silicona con EHTs adherido a los postes fueron removidas suavemente de los moldes de agarosa, transferidos a las nuevas 6-y placas de cultivo celular y mantiene en un 37 ° C, 7% de CO ₂ de cultivo celular incubadora usando a medida medio de cultivo celular.

EHT se mantuvieron bajo condiciones de cultivo celular hasta el día diez. Durante este lapso de tiempo, las células de corazón de rata neonatal comenzó a interconectar alargada, y alinear a lo largo de las líneas de fuerza en medio de mensajes de silicona. En el momento de la implantación, las contracciones espontáneas coherente se observaron, desviando los mensajes de silicona.

2. EHT implantación

EHT implantación se llevó a cabo, ya sea en inmunocompetentes Brown Norway (BN) ratas, ratones o inmunodeficientes desnuda para investigar la respuesta inmune alogénico. Ratas BN y desnuda un peso de 100 - 150 g fueron adquiridos de Charles River Alemania (Sandhofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld) y alojados en condiciones convencionales, dieta estándar comida de rata y libidum agua ad. Ratas inmunodeficientes se encuentran en las camas estéril, jaulas, agua esterilizada y se utiliza. El comité de evaluación ética alemán revisó y aprobó los procedimientos con animales. Todos los instrumentos quirúrgicos son esterilizados antes de su uso.

El procedimiento de implante se realiza de la siguiente manera:

Rata son anestesiados con isoflurano (2,5-3%), utilizando una cámara de inducción. La exposición humana a isoflurano se puede reducir mediante el trabajo en una mesa de corriente descendente o no de recirculación de campana. La temperatura corporal se mantiene durante el procedimiento quirúrgico.

1. Afeitarse la zona abdominal y aplicar ungüento oftálmico para evitar que los ojos se sequen durante la anestesia.
2. Coloque el ratón sobre la espalda y colocar una máscara sobre su nariz y la boca para mantener la anestesia.
3. Desinfectar el área abdominal con Betadine y etanol al 80%. Hisopo de limpieza de suciedad, desde el centro del área afeitada movimiento hacia afuera, hacia la zona de pelo.
4. Revisar los reflejos pellizcar las patas traseras para asegurarse de que la rata es lo suficientemente anestesiado.
5. Coloque el animal y realizar una incisión abdominal que separa la piel y el músculo en dos pasos para abrir el abdomen. Caliente se utiliza la esterilización de cuentas entre la piel y la apertura de los músculos.
6. Lugar de los intestinos en una solución salina caliente guante sin polvo hidratada. Veces el guante de todo el intestino para evitar la pérdida de humedad.
7. Eliminar el tejido graso y exponer el bazo.
8. Visualizar y difundir el epiplón mayor con unas pinzas.
9. Corte cuidadosamente EHT de la suspensión de los mensajes de silicona y la transferencia en el epiplón mayor.
10. Envuelva el mayor omentus todo el EHT y fijar con dos suturas de prolene 7-0 sola (Ethicon, Norderstedt, Alemania)
11. Luego mueva el intestino en el abdomen.
12. Enjuague bien el abdomen con solución salina estéril precalentada.
13. Cerca de la capa muscular de la pared abdominal usando suturas de prolene 6-0 en ejecución (Ethicon, Norderstedt, Alemania).
14. Use 5-0 prolene (Ethicon, Norderstedt, Alemania) que se ejecuta suturas para cerrar la piel.
15. Mientras que la rata aún está en la anestesia, inyectar 5 mg / kg por vía subcutánea Carprofen.
16. Para proporcionar una analgesia suficiente para este tipo de procedimiento, un analgésico (como el metamizol) se añade al agua potable (50 mg Metamizol por 100 ml) de medicamentos para el dolor durante 3 días después del trasplante.

3. Bioluminiscencia de imágenes después de la implantación EHT

La plataforma bioimagen IVIS (Xenogen, Alameda, CA, EE.UU.) se utiliza para obtener imágenes de bioluminiscencia no invasiva in vivo y los resultados se analizaron mediante la viva imagen IVIS (Xenogen) paquete de software. Imágenes se realiza diariamente a partir de 2 horas tras la intervención.

Anestesiar la rata con isoflurano (2,5 - 3%) con una cámara de inducción.

1. Desinfectar el área abdominal y torácica ampliamente mediante Provo-yodo, el próximo uso etanol al 80%, repetir este paso tres veces.
2. Inyectar d-luciferina (Xenogen, 375 mg / kg de peso corporal) ip
3. Lugar ratas anestesiadas en la cámara de imágenes IVIS (hasta 4 ratas pueden ser analizados al mismo tiempo).
4. Evaluar la intensidad de la señal de luc + dentro de las células EHT en unidades de fotones / s / cm ² / steridianin la región de interés (ROI) al inicio del estudio (120 minutos después de la implantación) y en los días 1, 2, 3, 5, 7, 10, y en las semanas 2, 3 y 4. Tenga en cuenta el pico de la señal (aparece alrededor de 20 minutos después de D-luciferina de la inyección).

Crear un gráfico (Excel) que muestra la intensidad de la señal a través del tiempo.

4. La correlación de los resultados de BLI y ELISPOT

El celular in vivo la respuesta inmune en BN inmunocompetentes y inmunodeficientes ratas desnudas fueron estudiados después de EHT trasplante. El bazo de los animales receptores se cosechó 5 días después del trasplante de EHT para aislar esplenocitos destinatario. ELISPOT con mitomicina inhibe EHTs (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) como estimulador y 5 x 10 ⁶ esplenocitos destinatario como células de respuesta se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante (BD Biosciences) con IFN-γ y recubierto de IL-4 placas para investigar TH1-, y la respuesta TH2, respectivamente. IFN-γ e IL-4 puntos fueron significativamente mayores en el modelo inmunocompetentes, en comparación con el modelo de inmunodeficiencia (IFN-γ: p = 0,001; IL-4: p = 0,023; t de Student-test).

5. Los resultados representativos:

Figura 1. Correlación de los resultados de BLI y ELISPOT a) El celular in vivo la respuesta inmune en personas inmunocompetentes Noruega Brown y inmunodeficientes ratas desnudas fueron estudiados después de la implantación EHT. Esplenocitos receptores se cosecharon cinco días después de la implantación EHT. IFN? y la expresión de IL-4 fue evaluada por ensayos de ELISPOT con mitomicina inhibe EHT como estimuladores y 5x106 esplenocitos destinatario como células de respuesta. Th1 y Th2 fueron significativamente mayores en el modelo inmunocompetentes en comparación con el modelo de inmunodeficiencia como se evidencia por IFN-y IL-4, respectivamente. b) Luc EHTs + fueron trasplantados en el mayor omentus de cualquiera de las ratas BN inmunocompetentes o inmunodeficientes ratas desnudas. Supervivencia de las células fue seguido longitudinalmente por BLI. La tasa de los animales que rechazaban el EHTs trasplantado se presenta. Todas las ratas BN rápidamente rechazó el trasplante de EHT, mientras que las células sobrevivieron en ratas de células T deficientes.

Discussion

Antes de la aplicación clínica de la tecnología EHT para la reparación cardiaca, las preguntas fundamentales tales como la inmunogenicidad de los componentes celulares y la matriz o la supervivencia del injerto después de la implantación deben ser evaluados en modelos experimentales. In vivo imágenes de bioluminiscencia representa una técnica nueva y útil para la supervivencia de la célula de seguimiento tras el trasplante . Hemos logrado generar fibrina basado en EHT contiene luciferasa positivo (luc +) las células del corazón por la adaptación de un protocolo establecido ^4. Estos EHT fueron implantados en el epiplón mayor de ratas receptoras. La inyección intraperitoneal del sustrato específico (D-luciferina) genera señales que se detectaron utilizando la plataforma bioimagen IVIS (Xenogen). Intensidad de la señal al inicio del estudio (120 minutos después de la implantación), medido en fotones / s / cm ² / steridian sirvió como un parámetro sustituto para el número de células dentro de EHTs injertado. Las mediciones diarias permitido no invasiva Evaluación longitudinal de la supervivencia del injerto. En un modelo de rechazo, disminución de la intensidad de la señal a través del tiempo se relacionó con la intensidad y la cinética de rechazo agudo en las cepas de ratas diferentes.

Materials

LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor-luc)11Jmsk rats (NBPR rat number 0299, http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/) Bovine fibrinogen (stock solution: 200 mg/ml plus aprotinin 5 μg/ml fibrinogen in NaCl 0.9%, Sigma F4753) Matrigel (BD Bioscience 356235) DMEM (Biochrome F0415) Horse serum (Gibco 26050) Penicillin/streptomycin (Gibco 15140) Insulin (Sigma-Aldrich I9278) Aprotinin (Sigma Aldrich A1153) d-Luciferin (Biosynth L-8220) Enzyme-linked immunosorbent spot (ELISpot) assay plates (Hassa Laborbedarf, S2EM004M99)