Bioluminescentie Imaging voor beoordeling van immuunreacties na implantatie van Engineered hartweefsel (EHT)

Summary

Deze video toont het gebruik van

Abstract

Verschillende technieken van cardiale tissue engineering zijn gevoerd in de afgelopen decennia ook steigers strategieën door middel van een native of bioartificial scaffold materialen, entrapment van cardiale myocyten in hydrogels, zoals fibrine en collageen en stapelen van myocyte monolagen ^1. Deze concepten zijn gericht op herstel van gecompromitteerde cardiale functie (bijvoorbeeld na een myocardinfarct) of als experimentele modellen (zoals voorspellende toxicologie en stof screening of ziekte modellering). Nauwkeurige controle van overleving van de cel na implantatie van technisch hartweefsel (EHT) is nu mogelijk met behulp van in-vivo bioluminescentie imaging (BLI) technieken ^2. Hier beschrijven we de generatie van fibrine-gebaseerde EHT van een transgene rat stam met alomtegenwoordige uitdrukking van vuurvlieg luciferase (ROSA / luciferase-LEW Tg, ^3). Implantatie wordt uitgevoerd in de grotere omentum van de verschillende stammen tot rat immuunrespons van het recipiënte organisme volgende EHT implantatie te beoordelen. Vergelijking van de resultaten gegenereerd door BLI en de Enzyme Linked Immuno Spot Techniek (ELISPOT) bevestigen de bruikbaarheid van BLI voor de beoordeling van immuunreacties.

Protocol

1. EHT Generation en Cultuur voorwaarden

De vervaardiging van fibrine-based EHT werd uitgevoerd zoals beschreven elders ^4. Kortom, in fibrine-based EHT voor implantatie doeleinden te genereren, was een master mix bereid die cellen geïsoleerd uit neonatale ROSA / luciferase-LEW transgene rat harten, runderen fibrinogeen en Matrigel. Agarose gietvormen werden opgesteld op basis van Teflon spacers geplaatst in 6-well cultuur gerechten. Na het stollen van agarose, waren spacers verwijderd en siliconen post racks werden geplaatst op de cultuur gerechten met berichten tot in de mallen. Voor het genereren van EHT, was de mastermix kort gemengd met een berekende hoeveelheid trombine en gepipetteerd in de mal. Na de polymerisatie van fibrinogeen, waren siliconen rekken met EHTs zich te houden aan de posten voorzichtig verwijderd uit de agarose gietmallen, overgebracht naar nieuwe 6-well celkweek gerechten en onderhouden in een 37 ° C, 7% CO ₂ celkweek incubator met behulp van op maat gemaakt celkweekmedium.

EHT werden gehouden onder celcultuur condities tot dag tien. Gedurende deze periode, neonatale rat hartcellen begon te langwerpig, interconnect en uit te lijnen langs de krachtlijnen in tussen siliconen berichten. Op het moment van implantatie, waren spontane coherent samentrekkingen waargenomen, afbuigen van siliconen berichten.

2. EHT Implantatie

EHT implantatie werd uitgevoerd in een van beide immunocompetente Brown Noorwegen (BN) ratten, of immunodeficiëntie naakt ratten aan de allogene immuunrespons te onderzoeken. BN en naakt ratten een gewicht van 100 - 150 g werden gekocht van Charles River Duitsland (Sandhofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld) en gehuisvest onder gangbare condities, gevoed standaard rat chow en water ad libidum. Immunodeficiënte ratten zijn gehuisvest in een steriele beddengoed, kooien, en gesteriliseerd water wordt gebruikt. De Duitse ethische toetsingscommissie beoordeeld en goedgekeurd het dier procedures. Alle chirurgische instrumenten zijn gesteriliseerd.

De implantatie procedure worden uitgevoerd als volgt:

Rat zijn anesthesized met isofluraan (2,5-3%) met behulp van een inductie kamer. Menselijke blootstelling aan isofluraan kan worden verminderd door te werken in een afzuigtafel of niet-recirculerende kap. Lichaamstemperatuur wordt gehandhaafd tijdens de chirurgische ingreep.

1. Scheren buikstreek en gelden oogzalf om de ogen te voorkomen dat het drogen tijdens anesthesie.
2. Leg de rat op zijn rug en zet een masker over zijn neus en mond te houden van de anesthesie.
3. Ontsmet de buikstreek met Betadine en daarna 80% ethanol. Wattenstaafje van schoon naar vies, van het centrum van geschoren gebied verplaatsen naar buiten de richting van de haren gebied.
4. Controleer reflexen knijpen de achterpoten voeten om er zeker van dat de rat voldoende verdoofd.
5. Drapeer het dier en het uitvoeren van een middellijn incisie in de buik het scheiden van de huid en de spieren in twee stappen om de buik te openen. Hete kraal sterilisatie wordt gebruikt tussen de huid en spieren opening.
6. Plaats de darmen in een verwarmde zoutoplossing gehydrateerd poeder handschoen. Vouw de handschoen rond de darmen om verlies van vocht te voorkomen.
7. Verwijderen vetweefsel en bloot de milt.
8. Visualiseer en verspreiden een grotere omentum met een pincet.
9. Snijd EHT van opschorting van siliconen berichten en transfer naar het grotere omentum.
10. Wikkel de grotere omentus rond de EHT en lossen met behulp van twee eenpersoons 7-0 prolene hechtingen (Ethicon, Norderstedt, Duitsland)
11. Volgende terug naar de darmen in de buik.
12. Spoel de buik met een voorverwarmde steriele zoutoplossing.
13. Sluit de spierlaag van de buikwand met 6-0 prolene lopen hechtingen (Ethicon, Norderstedt, Duitsland).
14. Gebruik 5-0 prolene (Ethicon, Norderstedt, Duitsland) loopt hechtingen op de huid te sluiten.
15. Terwijl de rat is nog steeds in anesthesie, subcutaan injecteren 5 mg / kg Carprofen.
16. Om voldoende analgesie voor dit soort procedure, een pijnstiller (zoals Metamizol) wordt toegevoegd aan het drinkwater (50 mg Metamizol per 100 ml) voor pijnstillers voor 3 dagen na de transplantatie.

3. Bioluminescentie beeldvorming van EHT na de implantatie

De IVIS BioImaging platform (Xenogen, Alameda, CA, USA) wordt gebruikt voor niet-invasieve bioluminescentie beeldvorming in-vivo en de resultaten worden geanalyseerd met behulp van de IVIS Living Image (Xenogen) software pakket. Beeldvorming wordt uitgevoerd per dag vanaf twee uur na de operatie.

Verdoven rat met isofluraan (2,5 - 3%) met behulp van een inductie kamer.

1. Ontsmet de buik-en borstkas gebied op grote schaal gebruik van Provo-Jodium, naast het gebruik 80% ethanol, herhaalt u deze stap drie keer.
2. Injecteren d-Luciferine (Xenogen; 375 mg / kg lichaamsgewicht) ip
3. Plaats verdoofde ratten in de IVIS beeldvorming kamer (maximaal 4 ratten kunnen worden geanalyseerd op hetzelfde moment).
4. Beoordeel signaal intensiteit van de luc + cellen binnen EHT in eenheden van fotonen / sec / cm ² / steridianin de regio van belang (ROI) bij aanvang (120 minuten na implantatie) en op dag 1, 2, 3, 5, 7, 10, en in week 2, 3 en 4. Let op de piek-signaal (verschijnt ongeveer 20 minuten na D-Luciferine injectie).

Maak een grafiek (Excel) met de signaal intensiteit in de tijd.

4. Correlatie van BLI Resultaten en ELISPOT

De cellulaire in-vivo immuunresponsen bij immunocompetente BN en immunodeficiënte naakt ratten werden onderzocht na EHT transplantatie. De milt van de ontvanger dieren werd geoogst 5 dagen na de transplantatie EHT aan ontvanger splenocyten isoleren. ELISPOT-tests met behulp van mitomycine-remde EHTs (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) als stimulator en 5 x10 ⁶ ontvanger splenocyten als responder cellen werden uitgevoerd volgens protocol van de fabrikant (BD Biosciences) met behulp van IFN-γ en IL-4 gecoat platen te onderzoeken TH1-, en TH2 respons van respectievelijk. IFN-γ-en IL-4 plekken waren significant hoger in de immunocompetente, model in vergelijking met het immuundeficiënte model (IFN-γ: p = 0,001; IL-4: p = 0,023; Student's t-test).

5. Representatieve resultaten:

Figuur 1. Correlatie van BLI resultaten en ELISPOT a) De in vivo cellulaire immuunresponsen bij immunocompetente Brown Noorwegen en immunodeficiënte naakt ratten werden onderzocht na EHT implantatie. Ontvanger splenocyten werden geoogst 5 dagen na EHT implantatie. IFN? en IL-4 expressie werd geëvalueerd door ELISPOT-tests met mitomycine-geremd EHT als stimulatoren en 5x106 ontvanger splenocyten als responder cellen. Th1 en Th2 reacties waren significant hoger in de immunocompetente model ten opzichte van de immunodeficiëntie model zoals blijkt uit IFNy-en IL-4 productie van respectievelijk. b) Luc + EHTs werden getransplanteerd in het grotere omentus van een van beide immuuncompetente BN ratten of immunodeficiënte naakt ratten. Overleving van de cel werd longitudinaal gevolgd door BLI. Het tarief van dieren die de getransplanteerde EHTs afgewezen wordt gepresenteerd. Alle BN ratten snel verwierpen de EHT transplantatie, terwijl de cellen overleefden in de T-cel deficiënte ratten.

Discussion

Voor klinische implementatie van EHT technologie voor cardiale reparatie, fundamentele vragen zoals de immunogeniciteit van zowel cellulaire en matrix componenten of transplantaat overleving na implantatie moeten worden beoordeeld in experimentele modellen. In-vivo bioluminescentie beeldvorming vormt een nuttige nieuwe techniek voor het toezicht op overleving van de cel na transplantatie . Wij hebben met succes gegenereerd fibrine-based EHT met luciferase positieve (luc +) hart cellen door aanpassing van een vastgesteld protocol ^4. Deze EHT werden geïmplanteerd in de grotere omentum van de ontvangende ratten. Intraperitoneale injectie van het specifieke substraat (d-Luciferine) genereert signalen die werden opgespoord met behulp van de IVIS BioImaging platform (Xenogen). Intensiteit van het signaal bij aanvang (120 minuten na implantatie) gemeten in fotonen / sec / cm ² / steridian diende als een surrogaat parameter voor het aantal cellen binnen geënt EHTs. Dagelijkse metingen toegestaan ​​voor niet-invasieve longitudinale assessment van de graft te overleven. In een afwijzing model, was daling van het signaal intensiteit in de tijd gecorreleerd met de intensiteit en de kinetiek van acute afstoting in verschillende ratten stammen.

Materials

LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor-luc)11Jmsk rats (NBPR rat number 0299, http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/) Bovine fibrinogen (stock solution: 200 mg/ml plus aprotinin 5 μg/ml fibrinogen in NaCl 0.9%, Sigma F4753) Matrigel (BD Bioscience 356235) DMEM (Biochrome F0415) Horse serum (Gibco 26050) Penicillin/streptomycin (Gibco 15140) Insulin (Sigma-Aldrich I9278) Aprotinin (Sigma Aldrich A1153) d-Luciferin (Biosynth L-8220) Enzyme-linked immunosorbent spot (ELISpot) assay plates (Hassa Laborbedarf, S2EM004M99)