Imaging bioluminescenza per la valutazione delle risposte immunitarie A seguito di impianto di tessuto cardiaco Composti (EHT)

Summary

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Abstract

Varie tecniche di ingegneria tissutale cardiaco sono stati perseguiti negli ultimi decenni anche le strategie di impalcature utilizzando nativi o bioartificiale materiali patibolo, intrappolamento dei miociti cardiaci in idrogel come la fibrina o collagene e di sovrapposizione dei monostrati miociti ^1. Questi concetti mirano al recupero della compromissione della funzione cardiaca (ad esempio dopo infarto miocardico) o come modelli sperimentali (es. tossicologia predittiva e screening sostanza o modelli di malattia). Monitoraggio preciso della sopravvivenza cellulare dopo l'impianto del tessuto cardiaco ingegnerizzati (EHT) è ora diventato possibile usare in vivo bioluminescenza imaging (BLI) Tecniche ^2. Qui si descrive la generazione di fibrina a base di EHT da un ceppo di topo transgenico con espressione ubiquitaria luciferasi di lucciola (ROSA / luciferasi-LEW Tg, ^3). L'impianto viene eseguito nel omento maggiore di ceppi di topo diversi per valutare le risposte immunitarie dell'organismo ricevente dopo l'impianto EHT. Confronto dei risultati generati dal BLI e la Enzyme Linked Immuno Tecnica Spot (ELISPOT) confermano l'utilizzabilità del BLI per la valutazione delle risposte immunitarie.

Protocol

1. EHT Generation e la cultura Condizioni

Fabbricazione di prodotti a base di fibrina EHT è stata eseguita come descritto altrove ^4. In breve, per generare fibrina basato EHT per scopi impianto, una master mix è stato preparato contenente cellule isolate da neonatale ROSA / luciferasi-LEW cuori di ratto transgenico, fibrinogeno bovina e Matrigel. Agarosio stampi sono stati preparati con distanziali in teflon posto in ben 6 piatti della cultura. Dopo la solidificazione di agarosio, distanziatori sono stati rimossi e rastrelliere messaggio silicone sono stati messi sui piatti della cultura con messaggi raggiungendo negli stampi. Per generare EHT, il Mastermix fu brevemente mescolato con un importo calcolato della trombina e pipettati nello stampo. Dopo la polimerizzazione del fibrinogeno, rack in silicone con EHTs aderendo alla posti sono stati delicatamente rimossi dalla stampi l'agarosio, trasferito al nuovo cambio a 6 e piatti di coltura cellulare e mantenuto a 37 ° C, 7% di CO ₂ colture cellulari incubatore usando su misura terreno di coltura delle cellule.

EHT sono stati tenuti in condizioni di coltura delle cellule fino a dieci giorni. Durante questo lasso di tempo, neonatale cellule del cuore di ratto cominciò a forma allungata, di interconnessione e allineare lungo linee di forza tra i messaggi di silicone. Al momento dell'impianto, spontanea coerente contrazioni sono state osservate, deviando i messaggi di silicone.

2. EHT impianto

EHT impianto è stato eseguito in entrambi i immunocompetenti Brown Norway (BN), ratti o topi immunodeficienti nudo per studiare la risposta immunitaria allogenico. Ratti BN e nudo peso di 100 - 150 g sono stati acquistati dalla Charles River Germania (Sandhofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld) e alloggiati in condizioni convenzionali, alimentati standard di ratto chow e libidum ad acqua. Topi immunodeficienti sono ospitati, in camera sterile, gabbie, e viene utilizzata acqua sterilizzata. Il comitato etico tedesco ha esaminato e approvato le procedure animali. Tutti gli strumenti chirurgici vengono sterilizzati prima dell'uso.

La procedura di impianto vengono effettuate come segue:

Rat sono anesthesized con isoflurano (2,5-3%) con una camera di induzione. L'esposizione umana a isoflurano può essere ridotto di lavoro in una tabella rovesciati o non ricircolo cappuccio. La temperatura corporea è mantenuta durante la procedura chirurgica.

1. Shave zona addominale e applicare una pomata oculare per evitare che gli occhi si secchi durante l'anestesia.
2. Posizionare il topo sul dorso e posto una maschera sul suo naso e la bocca per mantenere l'anestesia.
3. Disinfettare la zona addominale con Betadine e poi a 80% di etanolo. Tampone pulito da sporcare, dal centro dell'area rasata in movimento verso l'esterno verso l'area dai capelli.
4. Controllare riflessi pizzicare i piedi posteriori per essere sicuri che il topo è sufficientemente anestetizzati.
5. Drape l'animale ed effettuare una incisione addominale mediana che separa la pelle ei muscoli in due fasi per aprire l'addome. Sterilizzazione a caldo tallone viene utilizzato tra la pelle e l'apertura del muscolo.
6. Posto l'intestino in un guanto salina riscaldata idratata in polvere libera. Piegare il guanto intorno l'intestino per prevenire la perdita di umidità.
7. Rimuovere il tessuto adiposo ed esporre la milza.
8. Visualizzare e maggiore diffusione omento con una pinza.
9. Accuratamente tagliato EHT di sospendere i messaggi in silicone e di trasferimento nel omento maggiore.
10. Avvolgere maggiore è la omentus intorno al EHT e fissare con due singoli 7-0 suture prolene (Ethicon, Norderstedt)
11. Avanti spostare l'intestino nuovamente dentro l'addome.
12. Lavare l'addome preriscaldata con soluzione salina sterile.
13. Chiudere lo strato muscolare della parete addominale con suture 6-0 prolene esecuzione (Ethicon, Norderstedt, Germania).
14. Utilizzare 5-0 prolene (Ethicon, Norderstedt) in esecuzione suture per chiudere la pelle.
15. Mentre il topo è ancora in anestesia, iniettare 5 mg / kg per via sottocutanea Carprofen.
16. Per fornire l'analgesia sufficiente per questo tipo di procedura, un analgesico (come Metamizol) viene aggiunto all'acqua potabile (50 mg Metamizol per 100 ml) per farmaci antidolorifici per 3 giorni post-trapianto.

3. Imaging bioluminescenza di EHT impianto seguito

La piattaforma di bioimmagini IVIS (Xenogen, Alameda, CA, USA) è usato per imaging non invasiva bioluminescenza in vivo ei risultati sono analizzati utilizzando l'immagine vivente IVIS (Xenogen), pacchetto software. Imaging viene effettuata ogni giorno dalle 2 ore dopo l'intervento.

Anestetizzare ratto con isoflurano (2,5 - 3%) con una camera di induzione.

1. Disinfettare la zona addominale e toracica utilizzando ampiamente Provo-Iodio, utilizzare prossimi 80% di etanolo, ripetere questa operazione tre volte.
2. Iniettare d-Luciferin (Xenogen; 375 mg / kg di peso corporeo) ip
3. Luogo in topi anestetizzati l'imaging IVIS camera (fino a 4 ratti possono essere analizzati allo stesso tempo).
4. Valutare l'intensità del segnale di luc + cellule all'interno EHT in unità di fotoni / sec / cm ² / steridianin la regione di interesse (ROI) al basale (120 minuti dopo l'impianto) e nei giorni 1, 2, 3, 5, 7, 10, e alle settimane 2, 3 e 4. Si noti il ​​picco del segnale (sembra circa 20 minuti dopo il d-Luciferin iniezione).

Creare un grafico (Excel) che mostra l'intensità del segnale nel tempo.

4. Correlazione dei risultati BLI e ELISPOT

Le risposte immunitarie cellulari in-vivo in BN immunocompetenti e immunodeficienti topi nudi sono stati studiati dopo EHT trapianto. La milza di animali destinatario è stato raccolto 5 giorni dopo il trapianto EHT di isolare splenociti destinatario. ELISPOT con mitomicina-inibito EHTs (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) come stimolatore e 5 x10 ⁶ splenociti destinatario come cellule responder sono stati eseguiti secondo il protocollo del produttore (BD Biosciences) con IFN-γ e IL-4 rivestiti piastre di indagare TH1-, e la risposta TH2, rispettivamente. IFN-γ e IL-4 punti erano significativamente più alti nel immunocompetenti, modello rispetto al modello immunodeficienti (IFN-γ: p = 0,001; IL-4: p = 0,023; Student t-test).

5. Rappresentante dei risultati:

Figura 1. Correlazione dei risultati BLI e ELISPOT a) Il cellulare in vivo delle risposte immunitarie in immunocompetenti Brown Norvegia e topi immunodeficienti nudi sono stati studiati dopo l'impianto EHT. Splenociti destinatario sono state raccolte 5 giorni dopo l'impianto EHT. IFN? e IL-4 l'espressione è stata valutata mediante ELISPOT mitomicina inibito EHT come stimolatori e 5x106 splenociti destinatario come cellule responder. Risposte Th1 e Th2 sono risultati significativamente più elevati nel modello immunocompetenti rispetto al modello immunodeficienti come evidenziato da IFNγ e IL-4 produzione rispettivamente. b) Luc EHTs + sono state trapiantate in maggiore è la omentus delle due ratti BN immunocompetenti o immunodeficienti topi nudi. Sopravvivenza delle cellule in senso longitudinale è stata seguita da BLI. La percentuale di animali che ha respinto il EHTs trapiantato è presentato. Tutti i ratti BN rapidamente respinto l'trapianti EHT, mentre le cellule sopravvissute nei topi cellule T carente.

Discussion

Prima applicazione clinica della tecnologia EHT per la riparazione cardiaca, questioni fondamentali come l'immunogenicità di entrambi i componenti cellulari e la matrice o la sopravvivenza del trapianto dopo l'impianto devono essere valutati in modelli sperimentali. In-vivo di imaging bioluminescenza rappresenta una tecnica nuova e utile per la sopravvivenza delle cellule di monitoraggio dopo il trapianto . Siamo riusciti a base di fibrina generato EHT contenente luciferasi positivo (luc +) le cellule del cuore per l'adattamento di un consolidato protocollo ^4. Queste EHT sono stati impiantati nel omento maggiore di ratti destinatario. Iniezione intraperitoneale del substrato specifico (d-Luciferin) genera i segnali che erano rilevabili tramite la piattaforma di bioimmagini IVIS (Xenogen). L'intensità del segnale al basale (120 minuti dopo l'impianto), misurata in fotoni / sec / cm ² / steridian servito come parametro surrogato per il numero di cellule all'interno EHTs innestati. Misurazioni giornaliere consentite per non invasivo una valutazione del longitudinale di sopravvivenza del trapianto. In un modello di rifiuto, il declino di intensità del segnale nel tempo, era correlato con l'intensità e la cinetica del rigetto acuto in diversi ceppi di topo.

Materials

LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor-luc)11Jmsk rats (NBPR rat number 0299, http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/) Bovine fibrinogen (stock solution: 200 mg/ml plus aprotinin 5 μg/ml fibrinogen in NaCl 0.9%, Sigma F4753) Matrigel (BD Bioscience 356235) DMEM (Biochrome F0415) Horse serum (Gibco 26050) Penicillin/streptomycin (Gibco 15140) Insulin (Sigma-Aldrich I9278) Aprotinin (Sigma Aldrich A1153) d-Luciferin (Biosynth L-8220) Enzyme-linked immunosorbent spot (ELISpot) assay plates (Hassa Laborbedarf, S2EM004M99)