신경 소마와 Axons의 Compartmentalization위한 Microfluidic 장치의 제작

Summary

이 비디오에서 우리는 culturing의 뉴런에 microfluidic 장치를 farbricate을 사용 polydimethyl 실록산 (PDMS)과 소프트 리소그래피의 기술을 보여줍니다.

Abstract

이 비디오에서는, 우리는 culturing의 뉴런에 microfluidic 장치를 조작하는 데 사용 polydimethyl 실록산 (PDMS)과 소프트 리소그래피의 기술을 보여줍니다. 이전에는 실리콘 웨이퍼는 SU - 8과 마스터 금형을 만들 석판술, 또는 우리는 단순히 "마스터"로 무엇을 참조를 사용하여 신경 세포 microfluidic 장치의 디자인과 패턴했다. 다음, 우리는 다음 ° C 1 시간 80 PDMS를 가열하여 치료하는 마스터 위에 실리콘 고분자 PDMS 잔. PDMS는 장치의 부정적인 곰팡이를 형성합니다. PDMS 그런 다음 조심스럽게 자르고 마스터 떨어져 해제됩니다. 구멍은 저수지가 어디 부수고 초과 PDMS 거리 장치에서 손질하고 있습니다. 질소는 장치에서 초과 파편을 날려하는 데 사용됩니다. 이 시점에서 장치는 이제 사용 준비하거나, 플라즈마 살균기 / 세척기 또는 reversibly 단순히 커버 유리 위에 장치를 배치하여 덮개 유리에 바인딩 될 수있는 작업은 다음과 코닝 제 1 커버 유리 접착 수 있습니다. 유리 장치의 가역 본딩은 별도의 비디오로 덮여 있고 장치가 70 % 에탄올이나 autoclaving을 통해 소독하는 것이 첫번째 필요합니다. 더 이상 치료가 필요하지 않도록 플라즈마 치료는 장치를 sterilizes. 이것은 표면이 아직 친수성하는 동안 플라즈마 치료 10 분 이내에 장치에 액체 추가 장치를, 플라즈마는 - 대우 때, 그러나 중요합니다. 장치에 액체 추가하는 이상보다 10 분 정도 기다리는 것은 어려운 액체가 장치를 입력할 수 있도록합니다. 신경 장치는 일반적으로 유리와 산도 8.5 borate 버퍼의 0.5 MG / ML 폴리 - L - 라이신 (PLL)를 충당하기 위해 플라즈마 - 바운드 아르 즉시 장치에 추가됩니다. PLL과 잠복기 3 시간 최소 후, 장치는 각 씻어 사이에 적어도 15 분 dH2O의 물로 3 회 최소 씻어 있습니다. 다음, 물을 제거하고 신선한 미디어 장치에 추가됩니다. 이 시점에서 장치를 사용할 준비가되었습니다. 장치에서 모든 미디어를 제거하지 않았을이 시점에서 기억하는 것이 중요합니다. 항상 메인 채널에서 미디어를 두십시오.

Protocol

1 부 : microfluidic 신경 장치를 준비

1. 3 "석판술하여 SU - 8으로 만들어진 패턴으로 실리콘 웨이퍼는 Polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic 금형을 주조하는 데 사용됩니다. 우리는 마스터 금형, 또는 SU - 8 패턴 실리콘 웨이퍼를 참조"마스터 ".
2. PDMS가 10시 1분의 오 / W 비율로 치료 요원과 함께 혼합되어 그 PDMS의 10g를 위해이다, 치료 요원의 1g 그것에 추가됩니다.
3. PDMS 다음 잘 혼합하여 실리콘 웨이퍼 위에 부어 있습니다. 실리콘 웨이퍼는 10cm의 폴리스티렌 페트리 접시 안에 들어 있습니다. 그것은 약 4 mm의 두께로 마스터를 충당하기 위해 PDMS의 약 12​​g에 15g 걸립니다.
4. PDMS와 함께 마스터는 다음 페트리 접시에서 뚜껑이있는 진공 dessicator에 배치하고, 진공이 적용됩니다. 이것은 치료 에이전트에 감동하는 동안 도입된 PDMS에서 공기 방울을 제거하는 데 도움 이루어집니다. 이것은 기포가 생겼는 지 약 15 분 제거하는 정도 소요됩니다.
5. PDMS와 함께 마스터는 dessicator에서 제거됩니다. 0.45 음 필터와 공기총은 나머지 거품을 제거하는 데 사용됩니다.
6. 마스터가 다음 치료 1 시간 80 ° C 뜨거운 접시에 배치됩니다.

참고 : 진공 dessicator를 사용할 수없는 경우, 마스터가 몇 시간 동안 실온에서 남아있을 수 있습니다. 공기 방울은 결국 자신에 분산됩니다. 뜨거운 접시를 사용할 수없는 경우, PDMS 24 시간 후 실온에서 치료됩니다.

참고 : 마스터가 치료 과정 수준에 있는지 확인하는 것도 중요하다.

2 부 : 뉴런 microfluidic 장치를 절단

1. PDMS가 마스터에서 치료되면, 그것은 깨끗한 후드로 이동합니다.
2. 외과 블레이드를 사용하여 원형이 장치의 주위에 상처입니다. 때 하나 삽입 PDMS에 블레이드, 이것은 실리콘 웨이퍼와 접촉하도록하지만 웨이퍼에 너무 많은 부담을주지하는 것이 중요하다, 다른 마스터 균열 것입니다.
3. 원형의 장치 (각 3 "실리콘 마스터 당 사 장치가있다) 주변의 모든 방법을 잘라와 PDMS는 신중하게 마스터를 해제합니다. 그것이 이전 절단에 삽입되는 등 이것은 부드럽게 외과 블레이드를 복잡하게 시작할 수 있습니다 .
4. 다음 저수지는 8mm 조직 생검 펀치를 사용하여 장치에 펀치입니다.
5. 장치는 다음 등분하고 초과 PDMS는 장치 코닝 유리 커버 (번호 1) 24mm X 40mm에 맞게 깔끔하게 수 있도록 거리에 손질하고 있습니다. 질소 공기 초과 파편을 날려하는 데 사용됩니다. 고집 파편 또한 3M 스카치 브랜드 471 비닐 테이프를 사용하여 제거할 수 있습니다.

파트 3 : 플라즈마는 유리 커버 풀렸는데에 장치를 결합.

1. 플라즈마 클리너는 커버 전표에 Harrick은 신경 세포 장치 결합하는 데 사용됩니다. 간단히, 장치는 플라즈마 클리너에 배치하고 진공 펌프는 챔버에서 공기를 대피하는 데 사용됩니다.
2. 진공 압력은 300 milliTorr에 도달하면, 전력은 전기 코일에 켜져 고로 설정되어 있습니다.
3. - 전기 코일은 "전자, 이온 및 중성 원자 또는 분자로 구성된 부분적으로 이온화 가스"플라즈마를 생성 http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php 밖으로 남아있는 공기 분자의 챔버에 남아. 플라즈마는 유리와 영구 채권을 형성합니다 함께 배치하면 장치의 표면에 반응 종을 만듭니다. 플라즈마는 액체의 추가를 용이하게하는 데 도움이 친수성 ​​표면을 켭니다. 또한, 플라즈마 청소기 장치를 sterilizes.
   
   microfluidic 장치가 들어있는 PDMS 장치의 표면은 유리 슬라이드와 함께 플라즈마 클리너로 얼굴을 배치됩니다.
   
   유리와 microfluidic 장치의 플라즈마 표면 처리 후 무균 60mm 요리에 배치, 깨끗한 벤치에서 서로 연락을 조립하고 있습니다. 처리 표면 꽉 돌이킬 유대를 형성하고 있습니다.
   
4. 플라즈마는 유리에 장치를 결합 10 분 이내, 폴리 - L - 라이신 (PLL)가 장치에 추가됩니다. 십분 후, 장치의 친수성은 어렵게 PLL이 장치를 입력할 수 있도록하고 감소합니다.
   
   참고 : PLL의 추가 후 장치에 기포를 확인하는 것이 중요합니다. 그들은 세포를 산화처럼 기본 채널에 공기 방울이 원하지 않는 수 있습니다. 기존의 기포를 제거하는 쉬운 방법은 액체의 150 UL (이 경우 PLL)를 가득 P200 pipet을 사용하는 것입니다, 메인 채널의 개통에 직접 팁을 장소, 강제 P200를 놓으면 되죠. 이것은 여러 번 반복해야 할 수도 있지만 pipet에서 결국 힘이 거품을 몰아 것입니다.
   
   
5. PLL을 포함하는 장치는 37 표준 조직 문화 인큐베이터에서 하룻밤 부화 허용 ° C와 5 % CO _2.
6. 다음날, 드나쁜가 autoclaved dH2O로 두 번 빠르게 씻어서 있습니다. 이 과정에서, 액체는 완전히에서만 저수지에서 메인 채널에서 제거되지 않습니다. 기본 채널에서 액체를 제거하면 거품을 소개합니다. 이 빠른 rinses 후, 장치는 autoclaved dH2O 가득한 3 시간 최소 인큐베이터에 다시 배치하거나,​​ 하룻밤 있습니다.
7. 그 다음날, 장치가 다시 한 번 autoclaved dH2O 2 배 빨리 씻어서 있습니다. 그런 다음, 필요한 보조제 culturing 기본 쥐의 뉴런에 B27 및 glutamax를 포함하는 신경 기저 미디어, 장치에 추가됩니다. 장치는 나중에 사용하기 위해 인큐베이터에 다시 배치됩니다. 디바이스는 이제 뉴런의 시딩에 대한 준비가되어 있습니다.

Discussion

이 비디오에서 우리는 장치가 우리 세포 기관, dendrites, 그리고 axons의 혼합을 포함하는 구획에서 microgrooves로 구분하여 순수한 axonal 분수를 얻을 수 있도록 인치 우리 문화 뉴런하는 데 사용되는 PDMS microfluidic 장치를 만들고 준비하는 방법을 입증해야 . 이러한 장치는 연구자가 다양한 치료의 효과를 연구뿐만 아니라 axons에 신체 부상을 수행하고 이러한 치료가 뉴런에 미칠 영향을 어떻게 관찰할 수있는 플랫폼을 제공하실 수 있습니다. 이 디바이스는 또한 수송 연구를 촉진하는 데 도움이 culturing의 뉴런을 위해 수준을 제공합니다. 또한, 축삭 구획에서 세포 배양 구획을 별도 microgrooves은, 그것이 가능한 치료와 직접 장치의 반대편을 effecting없이 장치의 한쪽을 치료하는 두 구획 사이의 유체 절연을 허용합니다. 이 속성은 연구자가 이러한 신호 전달 및 전송 치료에서 해당 결과로 효과를 공부하실 수 있습니다.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Reagent	Dow Corning		Sylgard 184 with curing agentPlease consult Dow Corning to find a vendor near you
Plasam Cleaner	Tool	Harrick Scientific Products, Inc.		http://www.harrickplasma.com/
Neural Basal Media	Reagent	Invitrogen	21103-049	Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
B27	Reagent	Invitrogen	17504-044	B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax	Reagent	Invitrogen	35050-061	Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.
Cornig No. 1 Cover Glass	cover glass	Corning	Corning No. X2935 244	Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D
60 mm Petri Dish	Tool	Fisher Scientific	08-757-13A	60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass.
BD Falcon 50 ml Tube	Tool	BD Biosciences	Falcon No. 352098	Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A
BD Falcon 15 ml tube	Tool	BD Biosciences	Falcon No. 352097	Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C
Poly-L-Lysine	Reagent	Sigma-Aldrich	P-1274
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