条块索玛的神经元和轴突的一个微流体设备制造

Summary

在这个视频中，我们展示了与我们使用farbricate为培养神经元的微流体装置的聚二甲基硅氧烷（PDMS）软光刻技术。

Abstract

在这段视频中，我们展示了与聚二甲基硅氧烷（PDMS）中，我们使用微流体设备制造为培养神经元的软光刻技术。此前，在硅晶片是使用SU - 8和光刻创建一个母模，或我们简称为“大师”的神经元微流体设备的设计图案。下一步，我们倒上，然后由固化的硅橡胶加热到80 ° C，1小时的主顶部硅聚合物的PDMS。将PDMS形式的装置的负面模具。将PDMS然后小心地从主削减和取消。孔打孔水库将多余的PDMS削去从设备。氮是用于从设备吹走多余的碎片。在这一点上的设备现在准备使用，可以与等离子灭菌器/清洁剂或可可逆的约束，只需将设备上的玻璃盖顶的玻璃盖保税1号康宁玻璃盖。设备可逆的粘接到玻璃覆盖在一个单独的视频，首先需要用70％乙醇或由高压灭菌消毒设备。等离子体处理消毒设备，所以没有进一步的治疗是必要的的。然而，这是重要的，当等离子体处理设备，补充液体在10分钟的等离子体处理设备，而表面仍亲水。等待超过10分钟，加液设备，使人们难以对液体进入设备。神经元的设备通常是等离子体约束的玻璃盖和0.5 mg / ml的聚- L -赖氨酸（PLL）在pH 8.5的硼酸盐缓冲液是立即添加到设备。至少3小时，带PLL的孵化后，设备与dH2O水冲洗至少15分钟，彼此之间洗净，最小的3倍。下一步，水添加到设备和新媒体。在这一点上，该设备已准备就绪。重要的是要记住这一点从来没有从设备中取出所有的媒体。始终离开媒体的主渠道。

Protocol

第1部分：准备在微流体神经设备

1. 3“与SU - 8的模式，通过光刻硅片用于铸造的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控模具，我们指的SU - 8图案硅作为主模具，或晶圆的”主人“。
2. PDMS的是在胡/ W 10:1固化剂混合，也就是10克的硅橡胶，固化剂1克添加到它。
3. PDMS然后混合均匀，浇到硅片。硅片是包含在一个10厘米的聚苯乙烯培养皿。这需要约12克到15克的PDMS的覆盖，厚度约4毫米的主。
4. 的PDMS的主站，然后放置在真空dessicator关闭培养皿的盖子，真空应用。这样做是为了帮助取出硅橡胶的固化剂搅拌过程中引入的气泡。它需要大约15分钟的气泡被删除。
5. 与PDMS的主从dessicator删除。与0.45 UM过滤空气枪是用来删除任何剩余的气泡。
6. 主，然后放置在80 ° C为1小时治愈的热点板块。

注 ：真空dessicator如果不可用，主可在室温下了好几个小时。自己的气泡，最终会消散。如果一个热点板块是不可用的PDMS在室温下固化24小时后。

注 ：同样重要的是确保在固化过程中，主级。

第2部分：切割出的神经元微流体装置

1. 一旦主治愈的PDMS，这是到一个干净的引擎盖。
2. 使用手术刀片，一个圆圈周围的外围设备的削减。当刀片插入到的PDMS，重要的是使硅片的接触，但没有把在晶圆上的压力太大，否则主人会开裂。
3. 一个圆切周围所有的设备（有4％每3“硅主设备）的方式，是经过精心的PDMS升空主，这可以通过轻轻扭转手术的刀片开始，因为它是插入到前削减。
4. 下一步，水库打孔用8毫米的组织活检冲压设备。
5. 然后驻扎该设备和过剩的PDMS削除该设备适合整齐康宁玻璃盖（第1号）24毫米× 40毫米。氮空气吹走多余的碎片。顽固的碎片也可以使用3M苏格兰品牌471聚氯乙烯绝缘带被删除。

第3部分：等离子粘接玻璃盖玻片设备。

1. 等离子清洗机是用于一个Harrick神经元的设备盖玻片债券。简单地说，设备是放置在等离子清洁和真空泵是用来疏散室的空气。
2. 在真空压力已达到300 mTorr的，电源是开启的电器线圈，并设置为高。
3. 电器线圈创建血浆，“电子，离子和中性原子或分子组成的一个部分电离气体” - http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php剩余的空气分子，留在会议厅内。血浆上创建的玻璃表面和设备，放在一起时会形成一个永久性的债券的活性物种。等离子也变成表面的亲水性，这有助于除了液体。此外，等离子清洁消毒设备。
   
   表面的PDMS设备包含微流体装置被放置到面对等离子体清洁玻片。
   
   在洁净工作台组装的玻璃和微流体装置的等离子体处理的表面相互接触，然后放置在无菌的60 mm培养皿。经处理后的表面形成一个严密的不可逆的债券。
   
4. 聚- L -赖氨酸（PLL）是在10分钟的等离子体对玻璃粘接设备，添加到设备。 10分钟后，将减少设备的亲水性使其难以为PLL输入设备。
   
   注 ：重要的是要检查设备中的气泡后增加的PLL。气泡中的主渠道是不可取的，因为它们会氧化细胞。删除任何现有的气泡，一个简单的方法是使用P200的吸管，充满液体的150 UL（在这种情况下，锁相环），将针尖直接在开放的主渠道，并抑制了P200的有力。这可能需要反复多次，但最终从吸管的力量将驱动器的气泡。
   
   
5. 含有锁相环的设备可以在一个标准的组织培养箱内培养过夜孵育37℃，5％的CO _2。
6. 第二天，德恶习冲洗两次快速灭菌dH2O。在这个过程中，液体是从来没有完全消除的主渠道，只能从水库。卸下液体从主渠道，将引入气泡。 2快速冲洗后，设备充满蒸压dH2O，放入孵化器至少3小时或过夜。
7. 第二天，设备再次冲洗2次快速灭菌dH2O。然后，基底神经介质，含有B27与培养原代大鼠神经元的glutamax必要的补充，添加到设备。该设备放置在孵化器，以供将来使用。该设备是目前神经元的播种做好准备。

Discussion

在这个视频中，我们已经演示了如何制作和准备，我们用文化的神经元一个的PDMS微流控设备英寸的设备使我们能够获得一个纯粹的轴突分数从车厢内含有混合的细胞体，树突和轴突microgrooves分隔。这些设备允许研究者研究各种治疗方法的影响，以及提供一个平台，进行物理损伤的轴突和观察这些疗法对神经元有什么样的影响。该器件还提供了一种秩序的水平，以培养神经细胞，有助于运输研究。此外，microgrooves，从轴突舱分离的细胞培养室，可以为两者之间的车厢，使得它可以治疗，但不会影响设备的另一端直接与治疗设备的一侧流体隔离。此属性使研究人员的研究，如信号转导和运输，从处理结果的影响。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Reagent	Dow Corning		Sylgard 184 with curing agentPlease consult Dow Corning to find a vendor near you
Plasam Cleaner	Tool	Harrick Scientific Products, Inc.		http://www.harrickplasma.com/
Neural Basal Media	Reagent	Invitrogen	21103-049	Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
B27	Reagent	Invitrogen	17504-044	B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax	Reagent	Invitrogen	35050-061	Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.
Cornig No. 1 Cover Glass	cover glass	Corning	Corning No. X2935 244	Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D
60 mm Petri Dish	Tool	Fisher Scientific	08-757-13A	60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass.
BD Falcon 50 ml Tube	Tool	BD Biosciences	Falcon No. 352098	Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A
BD Falcon 15 ml tube	Tool	BD Biosciences	Falcon No. 352097	Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C
Poly-L-Lysine	Reagent	Sigma-Aldrich	P-1274
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