Fabrication d'un dispositif microfluidique pour la compartimentation du Neuron Soma et des axones

Summary

Dans cette vidéo, nous démontrons la technique de lithographie douce polydiméthylsiloxane (PDMS) que nous utilisons pour farbricate un dispositif microfluidique pour les neurones en culture.

Abstract

Dans cette vidéo, nous démontrons la technique de lithographie douce polydiméthylsiloxane (PDMS) que nous utilisons pour fabriquer un dispositif microfluidique pour les neurones en culture. Auparavant, une tranche de silicium a été modelé à la conception pour le neurone dispositif microfluidique en utilisant SU-8 et la photolithographie à créer un moule maître, ou tout simplement ce que nous appelons un "maître". Ensuite, nous versons le silicium polymère PDMS sur le dessus du maître, qui est ensuite durci par chauffage de l'PDMS à 80 ° C pendant 1 heure. Le PDMS forme un moule négatif de l'appareil. Le PDMS est ensuite soigneusement coupés et levé loin du maître. Des trous sont perforés où les réservoirs seront et l'excès de PDMS parés loin de l'appareil. L'azote est utilisé pour souffler les débris excès de l'appareil. A ce point les appareils sont maintenant prêts à utiliser et peut soit lié à Corning n ° 1 couvercle en verre avec un plasma stérilisateur / nettoyant ou peut être liée de façon réversible à l'couvercle en verre en plaçant simplement l'appareil sur le dessus du couvercle en verre. Le collage réversible de l'appareil est recouvert de verre dans une vidéo séparée et exige d'abord que le dispositif soit stérilisés soit à l'éthanol 70% ou par autoclavage. Plasma traitement stérilise les périphériques ainsi aucun autre traitement n'est nécessaire. Il est cependant important, quand plasma traitant les dispositifs, d'ajouter du liquide à l'appareil dans les 10 minutes de traitement par plasma alors que les surfaces sont encore hydrophile. Attendre plus longtemps que 10 minutes pour ajouter du liquide à l'appareil, il est difficile pour le liquide d'entrer dans le dispositif. Les dispositifs de neurones sont généralement plasma lié à couvercle en verre et 0,5 mg / ml de poly-L-lysine (PLL) dans un tampon borate pH 8,5 est immédiatement ajouté à l'appareil. Après un minimum de 3 heures d'incubation avec PLL, les appareils sont lavés à l'eau dH2O un minimum de 3 fois avec au moins 15 minutes entre chaque lavage. Ensuite, l'eau est éliminée et les médias frais est ajouté à l'appareil. A ce point l'appareil est prêt à l'emploi. Il est important de se rappeler à ce stade de ne jamais supprimer tous les médias de l'appareil. Toujours laisser les médias dans le chenal principal.

Protocol

Partie 1: Préparation de l'appareil neurone microfluidique

1. A 3 "wafer de silicium avec un motif faite de SU-8 par photolithographie est utilisée pour lancer le polydiméthylsiloxane (PDMS) moule microfluidique. Nous nous référons à l'SU-8 plaquette de silicium à motifs comme moules maître, ou« maîtres ».
2. PDMS est mélangé avec l'agent de durcissement à p / p ratio de 10:1, qui est, pour 10 grammes de PDMS, 1 gramme de durcisseur est ajouté.
3. Le PDMS est ensuite bien mélangé et versé sur la plaquette de silicium. La plaquette de silicium est contenu dans un 10 cm de polystyrène boîte de Petri. Il faut environ 12 g à 15 g de PDMS afin de couvrir le maître d'une épaisseur de 4 mm environ.
4. Le maître avec le PDMS est ensuite placé dans un dessiccateur à vide avec le couvercle de la boîte de Petri, et le vide est appliqué. Ceci est fait pour aider à éliminer les bulles d'air du PDMS qui ont été introduites au cours de l'agitation dans de l'agent de durcissement. Il faut environ 15 minutes pour les bulles d'air d'être enlevé.
5. Le maître avec PDMS est retiré de la dessiccateur. Un pistolet à air avec un filtre de 0,45 um est utilisé pour enlever les bulles restantes.
6. Le maître est alors placé sur une plaque de 80 ° C pendant 1 heure chaude de guérir.

Remarque: Si un dessicateur sous vide n'est pas disponible, le maître peut être laissé à température ambiante pendant plusieurs heures. Les bulles d'air éventuellement dissiper par leurs propres moyens. Si une plaque chauffante n'est pas disponible, le PDMS se durcir à température ambiante après 24 heures.

Remarque: Il est également important de s'assurer que le maître est de niveau pendant le processus de durcissement.

Partie 2: Découpage du périphérique neurone microfluidique

1. Une fois que le PDMS est guéri sur le maître, il est pris d'une hotte propre.
2. En utilisant une lame chirurgicale, un cercle est coupé autour du périmètre de ces dispositifs. Quand on insère la lame dans le PDMS, il est important de prendre contact avec la plaquette de silicium, mais de ne pas mettre trop de pression sur la plaquette, sinon le maître va se fissurer.
3. Avec un cercle coupé tout autour des appareils (il ya 4 appareils par chacun 3 "Maître de silicium), le PDMS est soigneusement décollé le maître. Cela peut être démarré en tordant avec précaution la lame chirurgicale car il est inséré dans la coupe avant .
4. Ensuite, les réservoirs sont perforées dans l'appareil en utilisant un 8 mm biopsie punch.
5. Les appareils sont ensuite écartelé et l'excès de PDMS parés de suite afin que le dispositif s'adapte parfaitement sur Corning Couvercle en verre (n ° 1) 24 mm x 40 mm. L'azote de l'air est utilisé pour souffler les débris excès. Les débris tenaces peuvent aussi être retirés à l'aide de 3M Scotch 471 ruban vinyle.

Partie 3: Plasma collage des dispositifs à lamelles de verre.

1. Nettoyant plasma est utilisé pour coller une Harrick les appareils neurone à l'lamelles. Brièvement, les appareils sont placés dans le nettoyeur plasma et une pompe à vide est utilisée pour évacuer l'air de la chambre.
2. Après la dépression a atteint 300 milliTorr, est sous tension à la bobine électrique et un réglage élevé.
3. La bobine électrique crée le plasma ", un gaz partiellement ionisé composé d'électrons, des ions et des atomes ou molécules neutres» - http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php , sur les molécules d'air restant dans la chambre de gauche. Le plasma crée des espèces réactives à la surface du verre et du dispositif qui, lorsque mis ensemble forment une liaison permanente. Le plasma se transforme aussi les surfaces hydrophiles, ce qui facilite l'ajout de liquides. De plus, le nettoyeur de plasma stérilise les dispositifs.
   
   La surface de l'appareil PDMS qui contient le dispositif microfluidique est placée face visible dans le nettoyeur de plasma avec les lames de verre.
   
   Les surfaces traitées plasmatique du verre et du dispositif microfluidique sont assemblés en contact les uns avec les autres sur un banc propre, puis placé dans stériles boîtes de 60 mm. Les surfaces traitées former un lien étroit irréversible.
   
4. Dans les 10 minutes de plasma liant les périphériques au verre, poly-L-Lysine (PLL) est ajouté à l'appareil. Après 10 minutes, l'hydrophilie de l'appareil diminue ce qui rend difficile pour le PLL pour entrer dans le dispositif.
   
   Note: Il est important de vérifier les bulles d'air dans l'appareil après l'ajout de la PLL. Les bulles d'air dans le canal principal sont indésirables, comme ils le feraient oxydent les cellules. Une méthode facile pour enlever les bulles d'air existante est d'utiliser une pipette remplie P200 avec 150 ul de liquide (dans ce cas PLL), placez la pointe directement à l'ouverture du canal principal, et appuyer sur le P200 avec force. Ce peut être nécessaire de répéter plusieurs fois, mais finalement la force de la pipette conduira les bulles.
   
   
5. Les appareils contenant PLL sont autorisés à incuber pendant la nuit dans une norme incubateur de culture tissulaire à 37 ° C avec 5% de CO _2.
6. Le lendemain, le devices sont rincées deux fois rapidement avec autoclave dH2O. Pendant ce processus, le liquide n'est jamais entièrement retiré des canaux principaux, seulement à partir des réservoirs. En enlevant le liquide des canaux principaux apparition de bulles. Après deux rinçages rapides, les périphériques sont remplis avec autoclave dH2O et replacée dans l'incubateur pour un minimum de 3 heures ou toute la nuit.
7. Le lendemain, les appareils sont à nouveau rincées 2 fois rapidement avec autoclave dH2O. Ensuite, les médias neurones basale, contenant les suppléments nécessaires B27 et glutamax pour les neurones primaires de rat en culture, est ajoutée aux périphériques. Les appareils sont replacés dans l'incubateur pour une utilisation future. Les appareils sont maintenant prêts pour l'ensemencement des neurones.

Discussion

Dans cette vidéo, nous avons démontré comment faire et préparer un dispositif microfluidique en PDMS que nous utilisons pour la culture des neurones po L'appareil nous permet d'obtenir une fraction pure axonale séparés par microsillons du compartiment contenant un mélange de corps cellulaires, des dendrites et des axones . Ces dispositifs permettent au chercheur d'étudier les effets des différents traitements ainsi que de fournir une plate-forme pour mener à bien des blessures physiques sur les axones et observer les effets de ces traitements ont sur les neurones. L'appareil offre également un niveau d'ordre pour les neurones en culture qui contribue à faciliter les études de transport. En outre, les microsillons, qui séparent le compartiment de culture cellulaire à partir du compartiment axonal, permet d'isoler fluidique entre les deux compartiments permettant de traiter d'un côté de l'appareil sans affecter l'autre côté de l'appareil directement avec le traitement. Cette propriété permet au chercheur d'étudier les effets tels que la transduction du signal et de transport qui résultent du traitement.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Reagent	Dow Corning		Sylgard 184 with curing agentPlease consult Dow Corning to find a vendor near you
Plasam Cleaner	Tool	Harrick Scientific Products, Inc.		http://www.harrickplasma.com/
Neural Basal Media	Reagent	Invitrogen	21103-049	Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
B27	Reagent	Invitrogen	17504-044	B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax	Reagent	Invitrogen	35050-061	Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.
Cornig No. 1 Cover Glass	cover glass	Corning	Corning No. X2935 244	Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D
60 mm Petri Dish	Tool	Fisher Scientific	08-757-13A	60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass.
BD Falcon 50 ml Tube	Tool	BD Biosciences	Falcon No. 352098	Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A
BD Falcon 15 ml tube	Tool	BD Biosciences	Falcon No. 352097	Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C
Poly-L-Lysine	Reagent	Sigma-Aldrich	P-1274
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