Summary
I denna video visar vi tekniken för mjuk litografi med polydimethyl siloxan (PDMS) som vi använder för att farbricate en mikroflödessystem anordning för odling nervceller.
Abstract
I denna video visar vi tekniken för mjuk litografi med polydimethyl siloxan (PDMS) som vi använder för att tillverka en mikroflödessystem anordning för odling nervceller. Tidigare var en kiselskiva mönstrad med designen för neuron mikroflödessystem enheten med SU-8 och fotolitografi att skapa en mästare mögel, eller vad vi helt enkelt kallar för ett "master". Sedan häller vi kisel polymeren PDMS på toppen av befälhavaren som sedan botas genom uppvärmning av PDMS till 80 ° C i 1 timme. De PDMS bildar en negativ form av enheten. Den PDMS är sedan försiktigt klippa och lyfts bort från mastern. Hålen stansas där reservoarerna kommer att bli och överskottet PDMS putsas bort från enheten. Kväve används för att blåsa bort överflödigt skräp från enheten. Vid denna punkt enheterna är nu klar att användas och kan antingen limmas till Corning Nr 1 skyddsglas med en plasma autoklav / rengöringsmedel eller kan reversibelt bundna till täckglaset genom att helt enkelt placera enheten på toppen av locket glas. Den reversibla bindning av enheten för att glaset är täckt i en separat video och kräver först att enheten steriliseras antingen med 70% etanol eller genom autoklavering. Plasma behandla steriliserar enheterna så ingen ytterligare behandling krävs. Det är dock viktigt, när plasma-behandling enheterna, för att lägga till vätska för att enheterna inom 10 minuter plasma behandling medan ytorna är fortfarande hydrofil. Väntar längre än 10 minuter att lägga vätska till enheten gör det svårt för vätskan att komma in i enheten. Neuron enheter är vanligtvis plasma-bundet för att täcka glas och 0,5 mg / ml poly-L-lysin (PLL) i pH 8,5 boratbuffert läggs direkt till enheten. Efter minst 3 timmar inkuberar med PLL, är enheterna tvättas med dH2O vatten minst 3 gånger med minst 15 minuter mellan varje tvätt. Därefter är vattnet bort och färska media läggs till enheten. Vid denna punkt enheten är klar att användas. Det är viktigt att komma ihåg vid det här laget att aldrig ta bort all media från enheten. Lämna alltid media i den viktigaste kanalen.
Protocol
Del 1: Förbereda mikroflödessystem neuron enhet
- En 3 "kiselskiva med ett mönster gjort av SU-8 som fotolitografi används för att gjuta Polydimetylsiloxan (PDMS) mikroflödessystem mögel. Vi hänvisar till SU-8 mönstrade kiselskiva som master formar, eller" mästare ".
- PDMS är blandad med härdare på aw / v på 10:1, det vill säga för 10 gram PDMS är 1 gram härdare läggas till.
- Den PDMS är då blandas väl och hällde ut på kiselskiva. Den kiselskiva finns i en 10 cm polystyren petriskål. Det tar ca 12 g till 15 g PDMS att täcka befälhavaren med en tjocklek av ca 4 mm.
- Befälhavaren med PDMS placeras sedan i ett vakuum exsickator med locket på petriskål, och vakuum tillämpas. Detta görs för att ta bort luftbubblor från PDMS som infördes under omrörning i den härdare. Det tar ungefär 15 minuter för luftbubblor tas bort.
- Befälhavaren med PDMS tas bort från exsickatorn. En luft pistol med en 0,45 um-filter används för att avlägsna alla återstående luftbubblor.
- Befälhavaren placeras sedan på en 80 ° C värmeplatta i 1 timme för att bota.
Observera: Om ett vakuum exsickator inte är tillgänglig, kan befälhavaren lämnas i rumstemperatur i flera timmar. Luftbubblorna så småningom kommer att försvinna på egen hand. Om en värmeplatta inte är tillgänglig, kommer PDMS härdar i rumstemperatur efter 24 timmar.
OBS: Det är också viktigt att se till att befälhavaren nivå under härdningsprocessen.
Del 2: klippa ut neuron mikroflödessystem enhet
- När PDMS är botad på master, tas det till en ren huva.
- Med hjälp av en kirurgisk kniv, är en cirkel skär i ytterkanten av enheterna. När man sätter kniven i PDMS är det viktigt att få kontakt med kiselskiva men att inte sätta för mycket press på skivan, annars befälhavaren kommer att spricka.
- Med en cirkel skär hela vägen runt enheter (finns 4 enheter per varje 3 "Silicon Master) är PDMS försiktigt lyftas av befälhavaren. Detta kan startas genom att försiktigt vrida den kirurgiska bladet som sätts in i förväg skära .
- Vidare är reservoarer stansas in i enheten med en 8 mm vävnad biopsi punch.
- Enheterna är sedan styckad och överskott PDMS trimmas bort så att enheten passar perfekt på Corning skyddsglas (nr 1) 24 mm x 40 mm. Kväve luft används för att blåsa bort överflödigt skräp. Envisa skräp kan också tas bort med 3M Scotch Brand 471 isoleringstejp.
Del 3: Plasma bindning enheterna som glider skyddsglaset.
- Plasma Cleaner används för obligation A Harrick neuron enheter till täckglas. I korthet är de anordningar som placeras i plasma renare och en vakuumpump används för att evakuera luft från kammaren.
- Efter vakuumtryck har nått 300 milliTorr, är makt påslagen på den elektriska spolen och ställ in högt.
- Den elektriska spole skapar plasma ", en delvis joniserad gas bestående av elektroner, joner och neutrala atomer eller molekyler" - http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php , ut av de återstående luftmolekylerna kvar i kammaren. Plasma skapar reaktiva ämnen på ytan av glaset och enheten, som när den placeras tillsammans bildar en permanent band. Plasman visar också de ytor hydrofila, som hjälper underlättar tillägget av vätskor. Dessutom steriliserar plasma renare enheterna.
Ytan på PDMS enhet som innehåller mikroflödessystem enheten placeras med framsidan upp i plasma renare tillsammans med glasskivor.
I plasma behandlade ytor av glas och mikroflödessystem enhet monteras i kontakt med varandra på en ren bänk, sedan placeras i sterila 60 mm rätter. Den behandlade ytor bildar en tät oåterkallelig bindning. - Inom 10 minuter av plasma bindning enheterna till glas, är poly-L-lysin (PLL) läggas till enheten. Efter 10 minuter kommer hydrofila av enheten minskar vilket gör det svårt för PLL att komma in i enheten.
OBS: Det är viktigt att kontrollera om det finns luftbubblor i enheten efter tillsats av PLL. Luftbubblor i huvudkanalen är önskvärda, eftersom de skulle oxidera celler. En enkel metod för att ta bort alla befintliga luftbubblor är att använda en P200 pipett fylld med 150 ul vätska (i detta fall PLL), placera spetsen direkt vid öppnandet av de viktigaste kanal, och tryck in P200 kraftfullt. Detta kan behöva upprepas flera gånger men så småningom kraften från pipettera kommer att driva ut bubblorna. - Enheterna innehåller PLL får inkubera över natten i en vanlig vävnadsodling inkubator vid 37 ° C med 5% CO 2.
- Nästa dag, den deter sköljs snabbt två gånger med autoklaveras dH2O. Under denna process är flytande aldrig helt bort från de största kanalerna, bara från reservoarerna. Ta bort vätska från de viktigaste kanalerna kommer att introducera bubblor. Efter 2 snabba sköljningar, är de enheter som fylls med autoklaveras dH2O och läggs tillbaka i inkubatorn i minst 3 timmar eller över natten.
- Nästa dag är enheterna återigen sköljas två gånger snabbt med autoklaveras dH2O. Då är neurala basala medier, med nödvändiga tillägg B27 och glutamax för odling primära råtta neuron, läggas till enheterna. Enheterna är placerade bak i kuvös för framtida bruk. Enheterna är nu redo för sådd av nervceller.
Discussion
I denna video har vi visat hur man gör och förbereda ett PDMS mikroflödessystem enhet som vi använder för att kulturen nervceller i. Enheten tillåter oss att få en ren axonal bråkdel separerade med microgrooves från facket som innehåller en blandning av cellens organ, dendriter och axoner . Dessa enheter kan forskaren att studera effekterna av olika behandlingar samt ge en plattform för att utföra fysisk skada på axoner och observera vilka effekter dessa behandlingar har på nervceller. Enheten ger också en nivå för att odla nervceller som hjälper till att underlätta transport studier. Dessutom tillåter microgrooves som separata facket cellodling från axonet facket, för fluidic isolering mellan de två kamrarna vilket gör det möjligt att behandla en sida av enheten utan att påverka den andra sidan av enheten direkt med behandling. Den här egenskapen kan forskaren att studera effekter som signaltransduktion och transport som är resultatet av behandlingen.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 with curing agentPlease consult Dow Corning to find a vendor near you | |
| Plasam Cleaner | Tool | Harrick Scientific Products, Inc. | http://www.harrickplasma.com/ | |
| Neural Basal Media | Reagent | Invitrogen | 21103-049 | Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| B27 | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| Glutamax | Reagent | Invitrogen | 35050-061 | Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents. |
| Cornig No. 1 Cover Glass | cover glass | Corning | Corning No. X2935 244 | Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D |
| 60 mm Petri Dish | Tool | Fisher Scientific | 08-757-13A | 60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass. |
| BD Falcon 50 ml Tube | Tool | BD Biosciences | Falcon No. 352098 | Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A |
| BD Falcon 15 ml tube | Tool | BD Biosciences | Falcon No. 352097 | Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C |
| Poly-L-Lysine | Reagent | Sigma-Aldrich | P-1274 | |
| New Item |
References
- Park, J. W., Vahidi, B., , A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).
