الزاجل فحوصات تنافسية لدراسة غوت - مدار هجرة الخلايا التائية

Summary

تجارب صاروخ موجه تنافسية تسمح لتقييم الخصائص الكثيرة مباشرة من اثنين من السكان مختلفة من الخلايا في ماوس واحدة. نحن هنا لتوضيح هذا الإجراء من خلال مقارنة الهجرة من خارج الحي ولدت مدار - الأمعاء مقابل عدم الأمعاء مدار الخلايا التائية.

Abstract

من أجل ممارسة وظيفتها اللمفاويات الحاجة إلى مغادرة الدم وتهاجر إلى الأنسجة المختلفة في الجسم. التصاق الخلايا اللمفاوية لخلايا بطانة الأوعية الدموية والأنسجة التسرب هو عملية متعددة الخطوات التي تسيطر عليها التصاق جزيئات مختلفة (صاروخ موجه المستقبلات) في الخلايا الليمفاوية وأعرب كل منهما يغاندس (addressins) المعروضة على الخلايا البطانية ^{1 2.} على الرغم من يمكن أن تكون وظيفة هذه المستقبلات التصاق درس جزئيا خارج الحي ، والاختبار النهائي لأهميتها الفسيولوجية هو تقييم دورها في خلال التصاق الخلايا اللمفاوية فيفو والهجرة. وقد استخدمت استراتيجيتين تكميلية لهذا الغرض : intravital المجهري (IVM) ، وتجارب صاروخ موجه. على الرغم من IVM كانت ضرورية لتحديد دقيق للمساهمة مستقبلات الالتصاق محددة خلال تتالي التصاق في الوقت الحقيقي والأنسجة المختلفة ، IVM تستغرق وقتا طويلا وتتطلب عمالة مكثفة ، فإنه غالبا ما يتطلب تطوير تقنيات جراحية متطورة ، فإنها بحاجة إلى العزلة من قبل متجانسة السكان الخلية ويسمح تحليل واحد فقط الجهاز / الأنسجة في أي وقت من الأوقات. على النقيض من ذلك ، والتجارب صاروخ موجه تنافسية تسمح المقارنة المباشرة والفورية في الهجرة من اثنين (أو أكثر) مجموعات فرعية خلية في الماوس نفسه ، وأنها تسمح أيضا تحليل العديد من الأنسجة وعدد كبير من الخلايا في التجربة نفسها.

نحن هنا وصف الكلاسيكية بروتوكول صاروخ موجه تنافسية استخدمت لتحديد ميزة / الحرمان من نوع الخلية بالنظر إلى المنزل لأنسجة معينة بالمقارنة مع التحكم في عدد السكان الخلية. اخترنا لتوضيح خصائص المهاجرة مدار - الأمعاء الأمعاء ، مقابل عدم مدار الخلايا التائية ، وذلك لأن الغشاء المخاطي المعوي هو السطح أكبر هيئة في اتصال مع البيئة الخارجية وأنه هو أيضا من خارج النسيج اللمفاوي أفضل مع متطلبات محددة المهاجرة . وعلاوة على ذلك ، فقد قرر العمل مؤخرا بأن فيتامين (أ) المستقلب جميع العابر حمض الريتينويك (RA) هي الآلية الرئيسية الجزيئية المسؤولة عن التصاق الأمعاء تحريض مستقبلات محددة (إنتغرين مستقبلات chemokine a4b7and CCR9) في الخلايا الليمفاوية. وبالتالي ، فإننا قادرون على توليد بسهولة أعداد كبيرة من فيفو السابقين الأمعاء ، وغير مدار الأمعاء ، عن طريق تنشيط الخلايا الليمفاوية مدار خلايا تي في وجود أو عدم وجود التهاب المفاصل الروماتويدي ، على التوالي ، والتي يمكن استخدامها أخيرا في التجارب صاروخ موجه التنافسية الموصوفة هنا.

Protocol

1. فيفو الجيل السابق من الخلايا T - هومينغ الأمعاء والسيطرة (انظر الشكل 1)

1. عزل splenocytes بواسطة يهرس one الطحال نوع من الفئران البرية. Resuspend تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 "في غرام × 400 إزالة طاف وليز خلايا الدم الحمراء عن طريق إعادة التعليق على بيليه خلية في 4 مل من تحلل ACK العازلة لمدة 2-3 دقائق. بعد ذلك ، أضف 5 مل من برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 "في 400 XG وإزالة طاف.
2. Resuspend splenocytes إجمالي 1 × 10 ⁶ / مل في IMDM + 10 ٪ + 50 ملي FBS 2 - المركابتويثانول + البنسلين / الستربتوميسين (IMDM كاملة). فصل الخلايا في مجموعتين ، واحدة منها وتستكمل مع التهاب المفاصل الروماتويدي (أو الاصطناعية RAR ناهضات ، مثل Am80 أو Am580) إلى التركيز النهائي من 100-200 م ^3. وتنشيط خلايا تي في وجود التهاب المفاصل الروماتويدي أو منبهات RAR - upregulate a4b7and CCR9 وستصبح القناة الهضمية - مدار خلايا T ، في حين أن تنشيط خلايا تي من دون RA سوف تصبح خلايا T السيطرة.
3. إضافة 1،5-2،0 مل من خلية إلى تعليق كل بئر من لوحة 24 مغلفة جيدا في السابق مع CD3 المضادة (10 ملغ / مل) ، ومكافحة CD28 (10 ملغ / مل) ، واحتضان ثاني أكسيد الكربون بنسبة 37 في 5 ٪ درجة مئوية ₂ (لطلاء لوحة إضافة 500 مل / جيد المضادة للCD3 زائد مكافحة CD28 في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 2 ساعة في 37 ˚ C ، ويغسل ثم مرتين مع PBS مل 2).
4. من أجل تجنب فرط تي الخلية ، بعد 2-3 أيام نقل الخلية إلى تعليق لوحة جديدة 24 غير المصقول جيدا. لاحتضان 2-3 أيام إضافية. اعتمادا على كثافة الخلايا وانتشار وسائل الإعلام قد تصبح حمض (الصفراء) ، وفي هذه الحالة قد يكون من الضروري استبدال نصف وسائل الإعلام مع IMDM كاملة جديدة. حصاد الخلايا بعد 4-5 أيام (العد من اليوم 0).
5. غلة النهائي النموذجية هي 1-2 × 10 ⁶ خلايا T المستجيب / أيضا. لذا ، ينبغي على الأقل مطلي الآبار 12/09 من كل خلايا T - مدار الأمعاء والتحكم في الخلايا التائية النظام في نهاية المطاف مع 10-20 × 10 ⁶ في الخلايا التائية الشرط.

2. تحليل الأمعاء ، صاروخ موجه على مستقبلات الخلايا التائية تفعيلها

بعد 4-5 أيام للثقافة ينبغي أن نلاحظ تعبير عالية من الأمعاء ، صاروخ موجه مستقبلات a4b7and CCR9 على تنشيط خلايا تي في وجود منبهات RA أو RAR ، في حين أن سيطرة الخلايا التائية ينبغي أن يعبر عن مستويات منخفضة جدا من هذه المستقبلات ^4.

التدفق الخلوي (FACS) التحليل.

1. جمع ما بين 0،2-0،5 ⁶ خلايا X10 وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 غرام عند 4 درجات مئوية.
2. احتضان المضادة للFITC - CD4 ، ومكافحة a4b7 - PE دينار بحريني (العلوم البيولوجية) ، ومكافحة CCR9 - APC (eBiosciences) والمضادة للCD8 PercP مقابل 15 دقيقة في 4 درجات مئوية في الظلام.
3. بعد الحضانة ، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 ز 4 درجات مئوية. غسل وresuspend الخلايا في تلطيخ العازلة وتحليلها من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية.

3. تي وسم الخلية مع خلية بتتبع CFSE وCMTMR

1. ابقاء جميع الحلول في 37 درجة مئوية قبل البدء. غسل الأمعاء - مدار خلايا T (a4b7 ^{السامية} CCR9 ^{السامية)} ومراقبة الخلايا التائية (a4b7 ^{منخفضة / NEG} CCR9 ^{منخفضة / NEG)} مرتين مع برنامج تلفزيوني لإزالة المصل. ضبط تركيز خلية T إلى 10-15 × 10 ⁶ / مل في برنامج تلفزيوني.
2. إضافة CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl استر) أو CMTMR (كلوروميثيل - بيروكسايد - الأميني tetramethylrhodamine) fluorophores إلى T - مدار الأمعاء والخلايا إما السيطرة T إلى تركيز النهائي من 5 ملم و10 مم ، على التوالي ، واحتضان دوامة برفق لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية. فمن المستحسن لمبادلة labelings في نفسه أو في تجربة منفصلة من أجل استبعاد الآثار المحتملة للfluorophores الجوهرية بشأن الهجرة الخلايا التائية.
3. بعد الحضانة ، مع 1 إخماد حجم FBS واحتضان لمدة 1-5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تمييع 10 مرات مع PBS دافئة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 غرام. تغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني وresuspend في IMDM كاملة.
4. من الناحية المثالية ، ينبغي أن تكون مختلطة 10-20 × 10 ⁶ خلايا T في كل السكان بنسبة 1:1 ثم طرد في 300 x ج لمدة 5 دقائق. أخيرا ، resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني 200-250 مل من الدفء وحقن عن طريق الوريد الذيل.
5. لحساب نسبة المدخلات الدقيقة (مثالي على مقربة من 1) حفظ 5-10 مل من تعليق حقن الخلايا وتمييع مع 300 مل من برنامج تلفزيوني وتحليلها من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية.

4. تحليل الخلايا التائية هومينغ

على الرغم من أن الفئران يمكن تحليلها في نقاط زمنية مختلفة (بين 1 ساعة وعدة أيام بعد حقن الخلايا التائية) ، هو موثق من أفضل صاروخ موجه من الخلايا T - مدار الأمعاء بين 12-24 ساعة بعد الحقن. نقاط قتا أطول زيادة الآثار المحتملة للمتغيرات أخرى تؤثر على الخلايا النهائي الأرقام / النسب ، مثل الخلايا والخلايا التائية T الخروج من الخلية والأنسجة. بعد الفئران وينبغي عزل الموت الرحيم ، والمعلقات خلية من أنسجة عدة دون تأخير من أجل خفض موت الخلايا ، والتي قد تؤثر على العائدات والنتائج النهائية. أنسجة الفائدة الأمعاء الدقيقة والقولون والطحال والغدد الليمفاوية ، والبقع باير والكبد والرئتين والدم. إذا كانيتم حقن الخلايا التائية بحسن نية الوتر - مدار الخلايا التائية ، ينبغي لها أن المنزل على 5-10 مرات في المتوسط ​​أفضل (أو أعلى) في الغشاء المخاطي للأمعاء الدقيقة بالمقارنة مع سيطرة الخلايا التائية. ومع ذلك ، ينبغي أن الأنسجة الأخرى ، مثل الدم والطحال ، لا يحمل خلية T تفضيلية الهجرة. وقد تم عزل الخلايا الليمفاوية من الصفيحة المخصوصة المعوية وحجرة داخل الظهاري الموصوفة سابقا ^5.

1. FACS تلطيخ : أنت معلق عينات اعتمادا على الأرقام التي تم جمعها من الخلايا ، في مناطق ذات كثافة أعلى لا يتجاوز 3.0 × 10 ⁶ خلايا / مل. إذا مسانج CD45.1 ⁺ أو ⁺ Thy1.1 استخدمت الفئران كمتلقين ، ملطخة الخلايا مع علامة على مسانج المقابلة (على سبيل المثال ، أو CD45.2 Thy1.2) جنبا إلى جنب مع بعض علامة النسب (على سبيل المثال ، TCRbchain ، CD4 ، CD8 ، CD45.1 ⁺ / CD45.2 ^+).
2. أثناء التحليل FACS ، الخلايا المغلقة على علامة مسانج (مثل CD45.1) ، ثم على علامات نسب محددة (مثل CD4/CD8) وتحليلها من أجل النسب بين CMTMR والخلايا CFSE إيجابية.
3. وعادة ما يتم التعبير عن البيانات كما في فهرس الزاجل (مرحبا) ، الذي يحسب كما CFSE نسبة / CMTMR (أو CMTMR / CFSE) في كل الأنسجة مقسوما على نسبة المدخلات المقابلة (أنظر أدناه). إذا كانت نسبة المدخلات قريب جدا إلى 1 ، ثم نسب الأنسجة يكون معادلا لمرحبا.

مرحبا = CFSE _{الأنسجة} / CMTMR _{الأنسجة} : CFSE _{الإدخال} / CMTMR _مدخلات

وينبغي أيضا أن يكون الدم تحليلها بغية تحديد ما إذا كان يتم تمثيل السكان على السواء الخلايا التائية في الدورة الدموية أو إذا انخفضت فئة سكانية الخلايا التائية يتعلق الأخرى (على سبيل المثال ، من خلال محاصرة تفضيلية في الرئتين / الكبد أو انخفاض الجدوى). هذا قد يحدث عند مقارنة ساذجة أو يستريح الخلايا التائية الذاكرة مؤخرا مقابل تنشيط خلايا تي المستجيب ، لأن من الممكن محاصرة هذا الأخير إلى حد كبير في الرئتين. إذا كان مرحبا في الدم تختلف اختلافا كبيرا من 1 ، يمكن للمرء أن تطبيع مرحبا في الأنسجة التي مرحبا في الدم. ويمكن الحصول على الدم من خلال ثقب في القلب من تخدير الفئران (مع أو AVERTIN isofluorane قبل القتل الرحيم) وينبغي lysed مرتين مع العازلة ACK قبل استخدامه لتلوين FACS.

مرحبا تطبيع الدم = _{الأنسجة} / مرحبا _الدم

5. ممثل النتائج

وكانت الفئران المستلم (Thy1.1 ⁺⁾ euthanized18h حقن الخلايا آخر. وقد تولدت تعليق خلية من الطحال والغدد الليمفاوية الطرفية (PLN) ، والعقد اللمفاوية المساريقية (MLN) والأمعاء الصغيرة propia الصفيحة (LP). بعد أن تم صبغ الخلايا للThy1.2 وCD8 ومن ثم تحليلها من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية التي تبوب على خلايا قابلة للحياة Thy1.2 CD8 ^{+ +} ، والتي تم تحليلها في النهاية عن النسبة بين الخلايا CMTMR ⁺ (القناة الهضمية - مدار خلايا T) وCFSE ⁺ الخلايا (خلايا تي التحكم) مقسوما على نسبة المدخلات. ويمكن عرض النتائج على النحو المبين في الشكل 2 ، والتي يمكن أن تقدر الأمعاء ، والسيطرة مدار الخلايا التائية المخزن بالتساوي على الطحال (مرحبا قريبة to1 ، أشار مع خط أحمر). على النقيض من ذلك ، الأمعاء ، مدار الخلايا التائية هاجر حوالي 10 مرات أكثر كفاءة ليرة لبنانية مقارنة للسيطرة على الخلايا التائية.

رسم بياني يظهر معزولة الجيل ووضع العلامات على مدار - الأمعاء والقناة الهضمية غير الخلايا التائية مدار الخلايا التائية من نوع الفئران البرية وتفعيلها مع anti-CD3/anti-CD28 في وجود أو عدم وجود 100-200 نانومتر جميع : Figure1. -- العابر حمض الريتينويك (RA). بعد 4-5 أيام RA - تعامل الخلايا التائية الحصول على التعبير من المستقبلات صاروخ موجه والأمعاء CCR9 a4b7. بعد ذلك ، وصفت تفاضليا الأمعاء ، والسيطرة مدار الخلايا التائية مع CFSE أو CMTMR ، وغسلها ، مختلطة في نسبة 1:1 وحقنها ماوس المتلقي عن طريق الوريد الذيل. وتستخدم بعض الخلايا المسمى لتحديد نسبة مساهمة CFSE / CMTMR (يجب أن تكون قريبة إلى 1).

تحليل الفئران مثال لتحليل صاروخ موجه يتم الحصول على الخلايا التائية 12-18 ساعة بعد الحقن وتعليق خلية واحدة من الهيئات ذات الاهتمام : Figure2. هي ملطخة الخلايا المضادة للThy1.2 (علامة مسانج) ، بالإضافة إلى مكافحة CD8 وثم Thy1.2 CD8 ^{+ +} ويتم تحليل الخلايا التائية لنسبة CMTMR ⁺ و ⁺ CFSE الخلايا في كل الأنسجة التي FACS. ثم يتم تطبيع النسيج CMTMR / CFSE نسب من نسبة CMTMR / CFSE الإدخال للحصول على الأرقام القياسية لصاروخ موجه (مرحبا). في هذا المثال CMTMR ^{+ +} وCFSE الخلايا الأمعاء مدار - T والخلايا التحكم المستجيب ، على التوالي.

Discussion

على الرغم من التجارب صاروخ موجه تقديم معلومات قيمة للغاية حول هجرة السكان الكلي في أي خلية نسيج معين ، ينبغي أن يوضع في الاعتبار أن هذه المقايسات لا نحلل مباشرة الالتصاق البطانية وبالتالي فهي لا تميز فيها الخطوة (ق) من الالتصاق متعددة الخطوات شلال (الربط / المتداول ، أو تفعيل العالقة) ومستقبلات معينة صاروخ موجه يتصرف. معيار الذهب لتحديد دور محدد من المستقبلات صاروخ موجه في تتالي التصاق intravital المجهري (IVM) ، والذي لوحظ مباشرة الفردية الخلايا التائية fluorescently المسمى (أو الخلايا الأخرى أو حتى حبات fluorescently المسمى) تتفاعل مع الخلايا البطانية في الوقت الحقيقي. ومع ذلك ، IVM تستغرق وقتا طويلا ، ويتطلب التخدير الماوس ، يعني العمليات الجراحية شاقة وتحتاج العزل من قبل عدد كبير من السكان الخلية نقية ومتجانسة لوضع العلامات والحقن. وعلاوة على ذلك ، وبعض الأنسجة ، مثل الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، والغدة الصعترية ، ويصعب الوصول إليها لIVM. أخيرا ، تتطلب استعدادات IVM تجميد الأنسجة التي يصعب تحقيقه في بعض الأجهزة / الأنسجة ، مثل الرئتين والكبد والأمعاء (للاطلاع على مناقشة مفصلة حول IVM انظر المرجع ^6).

من ناحية أخرى ، والتجارب صاروخ موجه من السهل نسبيا لإعداد ، يمكن القيام به بشكل تنافسي من قبل المشترك عن طريق الحقن two المسمى تفاضليا السكان الخلايا التائية ، وأنها تسمح للفحص الأنسجة متعددة في وقت واحد / الأجهزة والسكان الخلية في تجربة واحدة بواسطة FACS . في التجربة ، صاروخ موجه تنافسية والهدف هو تحديد ما هو قريب لأحد الهجرة تي خلية احترام السكان إلى مجموعة أخرى من السكان (المسمى تفاضلي) الخلايا التائية في الأنسجة المختلفة. منذ يتم التعبير عن النتائج على النحو مرحبا ، وتحاليل لا تتطلب عدد الخلايا المطلقة ولا تتأثر نتائج من قبل عدد من حقن الخلايا التائية ، من قبل عدد من الخلايا التائية معزولة / حللت في كل الأنسجة أو اختلافات في نهاية المطاف في الحيوانات / الأجهزة الحجم.

على الرغم من هذه المزايا وينبغي أن يوضع في الحسبان أن تجارب صاروخ موجه تنافسية لا تقدم معلومات حول الحجم الحقيقي للهجرة الخلايا التائية في كل الأنسجة. في الواقع ، مرحبا يمكن أن يكون مضللا للغاية في الأنسجة فقيرة جدا مع الهجرة الخلايا التائية والتي يمكن من خلالها الكشف عن عدد قليل جدا من الخلايا التائية التي FACS ، كما هو الحال في القولون ملتهبة أو غير الجهاز العصبي المركزي (يمكن الأحداث القليلة الخلايا التائية التي قد تمثل تلوث الدم نتيجة الاختلافات في ضخمة في مرحبا). كقاعدة عامة ، ينبغي أن تستخدم فقط عندما تكون مرحبا الكشف عن أعداد كافية من الأحداث FACS ، بحيث يمكن أن يكون واحد على الأقل من سكان تي الخلية المسمى indentified بوضوح في نسيج معين.

أخيرا ، ينبغي أن التجارب صاروخ موجه على المنافسة وحسابات مرحبا تكمل بشكل مثالي مع الخلية المطلق عد الخلايا التائية (يعبر عنه في العادة على اعتبار أن عدد خلايا تي في نسيج في 1 × 10 ⁶ مجموع حقن الخلايا التائية). ومع ذلك ، وتحديد الأعداد المطلقة للخلايا T في كل الأنسجة هو مضيعة للوقت وموثوقيتها / استنساخ سوف يعتمد على تقنية الحقن الدقيق لضمان أن يتم حقن الخلايا T الأكثر كفاءة في الوريد ، وعلى العزلة الخلايا التائية من كل الأنسجة.

باختصار ، لقد وصفنا تجارب صاروخ موجه التنافسية بين مدار - الأمعاء والخلايا التائية السيطرة. ومع ذلك ، يمكن تطبيق هذه الطريقة على العديد من الخلايا اللمفاوية الأخرى (على سبيل المثال ، T ساذج أو تنشيط الخلايا وباء ، _REG تي ، الخ) ، وكذلك إلى المنظمات غير الخلايا اللمفاوية (على سبيل المثال ، DC الخلايا الجذعية ، الخ). وهكذا ، والتجارب صاروخ موجه توفير أداة بسيطة ومرنة وقوية لدراسة الهجرة خلية في الجسم الحي.

Materials

Animals: C57BL/6mice are commonly used for T cell isolation. In addition, CD45.1 and Thy1.1 congenic strains are available through Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME).

Culture media: IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium + L-Glutamine + Hepes) plus 10% heat-inactivated FBS (Fetal Bovine Serum, low endotoxin, Gibco®, Invitrogen, Carlsbad, CA) supplemented with 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin (HyClone Antibiotics, Waltham, MA), 0.5 mg/ml fungizone/amphotericin B (Gibco), and 50 mM b-mercapt–thanol.

ACK Red Blood Cell Lysis buffer(RBC, 10 mM KHCO3, 150 mM NH4Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0), adjust to pH 7.2-7.4 and store at room temperature).

PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA).

Flow cytometry (FACS) media(PBS or IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). When staining using Selectin-Fc chimeras, media with 2 mM Ca++ should be used in all steps (including FACS acquisition). IMDM is recommended in this case.

T cell labeling and adoptive transfer: CFSE(carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester), CMTMR ((5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino) tetramethylrhodamine) from Molecular Probes®, Invitrogen, Carlsbad, CA). 1000 x stocks should be made in DMSO (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) and stored at -20°C.

Polyclonal T cell activation: 24-well or 96-well plates (tissue-culture treated, polystyrene, flat-bottom with lid, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) are incubated for 2 hours at 37°C with 50 ml PBS, respectively, containing anti-CD3 plus anti-CD28 antibodies (10 mg/mL each). Then, culture plates are washed twice with PBS and used immediately for T cell culture. Alternatively, Dynabeads coated with anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) can be used for T cell activation instead of plate-bound antibodies.

Flow cytometry (FACS) staining: Polyclonal activation: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptors: purified CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7(LPAM-1/DATK3), isotype control (IgG2a, k). Skin-homing receptors: P-selectin-Fc (Purified Mouse P-Selectin - IgG Fusion Protein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectin-Fc (Recombinant Mouse E-Selectin/Fc Chimera, R&D Systems, Minneapolis, MN) plus corresponding secondary reagent goat F(ab’)2 anti-human IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA).

All-trans retinoic acid(Sigma, St. Louis, MO)is resuspended in absolute ethanol or DMSO using a yellow bulb or an indirect source of light during the preparation. Store aliquots in glass vials at -80°C and protected from light at all times. Synthetic RAR-agonists: Am80(Wako Chemicals, Richmond, VA).