המצאה של המכשיר microfluidic עבור מידור של Neuron סומה האקסונים

Summary

בסרטון הזה אנחנו מדגימים את הטכניקה של ליתוגרפיה רך עם polydimethyl siloxane (PDMS) שבו אנו משתמשים כדי farbricate מכשיר microfluidic עבור נוירונים culturing.

Abstract

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את הטכניקה של ליתוגרפיה רך עם polydimethyl siloxane (PDMS) שבו אנו משתמשים כדי להמציא מכשיר microfluidic עבור נוירונים culturing. בעבר, היה פרוסות סיליקון בדוגמת עם העיצוב של המכשיר נוירון microfluidic באמצעות SU-8 ו photolithography ליצור עובש מאסטר, או מה שאנו מכנים בפשטות "אמן". בשלב הבא, אנחנו יוצקים פולימר סיליקון PDMS על גבי האדון אשר הוא נרפא לאחר מכן על ידי חימום PDMS עד 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. PDMS יוצר תבנית שלילית של המכשיר. PDMS הוא אז לחתוך בזהירות והרים מן האדון. חורים הם אגרוף שבו מאגרי יהיה ואת PDMS עודף גזוז מן המכשיר. חנקן משמש לסלק כל פסולת עודף מהמכשיר. בשלב זה שני המכשירים נמצאים כעת מוכן לשימוש וניתן ערובה או זכוכית קורנינג לכסות מס '1 עם מעקר פלזמה / מנקה או יכול להיות מחויב הפיך לזכוכית לכסות פשוט על ידי הנחת המכשיר על גבי זכוכית המכסה. מליטה הפיך של המכשיר כדי זכוכית מכוסה וידאו נפרד דורש הראשונה את המכשיר לעקר או אתנול עם 70% או מעוקר. פלזמה בטיפול sterilizes המכשירים כך שאין טיפול נוסף הוא הכרחי. היא, לעומת זאת, חשוב, כאשר פלזמה בטיפול התקנים, כדי להוסיף נוזל המכשירים בתוך 10 דקות של טיפול פלזמה בעוד משטחים עדיין הידרופילי. מחכים יותר מ 10 דקות להוסיף נוזל למכשיר מקשה על הנוזל להזין את המכשיר. המכשירים נוירון הם בדרך כלל פלזמה חייב לכסות זכוכית 0.5 מ"ג / מ"ל ​​poly-L-ליזין (PLL) במאגר borate 8.5 pH הוא הוסיף מיד למכשיר. לאחר מינימום של 3 שעות דוגרים עם PLL, המכשירים נשטפים במים dH2O מינימום של 3 פעמים עם 15 דקות לפחות בין כל לשטוף. לאחר מכן, המים יוסר התקשורת טריים הוא הוסיף למכשיר. בשלב זה המכשיר מוכן לשימוש. חשוב לזכור בשלב זה לא להוציא את כל המדיה מהמכשיר. תמיד להשאיר את התקשורת בערוץ הראשי.

Protocol

חלק 1: הכנת התקן נוירון microfluidic

1. 3 "פרוסות סיליקון עם דפוס עשוי SU-8 על ידי photolithography משמש להטיל את התבנית (PDMS) polydimethylsiloxane microfluidic. אנו מתייחסים רקיק SU-8 תבניות סיליקון בדוגמת כמו הורים, או" מאסטרים ".
2. PDMS מעורבב עם סוכן ריפוי ביחס aw / w של 10:01, כלומר, עבור 10 גרם של PDMS, 1 גרם של סוכן ריפוי מתווסף אליו.
3. PDMS הוא מעורב אז גם ושפך על גבי פרוסות סיליקון. פרוסות סיליקון הכלול בתוך צלחת פטרי 10 ס"מ קלקר. זה לוקח בערך 12 גרם עד 15 גרם של PDMS לכיסוי הורים עם עובי של כ 4 מ"מ.
4. האדון עם PDMS ממוקם אז dessicator ואקום עם מכסה את צלחת פטרי, ואקום מוחל. זה נעשה כדי לסייע להסיר בועות אוויר מן PDMS שהוצגו במהלך תזוזה של הסוכן ריפוי. זה לוקח בערך 15 דקות את בועות האוויר כדי להסירו.
5. האדון עם PDMS יוסר dessicator. אקדח אוויר עם מסנן 0.45 אממ משמש כדי להסיר בועות הנותרים.
6. אמן ממוקם אז על צלחת 80 מעלות צלזיוס חם במשך שעה 1 כדי לרפא.

הערה: אם dessicator ואקום אינו זמין, האב ניתן להשאיר בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות. בועות אוויר בסופו של דבר להפיג בכוחות עצמם. אם צלחת חמה אינו זמין, PDMS ירפא בטמפרטורת החדר לאחר 24 שעות.

הערה: חשוב גם לוודא כי האדון הוא ברמה במהלך תהליך ריפוי.

חלק 2: לחתוך את המכשיר microfluidic נוירון

1. ברגע PDMS נרפא הבסיס, הוא נלקח אל מכסה המנוע נקי.
2. שימוש בלהב כירורגי, עיגול הוא חתך מסביב המכשירים. כשאדם מכניס את הלהב לתוך PDMS, חשוב ליצור קשר עם פרוסות סיליקון, אבל לא לשים יותר מדי לחץ על פרוסות סיליקון, אחר המאסטר ייסדק.
3. עם עיגול לחתוך את כל הדרך סביב המכשירים (יש 4 מכשירים לכל אחד מאסטר 3 הסיליקון "), PDMS הוא הרים בזהירות את המאסטר. זה יכול להיות נכתבו על ידי מסובב בעדינות את להב כירורגי כפי שהוא מוכנס לתוך לחתוך לפני .
4. בשלב הבא, הם מאגרים אגרוף לתוך המכשיר באמצעות רקמות 8 מ"מ ביופסיה.
5. התקנים הם לרבעים ואז PDMS עודף גזוז משם כך שהמכשיר יתאים בצורה מסודרת על כיסוי הזכוכית קורנינג (מס '1) 24 מ"מ x 40 מ"מ. חנקן באוויר משמש לסלק כל פסולת עודף. פסולת עיקש ניתן גם להסיר באמצעות 3M סקוטש 471 ברנד סרט ויניל.

חלק 3: פלזמה מליטה התקנים תלושי כיסוי זכוכית.

1. מנקה פלזמה משמש האג"ח Harrick המכשירים נוירון את תלושי לכסות. בקצרה, המכשירים מוצבים שואב פלזמה משאבת ואקום משמש לפנות אוויר החדר.
2. אחרי הלחץ ואקום הגיע 300 milliTorr, כוח מופעל על סליל חשמלי מוגדר גבוה.
3. סליל חשמלי יוצר פלזמה "גז מיונן חלקית בהיקף של אלקטרונים, יונים או מולקולות אטומים נייטרלים" - http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php , מתוך מולקולות האוויר הנותר נשאר בחדר. פלזמה יוצר מינים תגובתי על פני השטח של הזכוכית את המכשיר, אשר כאשר מציבים יחד יהוו קשר קבוע. פלזמה גם הופך את משטחי הידרופילי, אשר מסייע להקל על תוספת של נוזלים. בנוסף, מנקה פלזמה sterilizes המכשירים.
   
   פני השטח של המכשיר PDMS המכיל את המכשיר microfluidic ממוקם עם הפנים כלפי מעלה לתוך שואב פלזמה יחד עם שקופיות הזכוכית.
   
   משטחים פלזמה טיפול של הזכוכית המכשיר microfluidic הם התאספו על קשר אחד עם השני על ספסל נקי, הניח אז 60 מנות סטרילי מ"מ. משטחים מטופלים ליצור קשר הדוק בלתי הפיך.
   
4. בתוך 10 דקות של פלזמה מליטה התקנים זכוכית, פולי-L-ליזין (PLL) מתווסף אל המכשיר. לאחר 10 דקות, hydrophilicity של המכשיר יקטין שהקשה על PLL כדי להזין את המכשיר.
   
   הערה: חשוב לבדוק את בועות האוויר במכשיר לאחר תוספת של PLL. בועות האוויר בערוץ העיקריים הם רצויים, כפי שהם היו התאים לחמצן. שיטה קלה להסיר כל בועות האוויר הקיימות היא להשתמש pipet P200 מלא ul 150 של הנוזל (במקרה זה PLL), הצב את קצה ישירות בפתיחת הערוץ הראשי, לדכא בכוח P200. זה עלול צורך לחזור כמה פעמים אבל בסופו של דבר את הכוח מן pipet יניעו את הבועות החוצה.
   
   
5. המכשירים המכיל PLL מותר דגירה לילה בתרבות תקן רקמות החממה ב 37 ° C עם 5% CO _2.
6. למחרת, דההחטאים הם שטפה פעמיים במהירות עם dH2O autoclaved. במהלך תהליך זה, נוזל לא יוסר לחלוטין מן הערוצים העיקריים, רק מתוך המאגרים. הסרת נוזל מן הערוצים העיקריים יציג בועות. אחרי 2 שטיפות מהיר, התקנים הם מלאים dH2O autoclaved והניח בחזרה מינימום של 3 שעות לתוך האינקובטור, או לילה.
7. למחרת, התקנים הם שטפה שוב 2 פעמים מהר עם dH2O autoclaved. ואז, מדיה הבסיס העצבי, המכיל את התוספים הדרושים B27 ו glutamax עבור נוירונים culturing העיקרי עכברוש, הוא הוסיף את המכשירים. המכשירים מוצבים בחזרה לשימוש עתידי בחממה. המכשירים נמצאים כעת לקראת זריעה של נוירונים.

Discussion

בסרטון זה אנו הדגימו כיצד לבצע ולהכין את מכשיר microfluidic PDMS שבו אנו משתמשים כדי נוירונים תרבות פנימה המכשיר מאפשר לנו להשיג שבריר axonal טהור מופרדות microgrooves מן התא המכיל תערובת של גופי התא, דנדריטים, ואת האקסונים . מכשירים אלה מאפשרים לחוקר לחקור את ההשפעות של טיפולים שונים, כמו גם לספק פלטפורמה לבצע פגיעה פיזית על האקסונים ולבחון מה ההשפעות טיפולים אלה על הנוירונים. המכשיר מספק גם רמת כדי נוירונים culturing המסייעת להקל על מחקרים התחבורה. בנוסף, microgrooves, אשר מפרידים בין תא תרבית תאים מתא האקסון, מאפשר בידוד fluidic בין שני תאים כך שניתן לטפל צד אחד של המכשיר ללא ולחולל את הצד השני של המכשיר ישירות עם הטיפול. תכונה זו מאפשרת לחוקר לבחון תופעות כגון התמרה האות התחבורה הנגרמות כתוצאה מהטיפול.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Reagent	Dow Corning		Sylgard 184 with curing agentPlease consult Dow Corning to find a vendor near you
Plasam Cleaner	Tool	Harrick Scientific Products, Inc.		http://www.harrickplasma.com/
Neural Basal Media	Reagent	Invitrogen	21103-049	Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
B27	Reagent	Invitrogen	17504-044	B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax	Reagent	Invitrogen	35050-061	Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.
Cornig No. 1 Cover Glass	cover glass	Corning	Corning No. X2935 244	Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D
60 mm Petri Dish	Tool	Fisher Scientific	08-757-13A	60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass.
BD Falcon 50 ml Tube	Tool	BD Biosciences	Falcon No. 352098	Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A
BD Falcon 15 ml tube	Tool	BD Biosciences	Falcon No. 352097	Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C
Poly-L-Lysine	Reagent	Sigma-Aldrich	P-1274
New Item