Введем целом монтажа иммуногистохимии и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с несколькими маркировки для анализа сложных сосудистых формирование сети в мышиных эмбриональных коже конечностей.
Всего монтажа иммуногистохимического анализа для работы с изображениями всего сосудистая сеть имеет решающее значение для понимания клеточных механизмов ветвления морфогенеза. Мы разработали сосудистой коже конечностей модель для изучения развития сосудов, в которых уже существующих примитивных капиллярного сплетения реорганизован в иерархически разветвленной сосудистой сети. Всего монтажа конфокальной микроскопии с несколькими маркировки позволяет надежной визуализации интактных кровеносных сосудов, а также их клеточных компонентов, включая эндотелиальные клетки, перицитов и гладкомышечных клеток, с использованием специфических флуоресцентных маркеров. Достижения в этой сосудистой коже конечностей модель с генетические исследования лучшему пониманию молекулярных механизмов развития сосудов и кучность стрельбы. Сосудистой коже конечностей модель была использована для изучения того, как периферические нервы обеспечивают пространственную шаблон для дифференциации и структурирования артерий. Это видео статье описан простой и надежный протокол пятно нетронутыми сосуды с сосудистыми специфических антител и флуоресцентного вторичными антителами, которая применима для васкуляризированной органов эмбриональных, где мы имеем возможность следить за процессом развития сосудов.
Сосудистой системы имеет решающее значение для развития органов во время эмбриогенеза, а также для обслуживания органов и репродуктивных функций у взрослых, потому что он поставляет достаточное количество кислорода и питательных веществ к органам. Правильное сосудистой сети хорошо ?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим К. Гилл за помощь в разведении мыши и ухода и для лабораторных управления. Спасибо также Mukoyama лаборатории членов за техническую помощь. Финансирование было предоставлено Внутренние программы исследований Naitonal института здоровья.
Antibodies
Pan-endothelial cell marker
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
PECAM-1 | Armenian hamster (M) | Chemicon | MAB1398Z | 1:100 dilution#1 |
PECAM-1 | Rat (M) | BD | 553369 | 1:300 dilution |
VEGFR2 | Rat (M) | eBioscience | 14-5821-82 | 1:200 dilution |
CD34 | Rat (M) | eBioscience | 13-0341 | 1:300 dilution |
Collagen IV | Rabbit (P) | AbD Serotec | 2150-1470 | 1:300 dilution#2 |
Arterial endothelial cell marker
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
Neuropilin1 | Rabbit (P) | The Alex Kolodkin’s lab#3 | 1:3000 dilution | |
Unc5H2 | Goat (P) | R&D | AF1006 | 1:200 dilution |
Venous endothelial cell marker
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
EphB4 | Goat (P) | R&D | AF446 | 1:100 dilution |
Lymphatic endothelial cell marker
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
LYVE-1#4 | Rabbit (P) | Abcam | ab14917 | 1:200 dilution |
LYVE-1#4 | Rat (M) | MBL | D225-3 | 1:200 dilution |
Prox-1 | Rabbit (P) | Chemicon | AB5475 | 1:1000 dilution |
Prox-1 | Goat (P) | R&D | AF2727 | 1:50 dilution |
Neuropilin2 | Rabbit (P) | Cell Signaling | 3366 | 1;100 dilution |
Podoplanin | Syrian hamster (M) | Hybridoma Bank | 8.1.1 | 1:200 dilution |
Smooth muscle cell/pericyte marker
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
αSMA-Cy3 | Mouse (M)#5 | Sigma | c-6198 | 1:500 dilution#6 |
NG2 | Rabbit (P) | Chemicon | AB5320 | 1:200 dilution |
SM22α | Rabbit (P) | Abcam | ab14106 | 1:200 dilution |
Antibodies forGFP reporter
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
GFP | Rabbit (P) | Invitrogen | A11122 | 1:300 dilution |
GFP | Rat (M) | Nacalai tesque | 04404-84 | 1:1000 dilution |
GFP | Chick (P) | Chemicon | P42212 | 1:300 dilution |
Antibodies for LacZ reporter
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
β-gal | Rabbit (P) | MP Biomedical | 55976 | 1:5000 dilution |
β-gal | Goat (P) | AbD Serotec | 4600-1409 | 1:500 dilution |
β-gal | Chick (P) | Abcam | ab9361 | 1:200 dilution |
Antibodies for peripheral axon
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
2H3 | Mouse (M)#7 | Hybridoma Bank | 2H3 | 1:200 dilution |
Tuj1 | Mouse (M)#8 | Covance | MMS-435P | 1:500 dilution |
Peripherin | Rabbit (P) | Chemicon | AB1530 | 1:1000 dilution |
Antibodies for migrating Schwann cells
BFABP | Rabbit (P) | The Thomas Müller’s lab#9 | 1:3000 dilution |
(P): polyclonal antibody, (M): monoclonal antibody
#1: Goat anti-Armenian hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) antibody should be used as a secondary antibody.
#2: The Collagen IV antibody can be used to detect blood vessels after in situ hybridization.
#3: The Neuropilin1 antibody is kindly provided by the Alex Kolodkin’s lab in the Johns Hopkins University. Sheep anti-human Neuropilin1 antibody is available in R&D (AF3870), although we have not tested it yet.
#4: The LYVE-1 antibodies also detect a subset of macrophages in the embryonic skin.
#5: The anti-αSMA antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody.
#6: The Cy3-conjugated αSMA antibody is incubated for 1 hour at room temperature together with secondary antibodies for other primary antibodies.
#7: 2H3 antibody is mouse IgG1 monoclonal antibody against neurofilament.
#8: Tuj1 antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody against Neuron-specific class III beta-tubulin.
#9: The BFABP (brain-specific fatty acid binding protein) antibody is kindly provided by the Thomas Müller’s lab in Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine.