אנחנו מציגים אימונוהיסטוכימיה כל הר לייזר מיקרוסקופיית confocal עם תיוג מרובים לניתוח רשת סבוכה היווצרות כלי דם בעור איבר עכבר עובריים.
Whole-Mount ניתוח immunohistochemical הדמיה vasculature כולו מרכזי להבנת מנגנוני הסלולר של הסתעפות המורפוגנזה. פיתחנו את העור איבר vasculature מודל ללמוד פיתוח כלי הדם שבו קיימים מקלעת נימי פרימיטיבי הוא ארגן מחדש לתוך רשת מסועפת של כלי הדם הירארכי. Whole-Mount מיקרוסקופיה confocal עם תיוג מרובים מאפשר הדמיה החזקה של כלי הדם ללא פגע, כמו גם מרכיבים תאיים שלהם כולל תאים, pericytes אנדותל ותאי שריר חלק, באמצעות סמנים ניאון ספציפיים. ההתקדמות מודל זה עור vasculature איבר עם מחקרים גנטיים השתפרו הבנה של המנגנונים המולקולריים דפוסים התפתחות כלי הדם. העור האיבר מודל vasculature נעשה שימוש כדי ללמוד איך העצבים ההיקפיים לספק תבנית מרחבית על בידול ועל דפוסים של העורקים. מאמר זה מתאר וידאו פרוטוקול פשוט חזקים כדי כתם הדם שלם עם נוגדנים ספציפיים כלי הדם נוגדנים משני פלורסנט, אשר ישים עבור איברים עובריים vascularized שבו אנו מסוגלים לבצע את תהליך ההתפתחות של כלי הדם.
מערכת כלי הדם חיונית להתפתחות איבר במהלך embryogenesis כמו גם עבור פונקציות תחזוקה איבר הרבייה אצל מבוגרים, כי הוא מספק מספיק חמצן וחומרים מזינים את האיברים. רשת כלי דם תקין היא מבוססת היטב עם תהליכים מורכבים ורב צעד אנגיוגנזה שבו קיימים רשת נימי הוא מחדש עם מבנים מסועפת מא…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים ק גיל לסיוע עם גידול העכבר טיפול לניהול מעבדה. תודה גם לחברי Mukoyama מעבדה לעזרה טכנית. המימון ניתן על ידי תוכנית המחקר עירונית של מכוני Naitonal הבריאות.
Antibodies
Pan-endothelial cell marker
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
PECAM-1 | Armenian hamster (M) | Chemicon | MAB1398Z | 1:100 dilution#1 |
PECAM-1 | Rat (M) | BD | 553369 | 1:300 dilution |
VEGFR2 | Rat (M) | eBioscience | 14-5821-82 | 1:200 dilution |
CD34 | Rat (M) | eBioscience | 13-0341 | 1:300 dilution |
Collagen IV | Rabbit (P) | AbD Serotec | 2150-1470 | 1:300 dilution#2 |
Arterial endothelial cell marker
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
Neuropilin1 | Rabbit (P) | The Alex Kolodkin’s lab#3 | 1:3000 dilution | |
Unc5H2 | Goat (P) | R&D | AF1006 | 1:200 dilution |
Venous endothelial cell marker
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
EphB4 | Goat (P) | R&D | AF446 | 1:100 dilution |
Lymphatic endothelial cell marker
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
LYVE-1#4 | Rabbit (P) | Abcam | ab14917 | 1:200 dilution |
LYVE-1#4 | Rat (M) | MBL | D225-3 | 1:200 dilution |
Prox-1 | Rabbit (P) | Chemicon | AB5475 | 1:1000 dilution |
Prox-1 | Goat (P) | R&D | AF2727 | 1:50 dilution |
Neuropilin2 | Rabbit (P) | Cell Signaling | 3366 | 1;100 dilution |
Podoplanin | Syrian hamster (M) | Hybridoma Bank | 8.1.1 | 1:200 dilution |
Smooth muscle cell/pericyte marker
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
αSMA-Cy3 | Mouse (M)#5 | Sigma | c-6198 | 1:500 dilution#6 |
NG2 | Rabbit (P) | Chemicon | AB5320 | 1:200 dilution |
SM22α | Rabbit (P) | Abcam | ab14106 | 1:200 dilution |
Antibodies forGFP reporter
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
GFP | Rabbit (P) | Invitrogen | A11122 | 1:300 dilution |
GFP | Rat (M) | Nacalai tesque | 04404-84 | 1:1000 dilution |
GFP | Chick (P) | Chemicon | P42212 | 1:300 dilution |
Antibodies for LacZ reporter
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
β-gal | Rabbit (P) | MP Biomedical | 55976 | 1:5000 dilution |
β-gal | Goat (P) | AbD Serotec | 4600-1409 | 1:500 dilution |
β-gal | Chick (P) | Abcam | ab9361 | 1:200 dilution |
Antibodies for peripheral axon
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
2H3 | Mouse (M)#7 | Hybridoma Bank | 2H3 | 1:200 dilution |
Tuj1 | Mouse (M)#8 | Covance | MMS-435P | 1:500 dilution |
Peripherin | Rabbit (P) | Chemicon | AB1530 | 1:1000 dilution |
Antibodies for migrating Schwann cells
BFABP | Rabbit (P) | The Thomas Müller’s lab#9 | 1:3000 dilution |
(P): polyclonal antibody, (M): monoclonal antibody
#1: Goat anti-Armenian hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) antibody should be used as a secondary antibody.
#2: The Collagen IV antibody can be used to detect blood vessels after in situ hybridization.
#3: The Neuropilin1 antibody is kindly provided by the Alex Kolodkin’s lab in the Johns Hopkins University. Sheep anti-human Neuropilin1 antibody is available in R&D (AF3870), although we have not tested it yet.
#4: The LYVE-1 antibodies also detect a subset of macrophages in the embryonic skin.
#5: The anti-αSMA antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody.
#6: The Cy3-conjugated αSMA antibody is incubated for 1 hour at room temperature together with secondary antibodies for other primary antibodies.
#7: 2H3 antibody is mouse IgG1 monoclonal antibody against neurofilament.
#8: Tuj1 antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody against Neuron-specific class III beta-tubulin.
#9: The BFABP (brain-specific fatty acid binding protein) antibody is kindly provided by the Thomas Müller’s lab in Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine.