हम एक पूरी माउंट immunohistochemistry परिचय और लेजर माउस भ्रूणीय अंग त्वचा में जटिल संवहनी नेटवर्क के गठन का विश्लेषण करने के लिए एकाधिक लेबलिंग के साथ confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग.
पूरे माउंट इमेजिंग के लिए immunohistochemical विश्लेषण पूरे vasculature morphogenesis शाखाओं में बंटी के सेलुलर तंत्र को समझने के लिए निर्णायक है. हम अंग त्वचा vasculature को संवहनी विकास है जिसमें एक पूर्व मौजूदा आदिम केशिका जाल एक पदानुक्रम branched संवहनी नेटवर्क में पुनर्गठित अध्ययन मॉडल विकसित किया है. पूरे माउंट एकाधिक लेबलिंग के साथ confocal माइक्रोस्कोपी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बरकरार रक्त वाहिकाओं endothelial कोशिकाओं, pericytes और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं सहित उनके सेलुलर घटकों विशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्करों का उपयोग कर के मजबूत इमेजिंग के लिए अनुमति देता है. आनुवंशिक अध्ययन के साथ इस अंग त्वचा vasculature मॉडल में अग्रिम संवहनी विकास और patterning के आणविक तंत्र को समझने में सुधार हुआ है. अंग त्वचा vasculature मॉडल के लिए अध्ययन कैसे परिधीय नसों और धमनियों का भेदभाव patterning के लिए एक स्थानिक टेम्पलेट प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस वीडियो में लेख एक सरल और मजबूत करने के लिए संवहनी विशिष्ट एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी, जो vascularized भ्रूण अंगों जहाँ हम संवहनी विकास की प्रक्रिया का पालन करने के लिए कर रहे हैं के लिए लागू होता है के साथ बरकरार रक्त वाहिकाओं दाग प्रोटोकॉल का वर्णन करता है.
नाड़ी तंत्र embryogenesis दौरान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंग रखरखाव और वयस्कों में प्रजनन कार्यों के लिए अंग के विकास के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह पर्याप्त ऑक्सीजन और अंगों के लिए पोषक तत्वों की आप…
The authors have nothing to disclose.
हम माउस प्रजनन और देखभाल के साथ सहायता के लिए और प्रयोगशाला प्रबंधन के लिए लालकृष्ण गिल धन्यवाद. Mukoyama तकनीकी मदद के लिए प्रयोगशाला के सदस्यों के लिए भी धन्यवाद. अनुदान स्वास्थ्य Naitonal संस्थानों के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम द्वारा प्रदान की गई थी.
Antibodies
Pan-endothelial cell marker
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
PECAM-1 | Armenian hamster (M) | Chemicon | MAB1398Z | 1:100 dilution#1 |
PECAM-1 | Rat (M) | BD | 553369 | 1:300 dilution |
VEGFR2 | Rat (M) | eBioscience | 14-5821-82 | 1:200 dilution |
CD34 | Rat (M) | eBioscience | 13-0341 | 1:300 dilution |
Collagen IV | Rabbit (P) | AbD Serotec | 2150-1470 | 1:300 dilution#2 |
Arterial endothelial cell marker
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
Neuropilin1 | Rabbit (P) | The Alex Kolodkin’s lab#3 | 1:3000 dilution | |
Unc5H2 | Goat (P) | R&D | AF1006 | 1:200 dilution |
Venous endothelial cell marker
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
EphB4 | Goat (P) | R&D | AF446 | 1:100 dilution |
Lymphatic endothelial cell marker
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
LYVE-1#4 | Rabbit (P) | Abcam | ab14917 | 1:200 dilution |
LYVE-1#4 | Rat (M) | MBL | D225-3 | 1:200 dilution |
Prox-1 | Rabbit (P) | Chemicon | AB5475 | 1:1000 dilution |
Prox-1 | Goat (P) | R&D | AF2727 | 1:50 dilution |
Neuropilin2 | Rabbit (P) | Cell Signaling | 3366 | 1;100 dilution |
Podoplanin | Syrian hamster (M) | Hybridoma Bank | 8.1.1 | 1:200 dilution |
Smooth muscle cell/pericyte marker
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
αSMA-Cy3 | Mouse (M)#5 | Sigma | c-6198 | 1:500 dilution#6 |
NG2 | Rabbit (P) | Chemicon | AB5320 | 1:200 dilution |
SM22α | Rabbit (P) | Abcam | ab14106 | 1:200 dilution |
Antibodies forGFP reporter
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
GFP | Rabbit (P) | Invitrogen | A11122 | 1:300 dilution |
GFP | Rat (M) | Nacalai tesque | 04404-84 | 1:1000 dilution |
GFP | Chick (P) | Chemicon | P42212 | 1:300 dilution |
Antibodies for LacZ reporter
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
β-gal | Rabbit (P) | MP Biomedical | 55976 | 1:5000 dilution |
β-gal | Goat (P) | AbD Serotec | 4600-1409 | 1:500 dilution |
β-gal | Chick (P) | Abcam | ab9361 | 1:200 dilution |
Antibodies for peripheral axon
Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
2H3 | Mouse (M)#7 | Hybridoma Bank | 2H3 | 1:200 dilution |
Tuj1 | Mouse (M)#8 | Covance | MMS-435P | 1:500 dilution |
Peripherin | Rabbit (P) | Chemicon | AB1530 | 1:1000 dilution |
Antibodies for migrating Schwann cells
BFABP | Rabbit (P) | The Thomas Müller’s lab#9 | 1:3000 dilution |
(P): polyclonal antibody, (M): monoclonal antibody
#1: Goat anti-Armenian hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) antibody should be used as a secondary antibody.
#2: The Collagen IV antibody can be used to detect blood vessels after in situ hybridization.
#3: The Neuropilin1 antibody is kindly provided by the Alex Kolodkin’s lab in the Johns Hopkins University. Sheep anti-human Neuropilin1 antibody is available in R&D (AF3870), although we have not tested it yet.
#4: The LYVE-1 antibodies also detect a subset of macrophages in the embryonic skin.
#5: The anti-αSMA antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody.
#6: The Cy3-conjugated αSMA antibody is incubated for 1 hour at room temperature together with secondary antibodies for other primary antibodies.
#7: 2H3 antibody is mouse IgG1 monoclonal antibody against neurofilament.
#8: Tuj1 antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody against Neuron-specific class III beta-tubulin.
#9: The BFABP (brain-specific fatty acid binding protein) antibody is kindly provided by the Thomas Müller’s lab in Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine.