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Biology

पूरे माउंट भ्रूणीय अंग त्वचा vasculature के लिए immunohistochemical विश्लेषण: एक मॉडल प्रणाली के अध्ययन भ्रूण में संवहनी शाखाओं में बंटी morphogenesis

doi: 10.3791/2620 Published: May 20, 2011

Summary

हम एक पूरी माउंट immunohistochemistry परिचय और लेजर माउस भ्रूणीय अंग त्वचा में जटिल संवहनी नेटवर्क के गठन का विश्लेषण करने के लिए एकाधिक लेबलिंग के साथ confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग.

Abstract

पूरे माउंट इमेजिंग के लिए immunohistochemical विश्लेषण पूरे vasculature morphogenesis शाखाओं में बंटी के सेलुलर तंत्र को समझने के लिए निर्णायक है. हम अंग त्वचा vasculature को संवहनी विकास है जिसमें एक पूर्व मौजूदा आदिम केशिका जाल एक पदानुक्रम branched संवहनी नेटवर्क में पुनर्गठित अध्ययन मॉडल विकसित किया है. पूरे माउंट एकाधिक लेबलिंग के साथ confocal माइक्रोस्कोपी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बरकरार रक्त वाहिकाओं endothelial कोशिकाओं, pericytes और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं सहित उनके सेलुलर घटकों विशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्करों का उपयोग कर के मजबूत इमेजिंग के लिए अनुमति देता है. आनुवंशिक अध्ययन के साथ इस अंग त्वचा vasculature मॉडल में अग्रिम संवहनी विकास और patterning के आणविक तंत्र को समझने में सुधार हुआ है. अंग त्वचा vasculature मॉडल के लिए अध्ययन कैसे परिधीय नसों और धमनियों का भेदभाव patterning के लिए एक स्थानिक टेम्पलेट प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस वीडियो में लेख एक सरल और मजबूत करने के लिए संवहनी विशिष्ट एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी, जो vascularized भ्रूण अंगों जहाँ हम संवहनी विकास की प्रक्रिया का पालन करने के लिए कर रहे हैं के लिए लागू होता है के साथ बरकरार रक्त वाहिकाओं दाग प्रोटोकॉल का वर्णन करता है.

Protocol

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1. संग्रह माउस भ्रूणीय अंग त्वचा (E13.5 ~ E17.5)

  1. Euthanize अनुमोदित प्रक्रिया द्वारा महिलाओं खामियों को दूर किया. हमारे अनुमोदित जानवर प्रोटोकॉल के अनुसार, महिलाओं के सीओ 2 के जोखिम से euthanized हैं और फिर गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के द्वारा आश्वासन दिया . इसके शोषक कागज तौलिया पर पशु लेटाओ और यह अच्छी तरह से एक निचोड़ बोतल से 70% EtOH / एच 2 हे में लेना.
  2. गर्भाशय बरकरार काटना और यह एक 100 x 15 मिमी पेट्री ठंडा हैंक्स संतुलित नमक (HBSS) समाधान के लिए बाहर रक्त धोने वाले पकवान में जगह.
  3. अलग और भ्रूण काटना. भ्रूण से बहुत पतली amnion निकालें.
  4. (विकल्प) एक 35 x 10 मिमी पेट्री डिश में एक ही भ्रूण काटना अगर प्रत्येक भ्रूण genotyped की जरूरत है. Dissected पूंछ जीनोटाइपिंग के लिए एक 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब को सौंप दिया है.
  5. भ्रूण के forelimbs कट और हस्तांतरण के 24 में अच्छी तरह से ठंडा फास्फेट बफर खारा (पीबीएस) में नए सिरे से 4% Paraformaldehyde (पीएफए) के 2 मिलीलीटर युक्त थाली में एक अंगूठी संदंश द्वारा forelimbs.
  6. 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात कोमल Nutator मिक्सर पर मिश्रण के साथ ठीक forelimbs.
  7. अगले दिन पर, पीएफए ​​हटाने और पीबीएस के 2 मिलीलीटर में 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोमल Nutator मिक्सर पर मिश्रण के साथ तीन बार धो.
  8. 100% मेथनॉल (MeOH) में forelimbs स्थानांतरण और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस एंजाइम फ्रीजर महत्वपूर्ण तापमान नियंत्रण और स्वत: defrost समारोह के बिना फ्रीजर में स्टोर. प्राथमिक एंटीबॉडी 100% MeOH उपचार के बाद तालिका 1 काम में सूचीबद्ध हैं.
  9. ठीक चिमटी का उपयोग कर forelimb से बंद त्वचा पील. अंग से अंग जब निर्जलित, त्वचा को आसानी से अलग होना चाहिए. पहले उदर (हथेली की ओर) की ओर ऊपर का सामना करना पड़ के साथ अंग जगह है. तो ठीक चिमटी का उपयोग कर, त्वचा में कटौती के रूप में वीडियो में दिखाया गया है. अगले पूरे अंग आसपास काटना, त्वचा छीलने से किसी भी क्षति के बिना धीरे.

2. पूरे माउंट अंग खाल के immunohistochemical धुंधला

  1. / MeOH पीबीटी (पीबीएस + 0.2% ट्राइटन - एक्स 100) के लिए (75%, 50%, 25%) 5 मिनट प्रत्येक के वर्गीकृत श्रृंखला के माध्यम से incubating द्वारा 5ml polypropylene दौर नीचे ट्यूब में अंग खाल rehydrate. नोट है कि समाधान का आदान प्रदान अंग खाल हानिकारक से बचने के सावधान किया जाना चाहिए.
  2. पीबीटी में 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोमल Nutator मिक्सर पर मिश्रण के साथ दो बार धोएं.
  3. या तो 10% / सीरम पीबीएस 0.2% TX100 बकरी माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए अवरुद्ध बफर बकरी या 10% गधा / सीरम पीबीएस 0.2% TX100 गधा माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए अवरुद्ध बफर सौम्य मिश्रण के साथ 2 घंटे के लिए Nutator मिक्सर पर के साथ अंग खाल ब्लॉक कमरे के तापमान.
  4. प्राथमिक एंटीबॉडी के (उपयुक्त कमजोर पड़ने टेबल्स के रूप में सूचीबद्ध) 800μl अवरुद्ध बफर में (के साथ एक 35 x 10 मिमी पेट्री और 2ml-microcentrifuge ट्यूब में एक अंगूठी संदंश द्वारा पकवान हस्तांतरण पर अंग खाल प्लेस या तो 10% बकरी सीरम / पीबीएस 0.2 TX100 या 10% गधा / सीरम पीबीएस TX100 0.2%)%. 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात कोमल Nutator मिक्सर पर मिश्रण के साथ अंग खाल सेते हैं. नोट है कि एक साथ कई प्राथमिक विभिन्न प्रजातियों (जैसे, चूहा मोनोक्लोनल एंटीबॉडी + खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी) से व्युत्पन्न एंटीबॉडी इस्तेमाल किया जा सकता है.
  5. अगले दिन पर 5ml दौर के नीचे ट्यूब polypropylene में धोने बफर (या तो 2% बकरी / सीरम पीबीएस 0.2 TX100% या 2 4ml के साथ एक 35 x 10 मिमी पेट्री और एक अंगूठी संदंश द्वारा पकवान हस्तांतरण पर अंग खाल जगह % गधा / सीरम पीबीएस TX100 0.2%).
  6. कमरे के तापमान पर कोमल Nutator मिक्सर पर मिश्रण के साथ 15 मिनट के लिए पांच बार धोएं.
  7. एक 35 x 10 मिमी पेट्री डिश और 800μl अवरुद्ध बफर में माध्यमिक एंटीबॉडी के (या तो 10% बकरी / सीरम पीबीएस 0.2 TX100% या 10% गधा सीरम / स्थानांतरण 2ml-microcentrifuge ट्यूब में एक अंगूठी संदंश द्वारा अंग खाल पर रखें पीबीएस TX100 0.2%). आमतौर पर हम जैक्सन (Cy3, Cy5, 1:300 dilutions) ImmunoResearch या Invitrogen (Alexa Fluor 488, Alexa 568 Fluor, alexa Fluor 633, 1:250 कमजोर पड़ने) से माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें. माध्यमिक एंटीबॉडी 0.22μm PVDF झिल्ली सिरिंज फिल्टर का उपयोग करने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के एकत्रित कणों को हटाने के समाधान फ़िल्टर. कमरे के तापमान पर कोमल Nutator मिक्सर पर मिश्रण के साथ 1 घंटे के लिए अंधेरे या एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लिपटे में अंग खाल सेते हैं. नोट करें कि विभिन्न फ्लोरोसेंट संयुग्मित माध्यमिक विभिन्न प्रजातियों से प्राप्त एंटीबॉडी के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.
  8. एक 35 x 10 मिमी पेट्री डिश धोने बफर (या तो 2% बकरी / सीरम पीबीएस 0.2% TX100 या 2% गधा सीरम / पीबीएस 4ml के साथ स्थानांतरण 5ml polypropylene दौर नीचे ट्यूब में एक अंगूठी संदंश द्वारा अंग खाल पर रखें 0.2 TX100%). अंधेरे या कमरे के तापमान पर कोमल Nutator मिक्सर पर मिश्रण के साथ एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लिपटे में 15 मिनट के लिए पांच बार धोएं.
  9. (नाभिक के खिलाफ counterstaining लिए ऑप्शन) 4ml (या तो 2% बकरी / सीरम पीबीएस 0.2% TX100 या 2% गधा / सीरम पीबीएस TX100 0.2%) करने के लिए प्रो 3 (T3605 Invitrogen धोने बफर के साथ अंग खाल सेते , काले या Nutator मिक्सर पर सौम्य मिश्रण के साथ 10 मिनट के लिए कमरा temperatu पर एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लिपटे में 1:3000) मन्दनपुनः. फिर 5 मिनट के लिए 4ml धोने बफर के अंधेरे या कोमल पर मिश्रण के साथ एल्यूमीनियम पन्नी से लपेटा में (या तो 2% बकरी / सीरम पीबीएस 0.2 TX100 TX100 या 2% गधा / सीरम पीबीएस 0.2%%) के साथ तीन बार धो कमरे के तापमान पर Nutator मिक्सर. ध्यान दें कि नाभिक के लिए मजबूत और विशिष्ट धुंधला करने के लिए समर्थक-3 के लिए एक विशिष्ट उत्सर्जन (HeNe 633 एनएम उत्तेजना) में मनाया जाता है.

3. स्लाइड पर अंग खाल के बढ़ते

  1. अंग खाल एक 35 x 10 मिमी पेट्री डिश पर रखें. धूल, क्रिस्टल, फाइबर, खाल की भीतरी परत के लिए व्यापक तस्वीर विरंजन से बचने के लिए कम रोशनी के साथ stereomicroscope के तहत ठीक चिमटी का उपयोग कर से निकालें.
  2. चिपकने वाला सूक्ष्म स्लाइड के लिए एक अंगूठी संदंश द्वारा अंग खाल स्थानांतरण. भीतरी परत के साथ स्लाइड (coverslip की ओर यानी) पर ऊपर की ओर झूठ बोल रही है खाल रखें. ध्यान से ठीक चिमटी का उपयोग कर खाल समतल और हटाने Kimwipe द्वारा बफर धोने पर ले.
  3. हवाई बुलबुले के बिना विरोधी फीका बढ़ते मीडिया में माउंट. हम 25 "x25" coverslip का उपयोग करें. अंधेरे में एक फ्लैट सतह पर इलाज (जैसे, नमूने गोल्ड अभिकर्मक लम्बा अंधेरे में रात को देखने से पहले कमरे के तापमान पर रखा का उपयोग घुड़सवार). लंबी अवधि के भंडारण के लिए, 4 में स्लाइड करने के लिए coverslip और दुकान सील डिग्री सेल्सियस

4. Confocal माइक्रोस्कोपी

  1. Fluorophores के लिए उपयुक्त लेज़रों सेट. हम तीन आर्गन 488nm (Alexa 488 Fluor और GFP के लिए), DPSS 561nm (Alexa 568 और Cy3 Fluor के लिए) और HeNe 633nm (Alexa Fluor 633, Cy5 और करने के लिए प्रो-3 के लिए) सहित लेजर स्रोतों के साथ Leica टीसीएस SP5 confocal खुर्दबीन का उपयोग करें .
  2. अनुक्रमिक स्कैन उपकरण का उपयोग कर से बचने के लिए या crosstalk है जिसमें डबल या ट्रिपल दाग नमूनों में सभी रंगों को एक ही समय में उत्तेजित हो जाएगा कम. अनुक्रमिक स्कैन मोड में, छवियों एक अनुक्रमिक क्रम में दर्ज किया जाएगा.
  3. फ्लोरोसेंट रंगों और उत्तेजना के लिए लेज़रों के बारे में अधिक सामान्य जानकारी के जीव के लिए confocal माइक्रोस्कोपी में स्थापित किया जा सकता है हिब्स (2004) द्वारा

5. प्रतिनिधि परिणाम

पूरे माउंट confocal ट्रिपल लेबल अखिल endothelial सेल मार्कर के लिए एंटीबॉडी के साथ E15.5 पर माउस forelimb त्वचा में immnofluorescence माइक्रोस्कोपी PECAM-1 (1 ए, सी, डी नीले चित्रा), neurofilament मार्कर (चित्रा 1 ए) हरे 2H3, और चिकनी पेशी सेल मार्कर αSMA (चित्रा 1 ए, बी लाल) αSMA + धमनियों की एक विशेषता शाखाओं में बंटी पैटर्न, अंग त्वचा में 2H3 + परिधीय नसों के साथ गठबंधन का पता चला . रक्त शाखाओं में बंटी पोत के अलावा, इस अंग त्वचा vasculature मॉडल लसीका पोत के patterning लसीका endothelial सेल मार्कर LYVE 1 (चित्रा 1D, ई लाल) और एफ Neuropilin2 (NRP2) (चित्रा 1D, हरी करने के लिए एंटीबॉडी का उपयोग शाखाओं में बंटी का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है ).

चित्रा 1
चित्रा 1 (एसी) धमनियां भ्रूण अंग त्वचा में परिधीय नसों के साथ संरेखित करें. पूरे माउंट ट्रिपल लेबल अखिल endothelial सेल PECAM-1 (एसी, नीले), neurofilament मार्कर (ए, हरा) 2H3, और चिकनी पेशी सेल मार्कर αSMA (ए और बी लाल, मार्कर के लिए एंटीबॉडी के साथ confocal immnofluorescence माइक्रोस्कोपी ) दिखाया गया है. E15.5, 2H3 कम + परिधीय नसों (खुला तीर) (arrowheads) धमनियों + जो αSMA द्वारा कवर कर रहे हैं चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के साथ सहयोगी. (लोमो) भ्रूण अंग त्वचा में लिम्फेटिक vasculature. ट्रिपल लेबल अखिल endothelial सेल मार्कर के लिए एंटीबॉडी (डी, नीले) PECAM-1, लसीका endothelial सेल मार्कर LYVE 1 (डी और ई, लाल) और Neuropilin2 (NRP2) हरे (डी और एफ के साथ confocal immnofluorescence माइक्रोस्कोपी ) दिखाया गया है. लसीका वाहिकाओं दोनों LYVE-1 और NRP2 द्वारा कल्पना कर रहे हैं, जबकि LYVE-1 मैक्रोफेज (खुला arrowheads) के एक सबसेट के द्वारा व्यक्त की है. स्केल पट्टी: 100μm.

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Discussion

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नाड़ी तंत्र embryogenesis दौरान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंग रखरखाव और वयस्कों में प्रजनन कार्यों के लिए अंग के विकास के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह पर्याप्त ऑक्सीजन और अंगों के लिए पोषक तत्वों की आपूर्ति. उचित संवहनी नेटवर्क में जो पहले से मौजूद केशिका नेटवर्क अत्यधिक branched और पदानुक्रमित संरचनाओं के साथ पुनर्गठित है angiogenesis द्वारा जटिल और बहु ​​कदम प्रक्रियाओं के साथ अच्छी तरह से स्थापित है. हालांकि कई काम करता है दिखाया गया है कि अणुओं की एक किस्म के इन प्रक्रियाओं में शामिल है, यह स्पष्ट नहीं किया गया कैसे अंगों या उनके घटक के संवहनी विकास के stepwise प्रक्रिया सहित endothelial और संवहनी शाखाओं में बंटी के भेदभाव patterning को बढ़ावा देने के लिए संकेतों प्रदान करते हैं. इस सवाल का पता करने के लिए, उपयुक्त vascularized अंगों जहाँ हम संवहनी विकास की प्रक्रिया का पालन करने के लिए कर रहे हैं आवश्यक हैं. लाभ के समारोह और नुकसान के समारोह आनुवंशिक जोड़तोड़ के साथ अंग त्वचा vasculature मॉडल संवहनी विकास के उच्च संकल्प विश्लेषण सक्षम बनाता है.

हम यहाँ भ्रूण माउस forelimbs के विच्छेदन, पूरे माउंट immunohistochemical धुंधला हो जाना और confocal माइक्रोस्कोपी है कि नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता है अंग त्वचा angiogenesis और lymphangiogenesis विश्लेषण सहित एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन. प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह के रूप में जल्दी देर से भ्रूण अंग त्वचा को आसानी से confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged है के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और बरकरार vasculature परिणाम प्रदान करता है. यह भी वयस्क कान त्वचा vasculature (YM और लालकृष्ण पर्किन्स, अप्रकाशित) के लिए लागू है. आगे रक्त वाहिका विकास और remodeling की गतिशीलता के इमेजिंग का पता लगाने, तथापि, fluorescently लेबल रक्त वाहिकाओं के साथ zebrafish की तरह अन्य पशु मॉडल उच्च संकल्प के साथ vivo में समय चूक की vasculature की इमेजिंग के लिए उपयोगी है.

पूरे माउंट संवहनी मार्करों द्वारा एकाधिक लेबलिंग के साथ confocal माइक्रोस्कोपी हमें छवि रक्त और लसीका endothelial कोशिकाओं की अनुमति दी है, और चिकनी मांसपेशियों की खाल में कोशिकाओं और pericytes सहित अपने पड़ोसियों. संवहनी मार्कर एंटीबॉडी (तालिका 2) के अलावा, रिपोर्टर जीन (β galactosidase, β लड़की और हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन, GFP, तालिका 2) उत्पादों है कि अपने हित के अंतर्जात जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न पुनरावृत्ति के लिए एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, हम ephrinB2 (वैंग एट अल, 1998) या EphB4 बिन्दुपथ (Gerety एट अल., 1999), जो ephrinB2 या EphB4 के histochemical संकेतक प्रदान करता है लक्षित lacZ संवाददाता ले भ्रूण से forelimb त्वचा का इस्तेमाल किया. EphrinB2, एक transmembrane ligand, धमनियों लेकिन उसके रिसेप्टर, जबकि नहीं नसों के द्वारा व्यक्त की है, tyrosine kinase EphB4 preferentially नसों (वैंग एट अल, 1998) द्वारा व्यक्त की है . साबुत माउंट E15.5 lacZ + / ephrinB2 या EphB4 lacZ / + विषमयुग्मजी भ्रूण के forelimb खाल में immunohistochemical विश्लेषण से पता चला है कि परिधीय संवेदी तंत्रिकाओं धमनी वाहिकाओं के साथ जुड़े preferentially (Mukouyama एट अल 2002 .). इन चूहों जैक्सन प्रयोगशाला (: स्टॉक # 006039, Ephb4 tm1And / जम्मू: स्टॉक 006044 # Efnb2 tm1And जम्मू /) में उपलब्ध हैं.

इन संवहनी सिस्टम के विभिन्न चरणों के अध्ययन संवहनी शाखाओं में बंटी, धमनी / शिरापरक भेदभाव, लसीका वाहिका विकास और विकासशील अंग त्वचा में चिकनी मांसपेशियों pericyte / कवरेज सहित angiogenesis के सेलुलर गतिशीलता का पता चलता है. E13.5 करके, आदिम केशिका जाल अंग त्वचा में स्थापित किया गया था लेकिन संवेदी नसों और रक्त वाहिकाओं के बीच कोई संबंध नहीं मनाया गया. E14.5, संवहनी remodeling के हुई और remodeled branched वाहिकाओं है, जो धमनी endothelial सेल मार्करों व्यक्त और (2002 Mukouyama एट अल.) ΑSMA + चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के साथ जुड़े तंत्रिका . आनुवंशिक अध्ययन का सुझाव है कि परिधीय संवेदी तंत्रिकाओं रक्त वाहिका शाखाओं में बंटी पैटर्न और धमनी भेदभाव का निर्धारण करने के लिए टेम्पलेट (Mukouyama एट अल 2002) प्रदान करते हैं . तंत्रिका VEGF-A सशर्त म्यूटेंट के विश्लेषण से पता चला है कि तंत्रिका व्युत्पन्न VEGF के एक अंग त्वचा vasculature में धमनी भेदभाव के लिए आवश्यक है (Mukouyama एट अल 2005.) . हमारे परिणाम यह भी पता चला है कि तंत्रिका VEGF-A सशर्त म्यूटेंट तंत्रिका - पोत संरेखण के कम हानि प्रदर्शन, अतिरिक्त angiogenic कारक (ओं) की भागीदारी का संकेत है. यह पता चलता है कि अंग त्वचा vasculature मॉडल हमें विभिन्न तंत्र है कि धमनियों और संवहनी शाखाओं में बंटी के भेदभाव patterning नियंत्रण का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, क्या शिरापरक और शिरापरक और लसीका शाखाओं में बंटी पोत का भेदभाव patterning नियंत्रण के जवाब अभी भी बनी हुई है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम माउस प्रजनन और देखभाल के साथ सहायता के लिए और प्रयोगशाला प्रबंधन के लिए लालकृष्ण गिल धन्यवाद. Mukoyama तकनीकी मदद के लिए प्रयोगशाला के सदस्यों के लिए भी धन्यवाद. अनुदान स्वास्थ्य Naitonal संस्थानों के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम द्वारा प्रदान की गई थी.

Materials

Antibodies

Pan-endothelial cell marker

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
PECAM-1 Armenian hamster (M) Chemicon MAB1398Z 1:100 dilution#1
PECAM-1 Rat (M) BD 553369 1:300 dilution
VEGFR2 Rat (M) eBioscience 14-5821-82 1:200 dilution
CD34 Rat (M) eBioscience 13-0341 1:300 dilution
Collagen IV Rabbit (P) AbD Serotec 2150-1470 1:300 dilution#2

Arterial endothelial cell marker

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
Neuropilin1 Rabbit (P) The Alex Kolodkin’s lab#3 1:3000 dilution
Unc5H2 Goat (P) R&D AF1006 1:200 dilution

Venous endothelial cell marker

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
EphB4 Goat (P) R&D AF446 1:100 dilution

Lymphatic endothelial cell marker

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
LYVE-1#4 Rabbit (P) Abcam ab14917 1:200 dilution
LYVE-1#4 Rat (M) MBL D225-3 1:200 dilution
Prox-1 Rabbit (P) Chemicon AB5475 1:1000 dilution
Prox-1 Goat (P) R&D AF2727 1:50 dilution
Neuropilin2 Rabbit (P) Cell Signaling 3366 1;100 dilution
Podoplanin Syrian hamster (M) Hybridoma Bank 8.1.1 1:200 dilution

Smooth muscle cell/pericyte marker

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
αSMA-Cy3 Mouse (M)#5 Sigma c-6198 1:500 dilution#6
NG2 Rabbit (P) Chemicon AB5320 1:200 dilution
SM22α Rabbit (P) Abcam ab14106 1:200 dilution

Antibodies forGFP reporter

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
GFP Rabbit (P) Invitrogen A11122 1:300 dilution
GFP Rat (M) Nacalai tesque 04404-84 1:1000 dilution
GFP Chick (P) Chemicon P42212 1:300 dilution

Antibodies for LacZ reporter

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
β-gal Rabbit (P) MP Biomedical 55976 1:5000 dilution
β-gal Goat (P) AbD Serotec 4600-1409 1:500 dilution
β-gal Chick (P) Abcam ab9361 1:200 dilution

Antibodies for peripheral axon

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
2H3 Mouse (M)#7 Hybridoma Bank 2H3 1:200 dilution
Tuj1 Mouse (M)#8 Covance MMS-435P 1:500 dilution
Peripherin Rabbit (P) Chemicon AB1530 1:1000 dilution

Antibodies for migrating Schwann cells

BFABP Rabbit (P) The Thomas Müller’s lab#9 1:3000 dilution

(P): polyclonal antibody, (M): monoclonal antibody

#1: Goat anti-Armenian hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) antibody should be used as a secondary antibody.

#2: The Collagen IV antibody can be used to detect blood vessels after in situ hybridization.

#3: The Neuropilin1 antibody is kindly provided by the Alex Kolodkin’s lab in the Johns Hopkins University. Sheep anti-human Neuropilin1 antibody is available in R&D (AF3870), although we have not tested it yet.

#4: The LYVE-1 antibodies also detect a subset of macrophages in the embryonic skin.

#5: The anti-αSMA antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody.

#6: The Cy3-conjugated αSMA antibody is incubated for 1 hour at room temperature together with secondary antibodies for other primary antibodies.

#7: 2H3 antibody is mouse IgG1 monoclonal antibody against neurofilament.

#8: Tuj1 antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody against Neuron-specific class III beta-tubulin.

#9: The BFABP (brain-specific fatty acid binding protein) antibody is kindly provided by the Thomas Müller’s lab in Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine.

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References

  1. Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
  2. Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
  3. Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4. Cell. 93, 741-753 (1998).
  4. Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development. Mol Cell. 4, 403-414 (1999).
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Li, W., Mukouyama, Y. Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo. J. Vis. Exp. (51), e2620, doi:10.3791/2620 (2011).More

Li, W., Mukouyama, Y. Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo. J. Vis. Exp. (51), e2620, doi:10.3791/2620 (2011).

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