2-photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग संक्रमित फेफड़े में neutrophils द्वारा phagocytosis और NET गठन के प्रत्यक्ष अवलोकन

Summary

हम दिखाने के लिए, कैसे संक्रमित फेफड़ों में न्युट्रोफिल granulocytes की गतिशीलता के अवलोकन के लिए 2-photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए, जबकि वे रोगज़नक़ों phagocytose या न्युट्रोफिल कोशिकी जाल (नेट) का उत्पादन.

Abstract

जठरांत्र संबंधी मार्ग के बाद, फेफड़ों हड्डीवाला शरीर और पर्यावरण के बीच बातचीत के लिए दूसरा सबसे बड़ा सतह है. यहाँ, एक प्रभावी गैस विनिमय बनाए रखा जाना चाहिए, जबकि एक ही समय में एकाधिक रोगज़नक़ों कि सामान्य श्वास के दौरान साँस रहे हैं द्वारा संक्रमण से बचने. इस लक्ष्य को हासिल करने, रक्षा humoral और सेलुलर प्रतिरक्षा तंत्र के संयोजन रणनीतियों का एक शानदार सेट मौजूद है. फेफड़ों के तीव्र रक्षा के लिए सबसे प्रभावी उपायों के neutrophils, जो या तो साँस रोगज़नक़ों phagocytose या उन्हें साइटोटोक्सिक रसायनों को रिहा द्वारा मार की भर्ती है. Neutrophils के शस्त्रागार के लिए हाल ही में एक इसके अतिरिक्त उनके कोशिकी डीएनए जाल जिसके द्वारा बैक्टीरिया या कवक या पकड़ा जा सकता है और निष्क्रिय के बाद भी. NET रिहा कोशिकाओं मर चुके हैं के विस्फोटक रिलीज है. हम यहाँ एक तरीका है कि एक सीधे neutrophils निरीक्षण करने के लिए अनुमति देता है वर्तमान में, एक हाल ही में संक्रमित फेफड़ों के भीतर पलायन, कवक रोगज़नक़ों phagocytosing के रूप में अच्छी तरह के रूप में व्यापक जाल है कि वे संक्रमित ऊतकों भर में उत्पादित है कल्पना. विधि मोल्ड Aspergillus fumigatus और उनकी परीक्षा के conidia के साथ चूहों के intratracheal संक्रमण के बाद 7 घंटे बहुरंगा समय चूक 2-photon माइक्रोस्कोपी द्वारा मोटी व्यवहार्य फेफड़ों के स्लाइस की तैयारी का वर्णन. इस दृष्टिकोण एक देशी फेफड़े के ऊतकों में सीधे रोधी रक्षा की जांच के लिए अनुमति देता है और इस प्रकार फेफड़े उन्मुक्ति की विस्तृत जांच के लिए एक नए अवसर खुल.

Protocol

1. संक्रमण

1. मोल्ड Aspergillus fumigatus (तनाव 46,645 ATCC) की सूजन conidia RPMI 1640 (Biochrom एजी, बर्लिन, जर्मनी) में पूर्व ऊष्मायन के साथ पूरक द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं 5% FCS (v / v). 2x10 conidia आराम ⁷ 5 मिलीलीटर माध्यम resuspended हैं और 6 अच्छी तरह से एक ऊतक संस्कृति (TPP एजी, Trasadingen, स्विट्जरलैंड, # कैटलॉग 92006) थाली में incubated 7 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस
2. प्रत्येक Aspergillus 6-अच्छी तरह से अच्छी तरह से युक्त, सूजन अवधि के बाद, spores fluorescently calcofluor सफेद शेयर समाधान ([25 मिलीग्राम / एमएल] DMSO में सिग्मा Aldrich, Deisenhofen, जर्मनी, # सूची F3543) के 10 μl जोड़कर चिह्नित कर रहे हैं थाली, 50 μg / मिलीलीटर RPMI के अंतिम calcofluor एकाग्रता तक पहुँचने. सौम्य मिश्रण के बाद, spores एक अतिरिक्त 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated हैं
3. अगले चरण में, spores निस्पंदन द्वारा एक 70 सुक्ष्ममापी सेल झरनी (बी.डी. बायोसाइंसेज, Heidelberg, जर्मनी) के माध्यम से काटा जाता है. 10 मिलीलीटर पीबीएस (अपकेंद्रित्र 900xg पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए) के साथ एक बार धोने के बाद गोली 2 मिलीलीटर पीबीएस और सूजन NEUBAUER चैम्बर के साथ की गणना के द्वारा निर्धारित conidia की कुल संख्या में resuspended है. अंत में बीजाणु निलंबन 900xg पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए नीचे घूमती है, ध्यान से सतह पर तैरनेवाला, हटा दिया जाता है और गोली 100 μl पीबीएस प्रति 1x107 spores के अंतिम एकाग्रता के लिए resuspended.
4. संक्रमण के लिए, बीजाणु समाधान के 100 μl intratracheally मादा चूहों (C57/BL6, 8-10 पुराने सप्ताह, Harlan, जर्मनी) में लागू किया जाता है. यदि neutrophils के रूप में अच्छी तरह से मनाया जा रहे हैं, Lys - EGFP चूहों ^का उपयोग lysozyme 1 promotor तहत EGFP ले जाने की सिफारिश की है. 150 μl समाधान Ketamin / Rompun (Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, जर्मनी (Ketamin) और बायर महत्वपूर्ण GmbH, लेवरकुसेन, जर्मनी (Rompun), 1 मिलीलीटर [50 मिलीग्राम / एमएल] Ketamin की एक एकल आईपी इंजेक्शन के साथ जानवर anesthetizing के द्वारा शुरू + 0.5 मिलीलीटर Rompun [2%] + 3.5 मिलीलीटर बाँझ NaCl [0.9%]). 5 मिनट बाद anesthetized माउस (यानी एक सतह sloped) रैंप इंटुबैषेण (1 आंकड़ा पूरक) की सुविधा के लिए अपने दाँत द्वारा एक लोचदार बैंड के साथ तय किया जा सकता है. संदंश का प्रयोग, जीभ एक तरफ और एक 22G निबाह शिरापरक (बी Braun एजी, Melsungen, जर्मनी, Vasofix Braunüle) कैथेटर धीरे एक हंस गर्दन दीपक के साथ स्थायी रोशनी के तहत किया जा सकता है ट्रेकिआ में सम्मिलित करने के लिए खींच लिया है. कैथेटर की सफल प्रविष्टि यांत्रिक वेंटीलेटर की आवृत्ति के साथ जानवर की छाती के नियमित रूप से आंदोलन को देख द्वारा सत्यापित है. जब सफल इंटुबैषेण की पुष्टि की गई है, 100 μl बीजाणु निलंबन एक 100 μl micropipette का उपयोग करने के लिए लागू किया जाता है. इस मात्रा 1-2 एस में किसी भी अतिरिक्त मदद के बिना जानवर द्वारा साँस होना चाहिए फेफड़ों के अंदर कवक कणों के एक बढ़ाया वितरण यंत्रवत् 2 मिनट के लिए प्रति मिनट 250 साँस की दर और 300 के एक साँस लेना मात्रा में एक छोटे जानवर श्वासयंत्र (MiniVent, ह्यूगो सैक्स, मार्च Hugstetten, जर्मनी) से संक्रमित पशु ventilating द्वारा हासिल की है सांस प्रति μl (पूरक 2 आंकड़ा). संक्रमण के बाद जानवरों को अपने पिंजरे में लौट रहे हैं और हर 5 मिनट चल जब तक फिर से मनाया. चूहे निम्न ऊष्मायन अवधि के दौरान दर्द या संकट का कोई सबूत नहीं दिखाते.

2. फेफड़े की तैयारी

1. घंटे 7 spores के साथ संक्रमण के बाद, जानवर की एक ज्यादा द्वारा euthanized है isoflurane (बैक्सटर GmbH, Unterschleiβheim, जर्मनी) जब तक आंदोलनों और साँस लेने में अधिक से अधिक 30 सेकंड के लिए बंद है. यह तो एक माध्यमिक विधि के रूप में नैदानिक ​​मौत आश्वासन और दृश्य और ट्रेकिआ और फेफड़ों के उपयोग के लिए अनुमति देते हैं thoracotomy द्वारा पीछा किया जाता है. फिर सीने ध्यान से फेफड़ों और ऊपरी श्वास नलिका का पर्दाफाश करने के लिए खोला जाता है. फिर एक और 22G निबाह शिरापरक कैथेटर उजागर epiglottis से शुरू ट्रेकिआ में डाला है. इस छोटी नली के माध्यम से फेफड़ों 1 मिलीलीटर पूर्व गर्म कम पिघलने (2% w / v, Promega, मैनहेम, जर्मनी) agarose का उपयोग एक 1 मिलीलीटर Omnifix सिरिंज (बी Braun) के साथ भर रहे हैं. जैसे ही फेफड़ों का भर रहे हैं ट्रेकिआ से धागा सिलाई के एक छोटे टुकड़े के साथ बंधा हुआ है और पूरे जानवर एक रेफ्रिजरेटर में 4 में डाल दिया है डिग्री सेल्सियस
2. 15 मिनट बाद जब agarose जम गया है, ट्रेकिआ से पूरे फेफड़ों शुरुआत excised है. तेज बताया कैंची की एक जोड़ी का उपयोग, सही फेफड़ों पालि के बाद हटा दिया जाता है, नीचे की सतह संक्षेप में टिशू पेपर के एक पत्रक पर सूख जाता है और फिर पूरे पालि एक vibratome (Campden उपकरण, ब्रिटेन, 752M Vibroslice की तैयारी ब्लॉक करने के लिए सरेस से जोड़ा हुआ है ) (कार्ल रोथ GmbH, कार्लज़ूए, जर्मनी, रोटी - Coll 1) निर्धारण के लिए ऊतक चिपकने की एक बूंद का उपयोग. 1 मिनट के बाद ब्लॉक vibratome है, जो पूर्व ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) PBS के साथ भरा है के काटने के कक्ष में स्थापित किया गया है. vibratome एक मध्य दूरी (10 अधिकतम के बाहर 5) कंपन और भी मध्यम गति (5 बाहर 10 अधिकतम.) ऐसी है कि एक क्षैतिज पार अनुभाग के लिए सेट कर दिया जाता हैफेफड़ों का उत्पादन है. अंग के ऊपरी आधे तो एक छोटे से प्लास्टिक पेट्री (5 सेमी व्यास) पकवान जहां यह उलटा है और एक स्वयं बनाया फ्लैट वॉशर है कि समानांतर नायलॉन के धागे का एक सेट द्वारा कवर किया जाता है (1 सेमी भीतरी व्यास) के साथ तय में स्थानांतरित कर रहा है, प्रत्येक एक अलग मिमी (पूरक 3 आंकड़ा). अंत में पेट्री डिश 10 मिलीलीटर पीबीएस डीएनए डाई Sytox [5 मिमी] (Invitrogen, जर्मनी) 5 सुक्ष्ममापी के अंतिम डाई एकाग्रता में जिसके परिणामस्वरूप ऑरेंज के 10 μl के साथ पूरक के साथ भरा है.

3. 2-photon लेजर माइक्रोस्कोपी

1. फेफड़ों नमूना युक्त पेट्री डिश तब खुर्दबीन उद्देश्य के तहत स्थापित किया गया है ताकि बफर ° एक तापमान संवेदक नियंत्रित हीटर (पूरक आंकड़ा 4) सी 37 के लिए गर्म किया जा सकता है. 2-photon माइक्रोस्कोपी तो पूरे कटौती एक ईमानदार Axio परीक्षक 20xNA1.0 पानी की सूई लेंस (Zeiss, जेना, जर्मनी) के साथ सुसज्जित मंच पर एक Zeiss LSM 710 NLO माइक्रोस्कोप का उपयोग कर सतह पर किया जाता है. इमेजिंग के लिए, अनुभाग के साथ विभिन्न क्षेत्रों नीचे 400 सुक्ष्ममापी गहराई स्कैन कर रहे हैं 800 एनएम के एक रोशनी तरंग दैर्ध्य ग्रीन (530 एनएम) और (580 एनएम) लाल प्रतिदीप्ति, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दूसरा हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) संकेत और पता लगाने का उपयोग बाहरी गैर descanned डिटेक्टरों (NDD) के साथ नीले calcofluor प्रतिदीप्ति (400-470 एनएम उत्सर्जन पर). 2 डी छवियों और समय व्यतीत हो फिल्में (1 छवि हर 5-10 सेकंड) के अलावा, एकल या दोहराए 3 आयामी चित्र ढेर बाद voxel renderings या एकल विस्तारित ध्यान केंद्रित छवियों या 4-D (समय के साथ 3 डी) डेटा का उपयोग कर के रूप में गाया जा सकता है विभिन्न सॉफ्टवेयर संकुल. इस सूक्ष्म सेटअप एक लगभग बरकरार पर्यावरण कि, के रूप में यह हवाई रोगजनकों के एक किस्म के लिए प्रवेश बंदरगाह का गठन किया है, भारी प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रासंगिकता के सेलुलर व्यवहार के अवलोकन की अनुमति देता है. सेल गतिशीलता, phagocytosis और अंतर्जात मोल्ड Aspergillus fumigatus के साथ संक्रमण के बाद neutrophils द्वारा NET उत्पादन आसानी से सीटू परिस्थितियों में इन के तहत जांच किया जा सकता है.

4. प्रतिनिधि परिणाम

यदि किया ठीक इमेजिंग 2 उत्पन्न होगा - या 3 रंग स्लाइड या फिल्में. हालांकि रंग एक पोस्ट प्रोसेसिंग की प्रक्रिया में किया है और इस तरह आज़ादी अनुकूलनीय है, हम आम तौर पर एक रंग योजना का चयन करें कि डाई / संकेत है, जो रिश्तेदार चैनल में पता चला है की प्राकृतिक रंग को दर्शाता है. इस प्रकार, Sytox रंगों लाल, कवक के रूप में अच्छी तरह के रूप में एसएचजी संकेत नीले रंग में दिखाया गया है में चित्रित कर रहे हैं और वर्तमान अगर, EGFP-लेबल कोशिकाओं हरे रंग में दाग कर रहे हैं. पहले उदाहरण में (छवि 1) नीले एसएचजी संकेत एक गैर संक्रमित फेफड़ों ऊतक फाइबर और लाल Sytox संकेत फेफड़ों निवासी कोशिकाओं के नाभिक के द्वारा उत्पादित है vibratome द्वारा खुला कटौती दर्शाया गया है. दूसरे उदाहरण में (छवि 2) एक संक्रमित फेफड़ों से पता चला है, जहां दोनों वायुकोशीय के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संरचनाओं कवक जनता, नीले रंग में दिखाई देते हैं, जबकि नाभिक और नेट लाल दाग रहे हैं. तीसरा उदाहरण (3 छवि) एक Lys EGFP ट्रांसजेनिक जानवर जहां नीले और लाल संरचनाओं के अलावा हरी neutrophils भी देखा जा सकता से है. neutrophils के प्रवास और समय व्यतीत हो दृश्यों में अलग - अलग कवक तत्वों के अपने phagocytosis पूरक फिल्म में दिखाया गया है.

चित्रा 1. 2 रंग में एक गैर संक्रमित फेफड़ों टुकड़ा की उपस्थिति 2-photon माइक्रोस्कोपी. एक फेफड़ों टुकड़ा एक गैर संक्रमित C57/BL6 माउस से तैयार किया गया था और imaged के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित है. यहाँ प्रस्तुत कर रहे हैं वायुकोशीय ऊतक संरचना (ए) के एसएचजी संकेत, सेल नाभिक Sytox संकेत फेफड़ों टुकड़ा (बी), और दो चैनलों (सी) के एक उपरिशायी की तैयारी के दौरान खुले में कटौती. (सी) में बॉक्स्ड क्षेत्र में देखा जाता है (डी) में बढ़ा है. फेफड़ों के नीचे रेशेदार टुकड़ा के रूप में स्पष्ट रूप से ऊपर फेफड़ों की सांस लेने की सक्रिय क्षेत्रों के भीतर वायुकोशीय संगठन की तुलना में ऊतकों कृपया ध्यान दें.

चित्रा 2. C57/BL6 घंटे संक्रमित 7 माउस से एक फेफड़ों टुकड़ा ए के साथ पहले एक Aspergillus संक्रमित प्रकार जंगली जानवर के एक 2 - रंग में फेफड़ों टुकड़ा 2-photon माइक्रोस्कोपी की उपस्थिति. fumigatus तैयार किया गया था और imaged के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित. दिखाया संयुक्त कवक संरचना और वायुकोशीय ऊतक के एसएचजी (ए), डीएनए जाल के Sytox संकेत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेल नाभिक फेफड़ों का टुकड़ा (बी) की तैयारी के दौरान खुले में कटौती, और दो चैनलों (सी) के एक उपरिशायी है . (सी) में बॉक्स्ड क्षेत्र में देखा जाता है (डी) में बढ़ा है. कृपया ध्यान दें, कवक जनता, अलवियोली, और NET संरचनाओं के स्पष्ट रूप से अलग क्षेत्रों एफ, ए, और एन, क्रमशः पत्र के साथ चिह्नित हैं.

चित्रा 3. 3 - रंग में एक Aspergillus संक्रमित Lys - EGFP जानवर के फेफड़ों टुकड़ा की उपस्थिति 2-photon माइक्रोस्कोपी एक Lys EGFP माउस के फेफड़ों टुकड़ा के साथ 7 घंटे पहले संक्रमितए fumigatus तैयार किया गया था और imaged के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित. दिखाया वायुकोशीय ऊतक के संयुक्त कवक संरचना और एसएचजी (नीला), सेल नाभिक और नेट (लाल) के Sytox संकेत, के रूप में अच्छी तरह के रूप में अच्छी तरह के रूप में कई neutrophils (हरा) है.

पूरक आंकड़ा 1. इंटुबैषेण के लिए माउस का निर्धारण. Ketamin / Rompun संज्ञाहरण के तहत जानवर अपने दाँत पर एक इलास्टिक बैंड के साथ तय हो गई है क्रम में करने के लिए एक 22G निबाह शिरापरक कैथेटर के साथ इंटुबैषेण की सुविधा है.

पूरक आंकड़ा 2. यांत्रिक माउस वेंटिलेशन. Intubated माउस एक 1x10 ⁷ 100 μl पीबीएस में resuspended spores के आवेदन के द्वारा संक्रमित है . फेफड़ों के अंदर कवक कणों के एक बढ़ाया वितरण यंत्रवत् एक छोटे जानवर श्वासयंत्र के साथ संक्रमित माउस ventilating द्वारा हासिल की है.

पूरक आंकड़ा 3. फेफड़े पालि निर्धारण सही फेफड़ों पालि की तैयारी के बाद अंग एक पेट्री डिश में एक प्रयोगशाला बनाया फ्लैट वॉशर है कि समानांतर नायलॉन के धागे का एक सेट द्वारा कवर किया जाता है के उपयोग के द्वारा निर्धारित है.

पूरक आंकड़ा 4. 2 फोटॉन इमेजिंग सेटअप सही फेफड़ों पालि युक्त पेट्री डिश 2-photon माइक्रोस्कोप के तहत डीएनए डाई Sytox ऑरेंज के अलावा के बाद एक हीटिंग चटाई पर स्थापित है.

पूरक फिल्म: पलायन और Aspergillus संक्रमित फेफड़ों में कवक तत्वों phagocytosing समय एक जीवित कवक के साथ संक्रमण के बाद फेफड़ों टुकड़ा 7 घंटे 2-photon माइक्रोस्कोपी चूक के द्वारा देखा के रूप में neutrophils neutrophils हरी, कवक तत्वों और एसएचजी नीले हैं, और सेल नाभिक के रूप में अच्छी तरह के रूप में. NET संरचनाओं लाल रंग में चित्रित कर रहे हैं. प्रयोग के वास्तविक समय निचले सही पर दिखाया गया है. पैमाने बार 50 सुक्ष्ममापी दर्शाया गया है. वीडियो देखने के लिए यहाँ क्लिक करें

Discussion

Vivo में बरकरार अंगों में या वास्तविक समय 2-photon माइक्रोस्कोपी पिछले 10 वर्षों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के शरीर क्रिया विज्ञान से निपटने के अध्ययन में गहरा महत्व प्राप्त है. यह इस तकनीक के साथ किया गया था कि लिम्फ नोड्स के भीतर टी सेल सक्रियण की गतिशीलता की तरह महत्वपूर्ण ^{घटनाओं} पहले 2-4 दिखाई हो गया. हाल ही में, शोधकर्ताओं ने यह भी effector कोशिकाओं के लसीका ऊतकों में इस ⁵ दृष्टिकोण का उपयोग पीढ़ी में पहला कदम की तरह विशिष्ट सेलुलर कार्यों का विश्लेषण शुरू कर दिया है.

हालांकि, हालांकि नए जैविक अवधारणाओं के एक नंबर इस पद्धति का उपयोग किया गया पता चला है, वहाँ अब भी कर रहे हैं चुनौतीपूर्ण और महत्वपूर्ण सवाल है जिसके लिए इस प्रकार अब तक कोई intravital दृश्य अध्ययन प्रकाशित किया गया है. उल्लेखनीय है इस स्तनधारी फेफड़ों पर लागू होता है है. इस अंग का दिलचस्प पहलू यह हवाई रोगजनकों के एक किस्म के लिए प्रवेश के बंदरगाह के रूप में, यह एक सबसे महत्वपूर्ण सतहों पर जो प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रक्रियाओं स्तनधारी शरीर में जगह ले बनाता है. पूरे जीवन काल पर हर साँस के साथ, अवांछित कणों कुछ साँस रहे हैं जिनमें ^से 6 संक्रमण धमकी जीवन को उत्पन्न करने की क्षमता है. यह आत्म व्याख्यात्मक है कि इस तरह के एक संवेदनशील और लुप्तप्राय साइट पर रक्षा तंत्र की एक तंग नेटवर्क के लिए उपस्थित होना प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का पूरे प्रदर्शनों की सूची प्रदर्शन की जरूरत है. दूसरी ओर यह बहुत महत्वपूर्ण है कि इस तरह के एक "गंदा" जगह पर संभावित रोगज़नक़ों के खिलाफ प्रेरित प्रतिरक्षाविज्ञानी लड़ाई कसकर नियंत्रित किया जाता है. प्रतिरक्षा प्रणाली की अतिरंजित प्रतिक्रिया unspecific प्रतिरक्षा सेल ^7,8 कार्रवाई की उत्तेजना पर व्यापक अंग के ऊतकों घायल करके अपने शरीर को नुकसान पहुँचाने का एक उच्च जोखिम सहन.

इन विचारों के प्रकाश में यह बहुत ही रोचक और उपयोगी स्तनधारी फेफड़ों में सच के तहत vivo परिस्थितियों में सेल व्यवहार की जांच करने की संभावना है होगा. हालांकि, इस तथ्य है कि एक ऐसी प्रणाली अब तक सफलतापूर्वक भारी कठिनाइयों है कि एक काम प्रोटोकॉल सेटिंग में हल किया जा करने के लिए स्पष्ट रूप से अंक लागू नहीं किया गया. सबसे अधिक मांग चुनौती शायद ध्यान केंद्रित स्थिरता है. साँस लेने के लिए जिम्मेदार अंग के रूप में फेफड़ों के अंतरिक्ष के सभी तीन दिशाओं में लगातार आंदोलन के तहत है साँस लेना एहसास. अकेले इस परिस्थिति गंभीर इमेजिंग समस्याओं का कारण बनता है और एक intravital imagers "दुःस्वप्न" माना जा सकता है. पहले से ही अंतरिक्ष में किसी भी आयाम करने के लिए एक मामूली प्रस्ताव सूक्ष्म देखने के लिए, जो सुक्ष्ममापी परिशुद्धता के साथ स्थिर हो ^क्रम में सार्थक छवियों उत्पन्न 9 की जरूरत पर एक बड़े पैमाने पर बिगड़ती प्रभाव पड़ता है. इसकी स्वाभाविक तंग स्थानीय ध्यान केंद्रित को ^{देखते हुए} 10, 2-photon माइक्रोस्कोपी भी अधिक फोकल instabilities के प्रति संवेदनशील है, Z दिशा में एक बस कुछ micrometers की श्रेणी में एक निश्चित संरचना के एक अव्यवस्था के रूप में ध्यान की एक पूरी नुकसान के बराबर है और इस प्रकार है एक असफल प्रयोग.

murine फेफड़ों के भीतर प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अवलोकन के लिए इस अध्ययन में प्रस्तुत प्रोटोकॉल अभी भी एक कार्यात्मक बरकरार फेफड़ों में ¹¹ की स्थिति के लिए नहीं है. vivo आवेदन, बल्कि एक करीबी सन्निकटन में एक इमेजिंग लिम्फोसाइटों के लिए पूर्व vivo दृष्टिकोण, explanted लिम्फ में उदा नोड्स, vivo में ¹² टिप्पणियों में सच के बराबर परिणाम दिखाया गया है और इस प्रकार अत्यधिक प्रासंगिक ^हैं 5 . फेफड़ों के स्लाइस, जो केवल हमारे दृष्टिकोण के साथ संभव हो रहे हैं में सीटू टिप्पणियों में, छांटना के बाद शीघ्र ही एक संक्रमित फेफड़ों में जगह ले लो. काटने की प्रक्रिया के दौरान 3D अखंडता agarose मैट्रिक्स, एक ठीक नियंत्रित फेफड़ों के काटने की प्रक्रिया की अनुमति के लिए एक आवश्यक कदम के द्वारा सुनिश्चित किया जाता है. हालांकि यह agarose मैट्रिक्स की एक solidification की अनुमति के लिए एक छोटी अवधि के लिए explanted फेफड़ों शांत करने के लिए आवश्यक है, यह संभव है निकट ऊतक के काटने और rewarming के बाद कोशिकाओं के लिए शारीरिक स्थितियों पर लौटने के लिए. यह स्पष्ट रूप से हमारे डेटा, जो दिखाना है कि इन शर्तों के तहत neutrophils अत्यधिक सक्रिय हैं और उनके चुस्त phagocytes है, जो एक Aspergillus fumigatus संक्रमण की प्रभावी निकासी के लिए आवश्यक हैं के रूप में पूरी क्षमता का प्रदर्शन द्वारा दिखाया गया है. वे फेफड़ों की उपकला बाधाओं के माध्यम से पारित करने में अलवियोली के भीतरी भागों तक पहुँचने के ऊतकों गश्ती और इसके अलावा वे सक्रिय रूप ले कवक spores 11. इस काम का एक महत्वपूर्ण खोज Aspergillus संक्रमित अंग में न्युट्रोफिल कोशिकी जाल (नेट) जैसी संरचनाओं की उपस्थिति थी. जाल ¹³ neutrophils में एक उपन्यास सुरक्षा तंत्र के एक बहुत हाल ही में पा रहे हैं. हालांकि, 2004 में अपनी प्रारंभिक वर्णन के बाद से, जहां इस घटना को देखा गया है या कमी पशु मॉडल या मनुष्यों में शारीरिक या रोग की स्थिति की संख्या विस्फोट ^किया गया है 14-16 बढ़ती. दिलचस्प है, हालांकि इतना काम इतने सारे अलग अलग समूहों द्वारा इन संरचनाओं पर खर्च किया गया है, ज्यादातर रिपोर्ट अभी भी एक बहुत विवरणात्मक स्तर पर कर रहे हैं और बहुत ज्यादा नहीं हैNET रिलीज के तंत्र और उसके विनियमन के बारे में जाना जाता है. हमारे प्रोटोकॉल के साथ हम पहले एक संक्रमित फेफड़ों में. NET फाइबर दिखाने के लिए सक्षम थे. इसके अलावा, हम हौसले भर्ती के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपने घटना ^या 11 निषेध के लिए neutrophils आणविक कवक संरचनाओं के महत्व को प्रदर्शित कर सकता है. यह स्पष्ट रूप से हमारे विधि की क्षमता NET गठन के और अधिक विस्तार में एक कदम की जांच से पता चलता है. एक सोच भी नहीं सकते हैं उदाहरण के लिए उपयुक्त बाहर दस्तक चूहों से neutrophils का उपयोग करने के लिए दत्तक हस्तांतरण प्रयोगों में NET गठन की अपनी क्षमता का पालन.

इस प्रकार, हालांकि परिधीय रक्त से न्युट्रोफिल आप्रवास के प्रत्यक्ष प्रेक्षण इस अंग explantation के बाद रक्त की आपूर्ति की कमी के कारण प्रणाली के साथ संभव नहीं है, हम अभी भी विश्वास है कि हमारे प्रोटोकॉल एक मूल्यवान और अपेक्षाकृत आसान संभाल करने के लिए दृष्टिकोण है कि के इमेजिंग की अनुमति देता है फेफड़ों के संक्रमण के खिलाफ प्रतिरक्षा रक्षा में जल्दी या देर से कदम. यह है, इसलिए रहते जानवरों की श्वास फेफड़ों के भीतर इस घटना की जांच की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है.