Biomolekulare Erkennung Einsatz der Interferometrische Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Summary

Quantitative, High-Throughput-, Echtzeit-und Label-free biomolekularen Erkennung (DNA, Proteine, etc.) auf SiO

Abstract

Die empfindliche Messung von biomolekularen Wechselwirkungen hat den Einsatz in vielen Bereichen und Branchen wie Grundlagen der Biologie und Mikrobiologie, Umwelt / Landwirtschaft / Biodefense Überwachung, Nanobiotechnologie und vieles mehr. Für diagnostische Anwendungen, Monitoring (Erfassung) das Vorhandensein, Fehlen oder abnormale Expression gezielt Proteomik oder genomischen Biomarkern in Patientenproben gefunden werden verwendet, um Behandlungsansätze oder Therapie Wirksamkeit zu bestimmen. In der Forschung arena, sind Informationen über molekulare Affinitäten und Spezifitäten für voll Charakterisierung der untersuchten Systeme nützlich.

Viele der aktuellen Systeme eingesetzt, um molekulare Konzentrationen oder Affinitäten zu bestimmen verlassen sich auf die Verwendung von Etiketten. Beispiele für diese Systeme umfassen Immunoassays wie die Enzyme Linked Immuno Assay (ELISA), Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Techniken,-Gel-Elektrophorese-Assays und Massenspektrometrie (MS). Im Allgemeinen sind diese Etiketten fluoreszierend, radiologischen oder kolorimetrischen in der Natur und sind direkt oder indirekt auf die molekulare Ziel von Interesse angebracht. Obwohl die Verwendung von Etiketten allgemein anerkannt und hat einige Vorteile, es gibt auch Nachteile, die Förderung der Entwicklung von neuen Label-freie Methoden zur Messung dieser Wechselwirkungen. Diese Nachteile gehören praktische Aspekte wie erhöhte Assay Kosten Reagenz Lebensdauer und Benutzerfreundlichkeit, die Lagerung und Sicherheit betrifft, verschwendet Zeit und Mühe bei der Etikettierung, und die Variabilität zwischen den verschiedenen Reagenzien aufgrund der Kennzeichnung Prozesse oder Etiketten selber. Auf einer wissenschaftlichen Grundlage, kann der Einsatz dieser Etiketten auch vorstellen Schwierigkeiten wie Bedenken mit Auswirkungen auf die Funktion des Proteins / Struktur durch die Anwesenheit des angeschlossenen Labels und die Unfähigkeit zur direkten Messung der Interaktionen in Echtzeit.

Präsentiert hier ist die Verwendung eines neuen Label-freien optischen Biosensor, dass zugänglich Studien Microarray ist, bezeichnet der interferometrischen Reflectance Imaging Sensor (IRIS), zum Nachweis von Proteinen, DNA, antigenen Materials, ganze Krankheitserreger (Virionen) und anderes biologisches Material. Die IRIS-System wurde gezeigt, dass eine hohe Empfindlichkeit, Präzision und Reproduzierbarkeit bei verschiedenen biomolekularen Wechselwirkungen [1-3] haben. Die Vorteile sind Multiplex-Imaging-Fähigkeit, Echtzeit-und Endpunkt Messmöglichkeiten und andere High-Throughput-Attribute wie reduzierte Reagenzienverbrauch und eine Reduktion der Untersuchungszeit Zeiten. Darüber hinaus ist die IRIS-Plattform einfach zu bedienen, erfordert kostengünstige Geräte und nutzt Silizium-basierten Festphasenassays Komponenten macht es kompatibel mit vielen zeitgenössischen Oberflächenchemie Ansätze.

Hier präsentieren wir die Verwendung des IRIS-Systems von der Vorbereitung der Sonden-Arrays zur Inkubation und Messung von Ziel-Bindung an der Analyse der Ergebnisse in einem Endpunkt-Format. Das Modell-System wird die Aufnahme des Ziels Antikörper, die spezifisch für humanes Serum Albumin (HSA) auf HSA-spotted Substrate sind.

Protocol

1. Untergrundvorbereitung

1. Coat geschichtete Silizium-SiO _2-Substraten mit Selbst-Adsorption Copoly (DMA-NAS-MAPS):
   1. Copolymer-Synthese, chemische Struktur und Coating-Verfahren sind publiziert in: G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, LE Depero. Charakterisierung eines polymeren Adsorbed Coating für DNA Microarray Slides Glas. Anal. Chem. 2004, 76, 1352-1358.
   2. Kurz gesagt, bereiten Polymerlösung durch Zugabe von 100 mg des Polymers zu 5 ml deionisiertem Wasser (DI) und mit 5 ml 40% gesättigtem Ammoniumsulfat ((NH ₄₎ 2 SO _4)-Lösung auf eine Endkonzentration von 0,92 M. zu erreichen
   3. Tauchen Sie Chips in-Lösung für 30 min auf einem Schüttler und dann gründlich mit VE-Wasser. Dry gründlich mit Argon / N _2-Gas.
   4. Bake-Chips bei 80 ° C für 15 min.
2. Shop-Polymer-beschichtete Substrate / Chips in einer trockenen Umgebung (Vakuumexsikkator) für bis zu 3 Monaten bis Sonde Spotting Verfahren.

2. Vorbereitung der Probe Array: Antikörper, Antigene, ss / dsDNA, RNA, etc.

1. Verdünnen Sie die Sonde (n) geeignete Konzentration in der gewünschten Puffer. Dieser Schritt kann erheblich variieren, aber ein typisches Experiment nutzt Antigen oder IgG in einer Konzentration von 0,5 mg / ml (Bereich von 0,1 -1 mg / mL) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei pH ≈ 7,4.
2. Place Lösungen in einer 96 - oder 384-Well-Platte (oder Standard-Source-Platte für den Spotter verwendet wird)
3. Setup-Spotting-Parameter für die gewünschte gedruckt Array: Bestimmung der geeigneten Spotting-Parameter für die Oberfläche und Lösungen verwendet wird (Verweilzeiten, Annäherungsgeschwindigkeiten, etc.). Bestimmen Sie die Anzahl der Wiederholungen der einzelnen Bedingung pro Raster, die Grid-Layout, die Anzahl der zu replizieren Gitter, und die gewünschte Spotting Lage auf dem Chip. Legen Substrate und Quelle Platte an den entsprechenden Stellen, stellen Sie sicher, Abfall-und Vorratsflaschen sind bereit, und dem Druck beginnen laufen.
4. Nach Spotting fertig ist Platz Substrate in einer Umgebung mit hoher Feuchtigkeit über Nacht (4-18 Stunden), damit Immobilisierung und Deaktivierung durchgeführt werden soll.
5. Wash Substrate: legen Sie sie in den folgenden Lösungen für die drei Minuten für drei separate Wäschen: PBS mit 0,1% Tween (PBST), PBS und schließlich deionisiertem Wasser (DI). Je nach der Art des Experiments (wet vs trocken), trocken der Chip gründlich mit Argon Gas und beginnen Inkubation oder den Chip in einer Flusskammer und zu montieren.
6. Deaktivieren verbleibenden NHS-Gruppen auf Copolymer Oberfläche durch Eintauchen der Chips in einem 50 mM Lösung von Ethanolamin mit dem pH-Wert eingestellt auf 7,4 für 30 Minuten, während auf einem Schüttler Platte. Ein primäres Amin-haltige Verbindung wie Hydroxylamin oder Tris können ebenfalls verwendet werden, solange die vorbereitete Lösung ist sicher, mit Proteinen verwendet werden. Spülen Sie die Deaktivierung Lösung mit PBS dann VE-Wasser.
7. Optional Schritt (abhängig von der Oberflächenchemie zu beschäftigt): Block Oberfläche mit einer Lösung von BSA, Casein oder rehydriert Milch für 30 Minuten. Für das laufende polymeren Oberflächen-Chemie, die wir verwenden, haben wir diesen Schritt nicht ausführen, wie das Polymerrückgrat wirkt, um nicht-spezifische Protein-Bindung zu verhindern.

3. Datenerfassung und-Incubation Vorgehensweise: Endpoint-Format

1. Machen Sie eine Lösung des Ziels von Interesse in der gewünschten Puffer. Hier wird es eine Lösung des entsprechenden Konzentration von Anti-BSA in PBS (: make 1-10 mL einer 10 ng / ml-Lösung von Anti-BSA in PBS ex) werden. Stellen Sie außerdem sicher, um eine äquivalente Menge an Puffer (ohne Ziel) für die negative Kontrolle Inkubationszeit haben.
2. Werfen Sie einen Silizium-Spiegel-Scan für die Normalisierung der alle nachfolgend erhobenen Daten.
3. Scan der vorbereiteten Probe Array mit dem IRIS-System vor der Inkubation Schritt, um die erste optische Höhe (Masse) an jedem Ort zu bestimmen. Dies wird für eine ordnungsgemäße Analyse von Veränderungen in der Masse auf der Oberfläche zu ermöglichen, dh der Grad der Bindung, nach der Inkubation. Hier werden einige Parameter für das laufende Experiment, wie Belichtungszeit, Sichtfeld, prosperierenden konzentrieren, etc. eingestellt werden
4. Tauchen Chip (s) in vorbereitete Lösung für 1 Stunde auf einem Schüttler Platte. Die Inkubationszeit kann variieren stark je nach dem Grad der Erregung, die Konzentration der Ziel erkannt, die Transporteigenschaften der Flusskammer (wenn eine Echtzeit-Erkennung-Modus verwendet wird), die Affinitäten der Target-Sonden-Paar, etc .
5. Nach der Inkubationszeit, wiederholen Sie den Waschvorgang in Schritt 2.5 beschrieben)
6. Scan der gleichen Sonde Array mit dem IRIS-System und erhalten nach der Inkubation Bilder für Vorinkubation Vergleich.
7. Wiederholen Sie diesen Vorgang für verschiedene Inkubationsschritte wenn nötig, zum Beispiel in einem Sandwich-Assay-Format, wo ein sekundärer Antikörper verwendet wird.

4. Data Analysis

1. Fit die gesammelten Bilder für jede IRIS-Scan (Reihenfolge der Intensität Bilder), mit dem Labor-entwickelten Software zur ProDuce ein Bild von der Sonde Array mit optischen Dicke Informationen. Eine schnelle qualitative Analyse der Bindung kann durch Subtraktion (eingetragene) Post-und Pre-Inkubation Bilder durchgeführt werden. Binding wird als eine Änderung in der Intensität an den Stellen, wo Masse Veränderungen beobachtet erscheinen. Für die quantitative Analyse ermitteln Massendichten jeder Stelle im Vergleich zum Hintergrund durch Mittelung optische Dicke Informationen für jedes Pixel in einem Spot-und einen Ring außerhalb des Ortes und machen einen direkten Vergleich dieser beiden Bereiche.

5. Repräsentative Ergebnisse:

Abbildung 1 zeigt ein Beispiel schematische Darstellung des geschichteten Si-SiO ₂ IRIS Substrat mit einem Vertreter Antikörper Array entdeckt. Jeder Antikörper Ensemble ist in replizieren mit Spezifität für ein anderes Epitop gezielt verschiedene Proteine ​​entdeckt. Zwei verschiedene ganze Viren und ein virales Protein als Beispiel Ziele vertreten. Negative Kontroll-Antikörper richten sich nach dem Test und kann nicht-spezifische und / oder Virus-spezifisch.

Abbildung 2 zeigt die Bindung von humanem Serum Albumin (HSA)-spezifische Antikörper gegen eine Reihe von spotted HSA und Kaninchen IgG (Kontrolle) Flecken. Wie hier zu sehen, nach der Montage und Bestimmung der optischen Dicken für die Pre-und Post-Inkubation Bilder, kann einen Unterschied Bild für die Bindung Array erstellt qualitativ beurteilen verbindlich. Die quantitative Analyse zeigt, dass ein 2,05 und 0,13 Nanometer mittlere optische Höhenänderung für die HSA und Kaninchen-IgG-Spots wurde beobachtet, die für eine Anti-HSA Inkubation Konzentration von 500 ng / mL.

Abbildung 3 zeigt ein IRIS Messung Fur Proteinbindung Abhängigkeit von Proteinkonzentration und dsDNA Oligomer Länge. Die obere Grafik zeigt absolute optische Höhenmessungen für die erste immobilisierten Oligomers Sonde Höhen-und Post-Inkubation Fur bindend. Steigende Konzentrationen von Pelz (50, 100, 200 nM) führte zu einer erhöhten Bindung an DNA-Sonden. Die Länge der Oligomere auch Auswirkungen Fur Bindung mit längeren Sequenzen was zu mehr bindend. Hier sind auf Fehler und Bars eine Standardabweichung vom Mittelwert. Die untere Kurve zeigt berechnet Fur-Protein-Dimer binden pro dsDNA Strang. Dimer-Bindung wurde deutlich bei einem Fur-Protein-Konzentration von 200 nM auf eine hohe Ebene der nicht-spezifische Bindung erhöht.

Abbildung 1. Schematische Darstellung eines Beispiels Sondenarray normalerweise in einem Experiment zur spezifischen Viren und viralen Komponenten in einem Multiplex-Mode mit dem IRIS-System erkannt werden.

Abbildung 2. Post-Inkubation Unterschied die Grafik für eine Bindung von humanen Serum-Albumin-spezifischen Antikörpern gegen gesichtet HSA mit diesem Label-free-System bei einer Konzentration von 500 ng / mL gesammelt. Das Biomaterial Massendichte für jeden Fleck wird durch Mittelung optische Dicke Informationen innerhalb einer Stelle und dann einen Vergleich mit dem Durchschnitt von einem Ring um den Ort, die den Hintergrund bestimmt.

Abbildung 3. Plot der Bindung von Daten für die Fur-Protein-Wechselwirkungen mit gefleckten doppelsträngige Oligomere mit einem bekannten Konsensus-Sequenz auf Oligomer Länge, Lage der Konsensus-Sequenz innerhalb des Oligomers und Fur-Protein-Konzentration. Informationen über die absolute Höhe der Fur-Protein gebunden, um jedes entdeckte Sequenz (oben) können verwendet werden, um die Zahl der Pelz-Dimere gebunden an jede Art von Oligomer (unten) zu schätzen.

Discussion

Die IRIS-Plattform ist eine einfache und schnelle System für das Sammeln High-Throughput-Bindung von Daten in einem Mikroarray-Format zu verwenden. Durch kovalent immobilisiert verschiedenen funktionalen Protein-oder DNA-Sonden auf einer Oberfläche, Zielantigene / Biomarker / etc. kann aus der Lösung aufgenommen werden, wie in einem Immunoassay. Die Messung dieser Interaktionen über Sonde Bedingungen in einem Endpunkt oder Echtzeit-Format mit der IRIS-System ermöglicht hochempfindliche und quantitative Informationen für jede Interaktion gesammelt werden. Der Vertreter Experiment detaillierte hier ist nur ein Beispiel für die Arten von Wechselwirkungen, die mit dieser Technik untersucht werden können. Detektion von Transkriptionsfaktoren, virale Antigene, und ganze Viren zuvor und zeigte stellt nur ein paar Beispiele für die Arten von Analysen, die IRIS leicht umgehen kann.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicon wafers with 500 nm of thermally-grown silicon dioxide	Silicon Valley Microelectronics
Ammonium sulfate powder	Sigma-Aldrich	A5132
Phosphate buffered saline (PBS) 10X ready concentrate	Fisher Scientific	BP665-1
Antibody to human serum albumin (Anti-HSA)	Sigma-Aldrich	A0433
Human serum albumin (HSA)	Sigma-Aldrich	A9511
Argon or nitrogen gas (ultra-high purity)	Airgas	AR UHP300 or NI UHP300
Petri dishes, 60 mm x 15 mm	Fisher Scientific	0875713A
Scienceware® vacuum desiccator	Sigma-Aldrich	Z119016
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-120
96-well plates, low cell binding	Nalge Nunc international	145399
BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer	Bio-Rad
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	398136
Hydroxylamine	Thermo Fisher Scientific, Inc.	26103
Multi-purpose rotator, model # 2314	Thermo Fisher Scientific, Inc.	2314Q
Retiga 2000R camera	QImaging	01-RET-2000R-F-M-12
AcuLED illumination source	PerkinElmer, Inc.
Optical components (lenses, objectives, apertures, rails, posts, etc.)	Thorlabs Inc.