Summary
Quantitativa, high-throughput in tempo reale, e l'etichetta-libero di rilevamento biomolecolare (DNA, proteine, ecc) su SiO
Abstract
La misura sensibile delle interazioni biomolecolari ha un uso in molti campi e settori come la biologia e microbiologia di base, monitoraggio ambientale / agricolo / biodifesa, nanobiotecnologie e altro ancora. Per applicazioni diagnostiche, monitoraggio (rilevazione) la presenza, assenza, o l'espressione anormale di mirati biomarcatori proteomici o genomiche trovati nei campioni dei pazienti può essere utilizzato per determinare un approccio di trattamento o di efficacia della terapia. Nel campo di ricerca, informazioni sulle affinità molecolare e specificità sono utili per caratterizzare completamente i sistemi oggetto di indagine.
Molti degli attuali sistemi utilizzati per determinare le concentrazioni molecolari o affinità contare sull'utilizzo di etichette. Esempi di questi sistemi includono saggi immunologici, come l'enzima-test immunoenzimatico (ELISA), reazione a catena della polimerasi (PCR), saggi di elettroforesi su gel e spettrometria di massa (MS). Generalmente, queste etichette sono fluorescenti, radiologiche, o colorimetrica in natura e sono direttamente o indirettamente collegata al bersaglio molecolare di interesse. Sebbene l'uso di etichette è ampiamente accettato e ha alcuni vantaggi, non ci sono inconvenienti che sono stimolando lo sviluppo di nuovi senza etichetta metodi per misurare queste interazioni. Questi svantaggi includono aspetti pratici come il costo del test un aumento, Reattivo vita e le preoccupazioni usabilità, storage e sicurezza, perdita di tempo e fatica per l'etichettatura, e la variabilità fra i diversi reagenti per i processi di etichettatura o etichette stesse. Su una base di ricerca scientifica, l'uso di queste etichette possono anche introdurre tali difficoltà per quanto riguarda gli effetti sulla funzionalità delle proteine / struttura per la presenza delle etichette allegate e l'incapacità di misurare direttamente le interazioni in tempo reale.
Qui presentata è l'uso di una nuova etichetta senza biosensore ottico che è suscettibile di microarray studi, definito il sensore interferometrico Imaging riflettanza (IRIS), per rilevare le proteine, DNA, materiale antigenico, patogeni intero (virioni) e altro materiale biologico. Il sistema IRIS ha dimostrato di avere sensibilità, precisione e riproducibilità delle interazioni biomolecolari diversi [1-3]. I vantaggi includono la capacità di imaging multiplex, in tempo reale e funzionalità di misura degli endpoint, e altri prodotti high-throughput attributi quali il consumo di reagente ridotti e una riduzione dei tempi di analisi. Inoltre, la piattaforma IRIS è semplice da usare, richiede attrezzature poco costose, e utilizza a base di silicone solido componenti saggio fase che lo rende compatibile con gli approcci superficiali molti contemporanea chimica.
Qui, vi presentiamo l'utilizzo del sistema IRIS dalla preparazione degli array sonda incubazione e la misurazione di obiettivo vincolante per l'analisi dei risultati in un formato endpoint. Il sistema modello sarà la cattura di anticorpi bersaglio che sono specifici per albumina sierica umana (HSA) su HSA-macchiato substrati.
Protocol
1. Preparazione del substrato
- Cappotto a strati di silicio SiO 2 supporti con auto-adsorbente copolimeri (DMA-NAS-MAPS):
- Sintesi di copolimero, struttura chimica e processo di rivestimento sono pubblicati in: G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, LE Depero. Caratterizzazione di rivestimento in polimero adsorbito per DNA vetrini microarray. Anale. Chem. 2004, 76, 1352-1358.
- In breve, preparare la soluzione di polimeri con l'aggiunta di 100 mg di polimero a 5 ml di acqua deionizzata (DI) acqua e aggiungere 5 ml di solfato di ammonio al 40% saturi ((NH 4) 2SO 4) la soluzione per raggiungere una concentrazione finale di 0,92 M.
- Chip Immergere in soluzione per 30 minuti su un agitatore e poi sciacquare abbondantemente con acqua deionizzata. Asciugare accuratamente con Argon / N 2 gas.
- Chip Cuocere in forno a 80 ° C per 15 min.
- Conservare con rivestimento polimerico substrati / chip in un ambiente asciutto (essiccatore a vuoto) per un massimo di 3 mesi fino alla sonda spotting procedura.
2. Preparazione di Array Sonda: anticorpi, antigeni, ss / dsDNA, RNA, ecc
- Diluire sonda (s) a concentrazione adeguata nel buffer desiderato. Questa fase può essere variare notevolmente, ma un tipico esperimento utilizza antigene o IgG ad una concentrazione di 0,5 mg / ml (range da 0,1 -1 mg / mL) in tampone fosfato (PBS) a pH ≈ 7.4.
- Luogo soluzioni in un 96 - o 384-pozzetti (o la targa fonte standard per la spotter in uso)
- Impostazione parametri per spotting desiderato serie stampato: determinare i parametri appropriati spotting per la superficie e le soluzioni in uso (tempi di sosta, velocità di avvicinamento, ecc.) Determinare il numero di repliche di ogni condizione per griglia, il layout della griglia, il numero di griglie di replicare, e la posizione desiderata spotting sul chip. Substrati luogo e la piastra fonte nelle posizioni appropriate, verificare che le bottiglie dei rifiuti e la fornitura sono pronti, e iniziare a eseguire la stampa.
- Dopo spotting è finito substrati svolge in un ambiente di elevata umidità durante la notte (4-18 ore) per consentire processo di immobilizzazione e la disattivazione di procedere.
- Lavare substrati: metterli in le seguenti soluzioni per tre minuti per tre lavaggi separati: PBS con 0,1% Tween (PBST), PBS e infine deionizzata (DI). A seconda del tipo di esperimento (umido rispetto a secco), il chip asciugare accuratamente con gas Argon e iniziare l'incubazione o posto il chip in una camera di flusso e assemblare.
- Disattivare rimanenti gruppi NHS sulla superficie copolimero immergendo i chip in una soluzione 50 mM di etanolamina con il pH regolato a 7,4 per 30 minuti, mentre su un piatto shaker. Un primario ammina composto contenente come idrossilammina o Tris può anche essere usato, purché la soluzione preparata è sicuro da usare con le proteine. Sciacquare la soluzione di disattivazione utilizzando PBS poi acqua deionizzata.
- Passaggio facoltativo (a seconda della chimica di superficie è occupata): superficie di blocco utilizzando una soluzione di BSA, caseina, o latte reidratato per 30 minuti. Per la chimica attuale superficie polimerica che usiamo, non eseguire questo passaggio come la spina dorsale polimero atti a prevenire le non-specifico legame con le proteine.
3. Acquisizione Dati e incubazione Procedura: formato Endpoint
- Ottenere una soluzione del target di interesse nel buffer desiderato. Qui, sarà una soluzione della concentrazione appropriata di anti-BSA in PBS (es: fare ML 1-10 di 10 ng / mL di soluzione di Anti-BSA in PBS). Inoltre, assicurarsi di avere una quantità equivalente di tampone (senza obiettivo) per l'incubazione di controllo negativo.
- Prendete una scansione specchio di silicio per la normalizzazione di tutti i dati successivamente raccolti.
- Scansione dell'array preparato sonda con il sistema IRIS prima della fase di incubazione per determinare l'altezza iniziale ottico (massa) ad ogni punto. Ciò consentirà di un'adeguata analisi delle variazioni di massa sulla superficie, ossia il livello di legame, dopo l'incubazione. Qui, alcuni parametri saranno modificate per l'esperimento in corso, come il tempo di esposizione, campo di vista, concentrandosi prospera, ecc
- Immergere chip (s) in soluzione preparata per 1 ora su un piatto shaker. Il tempo di incubazione può variare notevolmente a seconda del livello di agitazione, la concentrazione del target di essere rilevato, le caratteristiche di trasporto della camera di flusso (se in tempo reale la modalità di rilevazione viene utilizzato), le affinità del target-sonda di coppia, ecc .
- Dopo l'incubazione, ripetere la procedura di lavaggio descritta al punto 2.5)
- Scansione dello stesso array sonda utilizzando il sistema IRIS e ottenere post-incubazione delle immagini per la pre-incubazione confronto.
- Ripetere questo processo per le fasi di incubazione diverso se necessario, ad esempio in un formato saggio a sandwich in cui un anticorpo secondario viene utilizzato.
4. Analisi dei dati
- Montare le immagini raccolte per ogni scansione IRIS (sequenza di immagini di intensità), utilizzando il laboratorio sviluppato un software di proprodurre un'immagine della serie sonda contenente informazioni ottiche spessore. Una rapida analisi qualitativa del legame può essere effettuata sottraendo (registrati) post e pre-incubazione delle immagini. Vincolanti apparirà come un cambiamento di intensità in quei punti in cui sono state osservate variazioni di massa. Per l'analisi quantitativa, determinare la densità di massa di ciascun punto rispetto al fondo facendo la media informazioni ottiche spessore per ogni pixel all'interno di un luogo e un anello al di fuori del posto e facendo un confronto diretto di queste due aree.
5. Rappresentante dei risultati:
La Figura 1 mostra uno schema esempio di strati Si-SiO 2 substrato IRIS macchiato con una vasta rappresentanza degli anticorpi. Ogni ensemble anticorpo è macchiato di replicare con specificità per un epitopo diverso targeting proteine diverse. Due virus diversi intero e una proteina virale sono rappresentati come bersagli esempio. Anticorpi di controllo negativo dipende dal dosaggio e può essere non-specifici e / o virus-specifici.
La Figura 2 mostra il legame di albumina sierica umana (HSA)-anticorpi specifici per una serie di gattuccio HSA e IgG di coniglio (controllo) punti. Come si vede qui, dopo il montaggio e la determinazione delle ottico spessori per le immagini pre-e post-incubazione, un'immagine differenza per l'array legame può essere creato per valutare qualitativamente vincolanti. L'analisi quantitativa rivela che un 2,05 e 0,13 nanometri variazione media altezza ottica è stata osservata per la HSA e il coniglio IgG punti, rispettivamente, per un anti-HSA incubazione concentrazione di 500 ng / ml.
La figura 3 mostra una misurazione IRIS di dipendenza Fur legame con le proteine sulla concentrazione delle proteine e la lunghezza oligomeri dsDNA. Il grafico in alto mostra in assoluto le misure di altezza ottica per altezze oligomero iniziale immobilizzato sonda e post-incubazione vincolante Fur. Concentrazioni crescenti di Fur (50, 100, 200 nM) ha determinato un aumento vincolante per sonde di DNA. La lunghezza del oligomeri impatti anche vincolante pelliccia con sequenze più lunghe con conseguente più vincolanti. Qui, le barre di errore rappresentano una deviazione standard dalla media. Il diagramma in basso mostra calcolato dimero proteine Fur vincolante per ogni filza dsDNA. Dimero vincolante era significativamente aumentata ad una concentrazione di proteine Fur di 200 Nm suggerendo un alto livello di legame non specifico.
Figura 1. Schematica di un array sonda esempio normalmente usato in un esperimento per rilevare virus e componenti specifici virale in modo multiplex con il sistema IRIS.
Figura 2. Post-incubazione immagine differenza per il legame di albumina sierica umana anticorpi specifici per macchiato HSA raccolti con questo sistema privo di etichetta ad una concentrazione di 500 ng / mL. La densità di massa biomateriale per ogni spot è determinata calcolando la media dello spessore informazioni ottiche all'interno di un punto e poi confrontandola con la media di un anello intorno al punto che rappresenta lo sfondo.
Figura 3. Terreno di associazione dati per le interazioni proteina con pelliccia maculata doppio filamento oligomeri con una sequenza consenso noto in base alla lunghezza oligomero, la posizione della sequenza di consenso all'interno della oligomero, e concentrazione di proteine Fur. Informazioni circa la quantità assoluta di proteine Fur legato a ogni sequenza macchiato (in alto) possono essere usati per stimare il numero di dimeri Fur legato a ogni tipo di oligomeri (in basso).
Discussion
La piattaforma IRIS è un sistema semplice e veloce da utilizzare per la raccolta di associazione dati ad alta velocità in un formato microarray. Da covalentemente immobilizzare diverse sonde funzionali proteine o di DNA su una superficie, gli antigeni target / biomarcatori / etc. possono essere catturati da una soluzione, come in un immunodosaggio. Misurazione di queste interazioni tra condizioni sonda in un endpoint o in tempo reale in formato con il sistema IRIS permette di informazioni altamente sensibili e quantitativi da raccogliere per ogni interazione. L'esperimento rappresentante disponibili a questo link è solo un esempio dei tipi di interazioni che possono essere studiati con questa tecnica. Rilevazione dei fattori di trascrizione, antigeni virali e virus intero è stato dimostrato in precedenza e rappresenta solo alcuni esempi dei tipi di analisi che il IRIS può facilmente gestire.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Zoiray Technologies Inc., una co-sponsor e partner di commercializzazione, per il suo sostegno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafers with 500 nm of thermally-grown silicon dioxide | Silicon Valley Microelectronics | ||
| Ammonium sulfate powder | Sigma-Aldrich | A5132 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 10X ready concentrate | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Antibody to human serum albumin (Anti-HSA) | Sigma-Aldrich | A0433 | |
| Human serum albumin (HSA) | Sigma-Aldrich | A9511 | |
| Argon or nitrogen gas (ultra-high purity) | Airgas | AR UHP300 or NI UHP300 | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Scienceware® vacuum desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 96-well plates, low cell binding | Nalge Nunc international | 145399 | |
| BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer | Bio-Rad | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | 398136 | |
| Hydroxylamine | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 26103 | |
| Multi-purpose rotator, model # 2314 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2314Q | |
| Retiga 2000R camera | QImaging | 01-RET-2000R-F-M-12 | |
| AcuLED illumination source | PerkinElmer, Inc. | ||
| Optical components (lenses, objectives, apertures, rails, posts, etc.) | Thorlabs Inc. |
References
- Özkumur, E., Needham, J. W., Bergstein, D. A., Gonzalez, R., Cabodi, M., Gershoni, J. M., Goldberg, B. B., Ünlö, M. S. Label-free and dynamic detection of biomolecular interactions for high-throughput microarray applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7988-7992 (2008).
- Özkumur, E., Ahn, S., Yalcin, A., Lopez, C. A., Cevik, E., Irani, R. J., DeLisi, C., Chiari, M., Ünlö, M. S. Label-free microarray imaging for direct detection of DNA hybridization and single-nucleotide mismatches. Biosensors and Bioelectronics. 25, 1789-1795 (2010).
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- Lopez, C. A., Daaboul, G. G., Vedula, R. S., Özkumur, E., Bergstein, D. A., Geisbert, T. W., Fawcett, H. E., Goldberg, B. B., Connor, J. H., Ünlö, M. S. Label-free multiplexed virus detection using spectral reflectance imaging. Biosensors and Bioelectronics. , (2011).
